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      RP-HPLC雙波長(zhǎng)法測(cè)定四味穿心蓮散中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量

      2016-02-07 09:04:08包愛(ài)情陸春波林仙軍陳曉林蔡文金金香蓮
      中國(guó)獸藥雜志 2016年6期
      關(guān)鍵詞:穿心蓮內(nèi)酯獸藥

      包愛(ài)情,陸春波,林仙軍,陳曉林,蔡文金,金香蓮

      (1.浙江省獸藥飼料監(jiān)察所,杭州311101;2.上藥凱侖醫(yī)藥股份有限公司,杭州310000)

      RP-HPLC雙波長(zhǎng)法測(cè)定四味穿心蓮散中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量

      包愛(ài)情1,陸春波1,林仙軍1,陳曉林1,蔡文金1,金香蓮2

      (1.浙江省獸藥飼料監(jiān)察所,杭州311101;2.上藥凱侖醫(yī)藥股份有限公司,杭州310000)

      建立了反向高效液相色譜法檢測(cè)四味穿心蓮散中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯含量的方法。試驗(yàn)采用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱( 4.6 mm × 250 mm,5 μm) ,以甲醇- 0.2%磷酸溶液梯度洗脫,流速為1.0 mL/min,柱溫30 ℃;穿心蓮內(nèi)酯檢測(cè)波長(zhǎng)226 nm,脫水穿心蓮內(nèi)酯檢測(cè)波長(zhǎng)252 nm;穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量測(cè)定范圍分別為2.32~37.14 μg/mL(r=1.0000),2.00~31.94 μg/mL(r=1.0000);加樣平均回收率分別為99.12%、98.84%;RSD分別為0.60%、0.62%;該方法方便、準(zhǔn)確、可靠,適用于測(cè)定四味穿心蓮散中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量。

      四味穿心蓮散;高效液相法;穿心蓮內(nèi)酯;脫水穿心蓮內(nèi)酯;

      四味穿心蓮散是以穿心蓮、辣蓼、大青葉、葫蘆茶四味藥材加工制成的中獸藥散劑,具有清熱解毒,除濕化滯的功效,用于瀉痢,積滯等。方中穿心蓮清熱解毒、消腫止痛,為君藥;葫蘆茶清熱解暑、消積利濕、殺蟲(chóng),辣蓼祛濕止瀉、散瘀止痛、祛風(fēng)殺蟲(chóng),共為佐使藥。諸藥合用,共奏清熱解毒、除濕化滯之功[1]。穿心蓮,又名春蓮秋柳,一見(jiàn)喜,欖核蓮、苦膽草、金香草、金耳鉤、印度草,苦草等。其中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯為穿心蓮的有效成份,具有祛熱解毒,消炎止痛之功效。穿心蓮內(nèi)酯更是對(duì)細(xì)菌性與病毒性上呼吸道感染及痢疾有特殊療效,被譽(yù)為天然抗生素藥物[2-3]?!吨腥A人民共和國(guó)獸藥典》二○一○版二部(收載了四味穿心蓮散,對(duì)穿心蓮進(jìn)行了薄層鑒別,未對(duì)其進(jìn)行定量分析[4]。本文采用反向高效液相色譜法對(duì)四味穿心蓮散中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯含量測(cè)定進(jìn)行了研究。

      1 材料

      1.1 儀器 Waters 2695高效液相色譜儀,配Waters 2996二極管陣列檢測(cè)器,美國(guó)Waters公司; XS-205電子天平,瑞士METTLER TOLEDO公司;KQ-500E型超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司。

      1.2 試劑與材料 甲醇為色譜純,Merck 公司,其余試劑均為分析純;實(shí)驗(yàn)用水為milli-Q 超純水。穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品(來(lái)源:中國(guó)食品藥品檢定檢驗(yàn)院,批號(hào):110797-201108,含量:98.7%);脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品(來(lái)源:中國(guó)食品藥品檢定檢驗(yàn)院,批號(hào):110854-201308,含量:99.7%)。四味穿心蓮散供試品(批號(hào)分別為20150901,20150902,20150903),由浙江A廠生產(chǎn);四味穿心蓮散供試品(批號(hào)分別為20160101,20160102,20160103),由浙江B廠生產(chǎn);四味穿心蓮散供試品(批號(hào)為20131001D),由河北C廠生產(chǎn)。自制樣品:中藥飲片購(gòu)于上藥凱侖醫(yī)藥股份有限公司,經(jīng)浙江省獸藥飼料監(jiān)察所鑒定,按相應(yīng)處方自制。

      2 方法與結(jié)果

      表1 梯度洗脫表

      2.2 溶液的制備

      2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取穿心蓮內(nèi)酯11.76 mg和脫水穿心蓮對(duì)照品10.01 mg,分別置100 mL容量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻。分別精密量取20 mL上述溶液于同一50 ml容量瓶,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,作為混合對(duì)照品貯備液。精密量取混合對(duì)照品貯備液6.0 mL,置10 mL量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,即為混合對(duì)照品溶液。

      2.2.2 供試品溶液 取四味穿心蓮散1 g,精密稱定,置100 mL具塞錐形瓶中,精密加40%甲醇25 mL,超聲提取(功率250 W,頻率50 kHz)30 min,過(guò)濾,取續(xù)濾液,作為供試品溶液。

      2.2.3 陰性對(duì)照溶液 按處方比例自配不含穿心蓮的散劑,按其工藝制成陰性對(duì)照樣品,再按2.2.2項(xiàng)方法制備成陰性對(duì)照溶液。

      2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 分別取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液注入液相色譜儀,進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描,記錄穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的光譜圖(圖1~圖2);同時(shí)記錄混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液的色譜圖(圖3~圖8)。該色譜條件下,穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯分離度良好,與其他峰分離良好,理論塔板數(shù)均大于6000。陰性樣品在混合對(duì)照品色譜圖相應(yīng)的位置上無(wú)吸收峰,表明處方中的其他成分對(duì)測(cè)定結(jié)果并無(wú)干擾,滿足定量檢測(cè)需要。峰1為穿心蓮內(nèi)酯,峰2為脫水穿心蓮內(nèi)酯。

      圖1 穿心蓮內(nèi)酯光譜圖

      圖2 脫水穿心蓮內(nèi)酯光譜圖

      圖3 混合對(duì)照品226 nm色譜圖

      圖4 混合對(duì)照品252 nm色譜圖

      圖5 自制陽(yáng)性樣品226 nm色譜圖

      圖6 自制陽(yáng)性樣品252 nm色譜圖

      圖7 自制陰性樣品226 nm波長(zhǎng)色譜圖

      圖8 自制陰性樣品252 nm色譜圖

      2.4 方法學(xué)考察

      2.4.1 線性范圍 精密量取穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯混合對(duì)照品貯備溶液(46.4、39.9 μg/mL)各0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL分別置10 mL容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,按上述色譜條件,精密量取10 μL,記錄色譜圖,測(cè)定峰面積,以峰面積積分值(Y)對(duì)濃度(X,μg/mL)進(jìn)行線性回歸計(jì)算,方程為:

      穿心蓮內(nèi)酯:Y=41467.11X+1698.00

      (r=1.0000),線性范圍2.32~37.14 μg/mL;

      韓世玉等[6-11]研究表明,桑樹(shù)葉片生長(zhǎng)受桑樹(shù)種類或品種的影響;黃麗玲等[12-13]研究表明,桑樹(shù)葉片生長(zhǎng)受氣候條件的影響;許楠等[14-21]研究表明,桑樹(shù)葉片生長(zhǎng)受施肥水平等栽培管理水平的影響。桑樹(shù)新梢與葉片的生長(zhǎng)發(fā)育動(dòng)態(tài)除受品種等內(nèi)部因素的影響外,還受氣候、土壤和栽培管理等外部因素影響。在生產(chǎn)中前一年要加強(qiáng)水肥管理,使樹(shù)體貯備足夠的養(yǎng)分,滿足次年新梢生長(zhǎng)和葉片生長(zhǎng)發(fā)育的養(yǎng)分需求。同時(shí)在新梢和葉片生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期加強(qiáng)水肥管理,為其提供良好的營(yíng)養(yǎng)條件。因此,在試驗(yàn)區(qū)條件下,合理施用催芽肥對(duì)促進(jìn)桑樹(shù)新梢和葉片生長(zhǎng)有著重要的作用。

      脫水穿心蓮內(nèi)酯:Y=33757.20X+8960.78

      (r=1.0000),線性范圍2.00~31.94 μg/mL。

      2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL,按上述色譜條件,連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次,記錄峰面積,計(jì)算結(jié)果,穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯峰面積的RSD分別為0.32%,0.42%。

      2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液(自制樣品),分別在0、1、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣10 μL,記錄色譜峰面積,計(jì)算穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的峰面積的RSD分別為0.54%、0.78%。結(jié)果表明供試品溶液在室溫下放置24 h穩(wěn)定。

      2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批供試品(自制樣品),分別稱取6份,照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,測(cè)定供試品溶液中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量。結(jié)果測(cè)得穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量分別為515.3、514.5、515.7、521.0、517.7、516.8 μg/g;脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量分別為339.2、341.8、345.2、345.5、338.3、343.9 μg/g;RSD分別為0.45%、0.24%。結(jié)果表明此方法重復(fù)性良好。2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取已知含量的四味穿心蓮散樣品(自制樣品) 0.5 g,共6份,置100 mL具塞錐形瓶中,精密加25 mL對(duì)照品溶液(稱取穿心蓮內(nèi)酯25.23 mg和脫水穿心蓮內(nèi)酯17.21 mg于同一100 mL容量瓶,甲醇溶解并稀釋至刻度,再精密量取10 mL于250 mL容量瓶中,用40%甲醇稀釋并定容到刻度),其余按2.2.2項(xiàng)同法處理后,測(cè)定并結(jié)算回收率,結(jié)果見(jiàn)表2。

      表2 四味穿心蓮散回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

      2.5 樣品測(cè)定 取不同批號(hào)的四味穿心蓮散,按2.2.2項(xiàng)下方法處理,按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算樣品中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量,結(jié)果見(jiàn)表3。

      表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果(μg/g) n=3

      3 討論與小結(jié)

      3.1 波長(zhǎng)的優(yōu)化 在波長(zhǎng)選擇上,通過(guò)二極管陣列檢測(cè)器(PDA)在200~400 nm進(jìn)行了全掃描,結(jié)果顯示穿心蓮內(nèi)酯在226 nm的波長(zhǎng)處有最大吸收,脫水穿心蓮內(nèi)酯在252 nm的波長(zhǎng)處有最大吸收波長(zhǎng),因此本文采用雙波長(zhǎng)法,使兩者均有最大吸收。

      3.2 提取方式的優(yōu)化 在提取方式選擇上,比較了浸漬、超聲和回流的提取效果,研究表明浸漬的提取效果略低于超聲與回流,而超聲與回流效果相當(dāng),但超聲操作比回流便捷,因此本文采取超聲作為提取方式。

      3.3 提取溶劑的優(yōu)化 在提取溶劑的選擇上,比較了20%甲醇,40%甲醇和60%甲醇的提取效果,研究表明當(dāng)提取溶劑為20%甲醇時(shí),提取效率顯著低于40%甲醇和60%甲醇;當(dāng)提取溶劑為60%甲醇時(shí),提取效果與40%甲醇無(wú)顯著差異,但雜質(zhì)干擾嚴(yán)重,表明以60%甲醇提取時(shí)會(huì)將散劑中的一些其他成分提取出來(lái)而增加干擾,因此選用40%甲醇作為提取溶劑。

      3.4 提取時(shí)間的優(yōu)化 在提取時(shí)間的選擇上,比較了15、30、45 min的提取效果,研究表明15min的提取效果顯著低于30、45 min,45 min的提取效果與30 min相當(dāng),因此本文選用30 min的提取時(shí)間。

      本文參考文獻(xiàn)[5-6]選用不同的比例的甲醇-水,甲醇-0.2%磷酸為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫,結(jié)果表明,選用當(dāng)前試驗(yàn)的流動(dòng)相時(shí),樣品中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯分離效果好、無(wú)雜峰干擾且時(shí)間短。已報(bào)道的關(guān)于四味穿心蓮散成分含量測(cè)定的只有汪艷秋[7]等人開(kāi)發(fā)的HPLC法測(cè)定四味穿心蓮散中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量。本文開(kāi)發(fā)的方法所需時(shí)間大大縮短,單針時(shí)間從45 min減少為20 min,檢測(cè)效率大幅提高,更節(jié)省溶劑同時(shí)減少對(duì)環(huán)境的污染,尤其適用于大批量檢測(cè),且本文對(duì)自制陽(yáng)性樣品以及多個(gè)廠家樣品進(jìn)行了測(cè)定,通過(guò)數(shù)據(jù)的比較反映出不同廠家樣品的區(qū)別。

      當(dāng)前,我國(guó)中獸藥散劑多數(shù)采取顯微鑒別及薄層鑒別控制處方中各味藥材,未對(duì)中藥成分進(jìn)行定量測(cè)定。中藥材由于產(chǎn)地、氣候等因素的影響,差異往往很大,如本文中七批企業(yè)樣品,含量差異很大,究其原因,很可能是因?yàn)樗幉漠a(chǎn)地、氣候等因素的影響,但也不能排除個(gè)別企業(yè)不按照處方進(jìn)行制備。因此探索對(duì)中獸藥散劑中各味中藥的有效成分進(jìn)行的定量分析研究,有利于提高中獸藥散劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的控制,進(jìn)一步提高產(chǎn)品質(zhì)量。本文開(kāi)發(fā)的方法,操作簡(jiǎn)便快捷,方法可行可靠,可為制定四味穿心蓮散質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

      [1] 中國(guó)獸藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)獸藥典二○一○年版二部[S].[2] Jiun-Han C,George H, An-Rong L,etal.Andrographolide suppresses endothelial cell apoptosis via activation of phosphatidyl inositol-3-kinase/Akt pathway [J]. Biochemical pharmacology, 2004,67(7): 1337-1345.

      [3] Yi-Feng X,Bu-Qing Y, Yi-Dan L,etal. Andrographolide attenuates inflammation by inhibition of NF-kappa B activation through covalent modification of reduced cysteine 62 of p50 [J]. Journal of immunology, 2004,173(6): 4207-4217.

      [4] 中國(guó)獸藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)獸藥典獸藥使用指南二○一○年版中藥卷[S].

      [5] 反任睿 , 張園園. 反向高效液相色譜法測(cè)定喉舒寧片中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量[J]. 中南藥學(xué), 2011, 9(4): 271-273.

      [6] 馬冬云 , 姜文艷. 雙波長(zhǎng) HPLC 法同時(shí)測(cè)定止痢寧片中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量[J]. 中國(guó)藥師, 2012, 15(4): 497-499.

      [7] 汪艷秋, 樓步青, 汪芳, 等. 獸用中成藥四味穿心蓮散質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高研究[J],中國(guó)獸醫(yī)醫(yī)藥雜志, 2013, 6: 37-40.

      (編輯:侯向輝)

      Determination of Andrographolide and Dehydroandrographolide in Siwei Chuanxinlian San by Dual-wavelength RP-HPLC

      BAQ Ai-qing1, LU Chun-bo1, LIN Xian-jun1, CHEN Xiao-lin1,CAI Wen-jin1,JIN Xiang-lian2

      (1.ZhejiangProvinceInstituteofVeterinaryDrugandFeedstuff,Hangzhou311101,China;2.ShangyaoKailunPharmaceuticalCoLtd,Hangzhou31000,China)

      To establish a RP- HPLC method for determination of andrographolide and ehydroandrographolide in Siwei Chuanxinlian San,analysis was performed on a C18 column ( 250 mm × 4.6 mm,5 μm) with a gradient elution mode of methanol-0.2% phosphoric acid at a flow rate of 1.0 mL/min and a column temperature of 30 ℃. The determination wave length of andrographolide was 226 nm while dehydroandrographolide was 252 nm. The linear range was 2.32~37.14 μg /mL(r=1.0000) and 2.00~31.94μg /mL (r=1.0000), and the average recovery was 99.12% and 98.84% withRSDof 0.60% and 0.62%, respectively.This method was convenient, accurate and reliable for the determination of andrographolide anddehydroandrographolide in Siwei Chuanxinlian San.

      Siwei Chuanxinlian San; HPLC; andrographolide; dehydroandrographolide

      包愛(ài)情,碩士,從事獸藥檢測(cè)工作。E-mail:baoaiqing@126.com

      2016-04-07

      A

      1002-1280 (2016) 06-0056-05

      S859.2

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