王波，張楊楊，謝愷舟*，劉建宇，劉亞楠，高強(qiáng)，郭輝生，張跟喜，戴國俊，王金玉

(1.揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225009；2.江蘇省動物遺傳繁育與分子設(shè)計重點(diǎn)實驗室，江蘇揚(yáng)州225009)

氨芐西林在雞排泄物中的殘留消除規(guī)律

王波1.2，張楊楊1.2，謝愷舟1.2*，劉建宇1.2，劉亞楠1.2，高強(qiáng)1.2，郭輝生1.2，張跟喜1,2，戴國俊1,2，王金玉1,2

(1.揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225009；2.江蘇省動物遺傳繁育與分子設(shè)計重點(diǎn)實驗室，江蘇揚(yáng)州225009)

為了研究氨芐西林(AMP)在雞排泄物中殘留消除規(guī)律，將雞排泄物用乙腈去蛋白處理，再用飽和的二氯甲烷萃取后，在酸性條件下上清液用水楊醛沸水浴衍生化后，在激發(fā)波長354 nm、發(fā)射波長445 nm處用高效液相色譜熒光檢測器檢測。結(jié)果顯示：該方法測定雞排泄物中AMP的檢測限為1.2 μg/kg(S/N≥3)、定量限為3.5 μg/kg(S/N≥10)。AMP在雞排泄物樣品中平均回收率為74.96 % ～ 80.41 %，變異系數(shù)均低于9.77 %。試驗雞按體重以60.0、120.0 mg/(kg·d)劑量內(nèi)服AMP，每天給藥1 次，連續(xù)5 d。AMP在投藥第1 d時，雞排泄物中AMP殘留量被檢測到，投藥第5 d時達(dá)到峰值。休藥后AMP在雞排泄物中殘留量迅速降低。正常劑量組，休藥第7 d時，AMP在雞排泄物中殘留量低于檢測限。雙倍劑量組，在休藥第9 d時，雞排泄物中AMP殘留量低于檢測限。AMP在雞排泄物中的殘留量與給藥劑量呈正相關(guān)，雞排泄物中高含量AMP殘留存在較大的環(huán)境風(fēng)險。

氨芐西林；高效液相色譜熒光檢測法；殘留消除；雞排泄物

氨芐西林(Ampxicillin，AMP)，是半合成耐酸廣譜青霉素，不僅抗菌譜廣，而且殺菌能力強(qiáng)。因此，AMP被廣泛用于家禽養(yǎng)殖中。雖然雞的排泄物經(jīng)處理后可添加到動物飼料中作為很好的蛋白質(zhì)飼料來源，但養(yǎng)殖戶抗生素的濫用和休藥期不按規(guī)定執(zhí)行而導(dǎo)致抗生素在雞排泄物中殘留，隨著食物鏈的傳遞，最終對人類健康構(gòu)成威脅。我國農(nóng)業(yè)部與歐盟都有最高殘留限量(MRLs)規(guī)定，AMP在動物可食性組織中的MRLs為50 μg/kg[1-2]。

目前，國內(nèi)外研究AMP的殘留檢測方法雖有微生物法[3]、試管擴(kuò)散法[4]、HPLC法[5-7]、HPLC-MS/MS[8]等報道，但關(guān)于AMP在雞排泄物中的殘留消除規(guī)律研究尚未見報道。本試驗按體重分別以60.0、120.0 mg/(kg·d)劑量給京海黃雞每天內(nèi)服AMP 1 次，連續(xù)5 d，測定從投藥期到休藥期不同時間AMP在雞排泄物中的殘留量變化，研究雞排泄物中AMP的殘留消除規(guī)律，為AMP環(huán)境風(fēng)險的正確評估及雞排泄物中AMP去除技術(shù)研究，實現(xiàn)雞排泄物的循環(huán)再利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、主要試劑及配置 AMP標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：純度99.00%，德國Dr. Ehrenstorfer 贈送；獸用氨芐西林鈉粉劑：江蘇倍康藥業(yè)有限公司；水楊醛、三氯乙酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀和二氯甲烷：均為分析純；乙腈：色譜純，德國Merck有限公司；超純水(本實驗室自制)。

AMP標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取AMP適量置于10 mL棕色容量瓶中，用無菌超純水溶解并定容至刻度；即成0.5 mg/mL的AMP標(biāo)準(zhǔn)液，置于-35 ℃冰箱中密封保存。

1.2 主要儀器 高效液相色譜儀(帶兩臺515型高壓泵、配2475型熒光檢測器等，美國Waters公司)；高速冷凍離心機(jī)(D-37520型，德國Osterode am Harz公司)；漩渦混合器(G560E型，美國Scientific Industries公司)；分析天平(Ax205型，瑞士Mettler Toledo公司)；超純水制備儀(SMARTPURE，美國Thermo公司)等。

1.3 方法

1.3.1 供試動物處理及樣品采集 隨機(jī)選取90 只28 周齡京海黃雞產(chǎn)蛋雞，體重1.8±0.2 kg，分成3 組，分別為氨芐西林正常劑量組30只，給藥劑量60.0 mg/(kg·d)、氨芐西林雙倍劑量組30 只，給藥劑量120.0 mg/(kg·d)、空白對照組30只。給藥前分別稱重、編號、單籠飼養(yǎng)。前預(yù)期7 天，飼喂全價飼料(不含任何藥物)，自由采食、飲水。用無菌超純水先將氨芐西林鈉粉劑配成凈含量50 mg/mL的水溶液。各試驗組雞按上述劑量分別將藥物注入到雞嗉囊中，每天8∶30左右內(nèi)服給藥1 次，連續(xù)5 d，自給藥日起一直到停藥后15 d，每天17∶30左右采集各試驗組雞排泄物，在-80 ℃冰箱中保存待測。

1.3.2 樣品的提取、凈化與衍生化 準(zhǔn)確稱取 5 g雞排泄物勻漿液放入50 mL具塞離心管中，加入乙腈溶液10 mL，漩渦混勻振蕩2 min，以8000 × g的離心力在5 ℃條件下離心10 min。將上清液轉(zhuǎn)到另一只50 mL具塞離心管中，重復(fù)提取剩余的殘渣1 次，合并上清液后，加入20 mL飽和的二氯甲烷，漩渦混勻振蕩2 min，以6500 × g的離心力在10 ℃條件下離心10 min。轉(zhuǎn)移上層水相置于15 mL玻璃離心管中，用真空干燥器抽干，加入10 mL超純水振蕩溶解。從中取100 μL溶解后的溶液置于10 mL玻璃離心管中，再分別加入100 μL 15 %的三氯乙酸溶液、20 μL水楊醛后，漩渦混勻振蕩1.5 min，在沸水浴中進(jìn)行衍生化反應(yīng)1 h。將衍生化樣品取出冷卻至室溫后，轉(zhuǎn)移到2 mL離心管中，用500 μL 50 %乙腈溶液分兩次洗滌10 mL玻璃離心管，轉(zhuǎn)移并合并至2 mL離心管中，最后再用50 %乙腈溶液定容到2 mL。以20000 × g的離心力離心15 min，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，供HPLC測定。

1.3.3 色譜操作條件及參數(shù) 色譜柱：Athena C18，5 μm，250 mm × 4.6 mm， id；熒光檢測器：激發(fā)波長為354 nm，發(fā)射波長為445 nm；流動相：A 相0.01 moL/L磷酸二氫鉀溶液，用0.1 moL/L磷酸氫二鉀溶液調(diào)pH至5.5；B 相乙腈溶液，梯度洗脫程序見表1；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣體積：100 μL；柱溫：40 ℃。

表1 梯度洗脫程序

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 用空白基質(zhì)提取液將AMP標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋成濃度分別為3.5、12.5、62.5、125.0、250.0 μg/kg的AMP標(biāo)準(zhǔn)工作液。準(zhǔn)確吸取各濃度點(diǎn)AMP標(biāo)準(zhǔn)工作液100 μL，按衍生化步驟衍生，重復(fù)測定每個濃度點(diǎn)的AMP衍生化產(chǎn)物4 次，取色譜峰面積平均值繪制AMP濃度(C)- AMP色譜峰面積(A)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出AMP線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.3.5 添加回收率和精密度的測定 準(zhǔn)確稱取5.0 g勻漿的空白雞排泄物放入50 mL具塞離心管中，分別添加AMP低、中、高濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，使AMP在空白雞排泄物中含量依次為3.5、5.0、25、125 μg/kg，經(jīng)樣品提取、凈化和衍生化后，取100 μL進(jìn)樣，進(jìn)行HPLC檢測，計算添加回收率。按AMP藥物的濃度高低將回收率檢測后剩余的樣品分別混合成3份，在同1 天、同1 星期內(nèi)的不同時間，用同一臺HPLC分別重復(fù)測定低、中、高三種藥物濃度的樣品6 次，求得日內(nèi)、日間變異系數(shù)。

1.3.6 檢測限和定量限的測定 把一定質(zhì)量濃度的AMP標(biāo)準(zhǔn)溶液添加到空白基質(zhì)提取液中，經(jīng)1.3.2樣品的提取、凈化與衍生化后，取上清液用HPLC進(jìn)行分析測定，以樣品檢測時的信噪比大于等于3和10分別作為AMP檢測方法的檢測限和定量限。

1.3.7 AMP在雞排泄物中殘留量的分析測定 按照外標(biāo)定量的方法，把AMP在雞排泄物中測得的峰面積帶入AMP標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程(如果實測樣品的含量超過標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性濃度范圍，可以對樣品提取液和衍生化后溶液進(jìn)行稀釋后再測定)，即能得到雞排泄物中AMP的殘留量。

2 結(jié)果

2.1 色譜分離 由圖1顯示，在篩選好的最佳色譜條件下，測得雞排泄物中AMP的保留時間為15.3 min左右，色譜峰為基線分離峰且峰形較好，空白提取液在上述時間內(nèi)無干擾峰。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 以AMP的色譜峰面積(A)為橫坐標(biāo)、進(jìn)樣前AMP的質(zhì)量濃度(C，μg/kg)為縱坐標(biāo)作圖，得到AMP標(biāo)準(zhǔn)曲線。AMP在3.5 μg/kg～250.0 μg/kg線性范圍內(nèi)，其線性回歸方程為C= 0.0181 A-1.7605，相關(guān)系數(shù)r為0.9998。

2.3 樣品的添加回收率和精密度 由表2可知，當(dāng)AMP在空白雞排泄物樣品中添加水平分別為3.5、5.0、25.0、125.0 μg/kg時，雞排泄物樣品中AMP平均添加回收率為74.96 % ～ 80.41 %，變異系數(shù)均低于9.77 %。其日內(nèi)、日間變異系數(shù)分別均低于8.74 %、11.59 %。結(jié)果表明：該檢測方法可靠性、重復(fù)性均符合要求。

2.4 靈敏度 用本試驗建立的分析測定方法，測得AMP在雞排泄物中的檢測限為1.2 μg/kg(S/N≥3)、定量限為3.5 μg/kg(S/N≥10)，表明此方法的靈敏度能滿足AMP在雞排泄物中殘留檢測的要求。

2.5 雞排泄物中AMP殘留量的分析測定 AMP在雞排泄物中的殘留量測定結(jié)果及其消除曲線分別見表3、圖2。

A.空白雞排泄物；B.水楊醛；C.AMP(20.0 ng/mL)標(biāo)準(zhǔn)品D.添加AMP(25.0 μg/kg)標(biāo)準(zhǔn)品的空白雞排泄物；E. AMP給藥后的雞排泄物圖1 雞排泄物中AMP的HPLC圖

添加濃度/(μg·kg-1)回收率/%變異系數(shù)/%日內(nèi)變異系數(shù)/%日間變異系數(shù)/%3．574．96±4．616．157．3611．595．076．53±4．545．937．1911．2325．076．69±7．499．778．7410．56125．080．41±6．217．725．689．57

由表3、圖2可見，試驗組雞按體重分別以60.0、120.0 mg/(kg·d)劑量內(nèi)服給藥AMP，每天 1 次，連續(xù)5 d。投藥第1 d時，在雞排泄物中就能檢測到AMP殘留，第5 d時，AMP殘留量達(dá)峰值。正常劑量組在休藥第5 d時，雞排泄物中AMP殘留量低于檢測限；雙倍劑量組在休藥第7 d時，雞排泄物中AMP殘留量低于檢測限。雞排泄物中AMP的殘留量與給藥劑量的大小呈正相關(guān)。

表3 雞排泄物中AMP的殘留量

注：ND. 未檢測到，“-”未檢測

圖2 雞排泄物中AMP的殘留消除曲線

3 討論

3.1 檢測器的選擇與衍生條件的優(yōu)化 目前，氨芐西林(AMP)的HPLC檢測方法國內(nèi)外雖有不少報道[9-10]，但選擇的檢測器有紫外檢測器、熒光檢測器等。本試驗選擇熒光檢測器(Waters 2475型)進(jìn)行檢測，采用衍生化反應(yīng)使AMP的母體β-內(nèi)酰胺產(chǎn)生熒光發(fā)色基團(tuán)。通過鄰苯二甲醛、水楊醛、苯甲醛、甲醛等衍生化試劑進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，目標(biāo)物與水楊醛的衍生產(chǎn)物具有較高的靈敏度，所以本試驗選用水楊醛作為衍生試劑。AMP衍生化條件為：100 μL 15%三氯乙酸、水楊醛20 μL、100 ℃ 沸水浴1 h。

3.2 雞排泄物中AMP的殘留消除規(guī)律 試驗組雞按體重分別以60.0、120.0 mg/(kg·d)劑量內(nèi)服給藥AMP，每天1 次，連續(xù)5 d。試驗結(jié)果表明：在投藥第1 d時，AMP在雞排泄物中殘留量被檢測到，投藥第5 d時達(dá)到峰值。休藥后AMP在雞排泄物中殘留量迅速降低，AMP在雞排泄物中的半衰期較短。正常劑量組，休藥第7 d時，AMP在雞排泄物中殘留量低于檢測限。雙倍劑量組，在休藥第9 d時，AMP在雞排泄物中殘留量低于檢測限。雞排泄物中的AMP殘留量與給藥劑量的大小呈正相關(guān)，AMP在雞排泄物中高含量殘留存在較大的環(huán)境風(fēng)險。

[1] 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部．動物性食品中獸藥最高殘留限量[S].

[2] Commission Regulation (EU) No 37/2010 of 22 December 2009 on pharmacologically active substances and their classification regarding maximum residue limits in food stuffs of animal origin [Z].

[3] 李文平，闞鹿楓，馬浩．微生物法測定雞肉組織中的氨芐西林殘留[J]．中國獸藥雜志，2004，38(9)：20-22.

[4] 吳遐，紹輝，王鑫，等．試管擴(kuò)散法檢測牛乳中β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留研究[J]．東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2011，42(5)：31-35.

[5] Heeyong L，Jung S L，Hye S L．Simultaneous determination of ampicillin and metampicillin in biological fluids using high-performance liquid chromatography with column switching[J]．Journal of Chromatography B，1995，664：335-340.

[6] Valentina G，Guglielmo D. Liquid chromatography with fluorescence detection of amoxicillin and ampicillin in feeds using pre-column derivatization[J]．Analytica Chimica Acta，2003，483：69-72.

[7] Verdon E， Couedor P．Determination of ampicillin residues in milk by ion-pair reversed phase high performance liquid chromatography after precolumn derivatization[J]．Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，1996，14：1201-1207.

[8] Sun L R， Jia L F， Xie X，etal. Quantitative analysis of amoxicillin, its major metabolites and ampicillin in eggs by liquid chromatography combined with electrospray ionization tandem mass spectrometry [J].Food Chemistry，2016，192：313-318.

[9] Luo W H，Jr Catharina Y W，Harold C T．Rapid method for the determination of ampicillin residues in animal muscle tissues by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection[J]．Journal of Chromatography B，1997，694：401-407.

[10]Luo W H， Eugene B H，Jr Catharina Y W，etal. Simultaneous determination of amoxicillin and ampicillin in bovine milk by HPLC with fluorescence detection [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，1997，45：1264-1268.

(編輯：陳希)

Ampxicillin Residue Depletion in Chicken Excrement

WANG Bo1.2, ZHANG Yang-yang1.2, XIE Kai-zhou1.2*, LIU Jian-yu1.2, LIU Ya-nan1.2,GAO Qiang1.2, GUO Hui-sheng1.2, ZHANG Gen-xi1.2, DAI Guo-jun1.2, WANG Jing-yu1.2

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,YangzhouUniversity，Yangzhou225009,China； 2.KeyLaboratoryforAnimalGenetic，Breeding，ReproductionandMolecularDesignofJiangsuProvince,Yangzhou225009,China)

A study on Ampxicillin (AMP) residue depletion was conducted in chicken excrement. AMP was deproteinized from chicken excrement with acetonitrile, the analyte was extracted by saturated dichloromethane. The supernatant was reacted with salicylaldehyde under acidic and boiling conditions. Finally, AMP was determinated by high performance liquid chromatography (HPLC) with fluorescence detector. The excitation wavelength was set at 354 nm and emission wavelength was set at 445 nm. The average recovery in chicken excrement was 74.96 %～80.41 % with coefficients of variation (CV) lower than 9.77 %. The limit of detection (LOD) was 1.2 μg/kg(S/N ≥ 3)and the limit of quantitation (LOQ) was 3.5 μg/kg(S/N ≥ 10). After the chickens were orally administered successively AMP of 60.0 mg/kg and 120.0 mg/kg of body weight one time every day for 5 days, AMP residues in chicken excrements was detected at the first day, the maximum residues of AMP in chicken excrement were at the 5th day. Normal dose group, AMP residues in chicken excrement was lower than LOD at the 7th withdrawal day. Double dose group, AMP residues in chicken excrement was lower than LOD at the 9th withdrawal day. The residues of AMP in chicken excrement were all positively correlated with AMP orally administered doses. There are environmental risks with high residues of AMP in chicken excrement.

Ampxicillin；HPLC with fluorescence detection；residue depletion；chicken excrement.

國家肉雞產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(CARS-42-G23)；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項目(201410)；揚(yáng)州大學(xué)"新世紀(jì)人才工程"資助項目(201406)

王波，碩士，從事畜產(chǎn)品安全生產(chǎn)與環(huán)境控制的研究。

謝愷舟。E-mail：yzxkz168@163.com

2016-03-23

A

1002-1280 (2016) 06-0033-06

S859.84