嚴鳳，李丹妮，吳劍平，周哲，張鑫，潘娟，張婧

(1.上海市獸藥飼料檢測所，上海 201103；2.賽默飛世爾科技(中國),上海 201206)

超高效液相色譜-四級桿-靜電場軌道肼高分辨質(zhì)譜篩查測定飼料中19種磺胺類藥物

嚴鳳1，李丹妮1，吳劍平1，周哲2，張鑫1，潘娟1，張婧1

(1.上海市獸藥飼料檢測所，上海 201103；2.賽默飛世爾科技(中國),上海 201206)

建立了超高效液相色譜-四級桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用( UPLC-Q-Exactive Orbitrap) 快速篩查和確證定量飼料中19種磺胺類藥物的分析方法。飼料樣品經(jīng)乙腈-0.1%甲酸溶液(80:20,V/V)超聲提取，Agilent SB C18色譜柱(100 mm×3.0 mm,1.8 μm)分離,以0.1%(V/V)甲酸乙腈溶液和0.1%(V/V)甲酸水溶液為流動相進行梯度洗脫。靜電場軌道阱全掃描得到磺胺類藥物的一級精確質(zhì)量數(shù)與理論精確相對分子質(zhì)量對比，相對質(zhì)量偏差在0.006×10-6～1.252×10-6之間，有效去除了基質(zhì)干擾，實現(xiàn)對飼料中磺胺類藥物的快速篩查；同時建立了19種磺胺類藥物的二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫,實現(xiàn)對19種磺胺類藥物的定性篩查及同步定量。19種磺胺類藥物在0.1～200 μg/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好r>0.99，方法檢測限為50 μg/kg，回收率在59.61%～106.45%之間。

磺胺類；飼料；超高效液相色譜；四級桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜

磺胺類藥物( Sulfonamides，SAs) 是人工合成的具有對氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的一類抗菌藥物的總稱，廣泛應用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)[1]。飼料添加是該類藥物在畜牧業(yè)中的主要用藥方式,隨著SAs的濫用，細菌耐藥性問題日益突出，這不僅會影響畜禽的正常生長發(fā)育,而且還會造成畜產(chǎn)品中藥物殘留超標,危害人體健康,影響環(huán)境衛(wèi)生和生態(tài)平衡。針對磺胺類藥物的檢測手段多樣化，如采用免疫分析法[2]、HPLC法[3-4]以及液質(zhì)聯(lián)用方法[5-6]。這些方法在靶向目標定性、定量檢測方面有極為廣泛的應用，但是這種模式也存在無法獲取樣品中非靶目標結(jié)構(gòu)信息的局限[7]，為實現(xiàn)高通量篩查的多組分物質(zhì)，基于高分辨質(zhì)譜技術(shù)的全掃描的質(zhì)譜分析方法逐漸進入研究者們的視野[8-9]。本實驗利用高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜快速檢測飼料中添加的19種磺胺類藥物，采用正離子全掃描模式進行測定，通過提取的二級質(zhì)譜進行定性，提取一級質(zhì)譜的精確相對分子質(zhì)量進行定量。該方法用實際添加實驗進行驗證，在較低質(zhì)量濃度添加水平條件下仍可以保證良好的檢測結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Q-Exactive四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜，配有H-ESI Ⅱ源(美國Thermo Fisher Scientific公司);Ultimate 3000液相色譜系統(tǒng)(美國Thermo Fisher Scientific公司);TraceFinder 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國Thermo Fisher Scientific公司);AE240 電子天平( 瑞士Mettler 公司) ; Allegra X-22R 高速冷凍離心機( 德國Beckman 公司) ; 多管旋渦振蕩器( 北京Targin 公司) ; Milli-Q 超純水系統(tǒng)( 美國Millipore 公司)。

乙腈(色譜純，美國Merck 公司) ; 甲酸( 色譜純，美國Tedia 公司) ;實驗用水為超純水(Milli-Q 自制) 。

標準品：苯甲?；前?純度99.8%)，磺胺醋酰(純度99.5%)，磺胺喹噁啉(純度98.0%)，磺胺氯噠嗪(純度99.8%)，磺胺嘧啶(純度99.0%)，磺胺間二甲氧嘧啶(純度99.0%)，磺胺鄰二甲氧嘧啶(純度98.0%)，磺胺甲基嘧啶(純度99.2%)，磺胺對甲氧嘧啶(純度98.0%)，磺胺二甲嘧啶(純度99.0%)，磺胺甲噻二唑(純度98.5%)，磺胺甲基異惡唑(純度99.0%)，磺胺甲氧噠嗪(純度99.2%)，磺胺間甲氧嘧啶(純度98.0%)，磺胺二甲惡唑(純度98.0%)，磺胺苯吡唑(純度99.0%)，磺胺吡啶(純度99.0%)，磺胺噻唑(純度99.5%)，磺胺二甲異嘧啶(純度98.0%)，以上均購自德國Dr. Ehrenstorfer GmbH。

標準貯備液配制：分別精密稱取19種磺胺類標準品10 mg，用甲醇溶解稀釋并定容至10 mL，濃度各為1 mg/mL。

混合標準工作液配制：分別取各標準貯備液500 μL，于同一10 mL容量瓶中，并定容，混合標準中間液濃度為50 μg/mL。

混合標準工作曲線配制：取適量混合標準工作液用0.1%甲酸溶液稀釋為濃度0.1、1、10、100、200 μg/L的系列混合標準工作曲線。

1.2 儀器條件

1.2.1 液相色譜條件 色譜柱: Agilent SB C18柱(3.0 mm×100 mm，1.8 μm)， 流動相A 為0.1% 甲酸水溶液，B 為含0.1%甲酸的乙腈溶液; 梯度洗脫程序: 0～15 min，5%～95% B；15～17 min，95% B；17～17.5 min，95%～5% B；17.5～21 min，5% B；流速0.3 mL/min；柱溫30 ℃; 進樣量10 μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件 可加熱的電噴霧離子源(HESI-Ⅱ)；離子傳輸管溫度325 ℃；毛細管電壓3200 V(正離子模式)；氣化溫度350 ℃；鞘氣壓(N2)40 arb；輔助氣壓(N2)10 arb；一級質(zhì)譜駐留時間100 ms；二級質(zhì)譜駐留時間50 ms；一級全掃描范圍：m/z100～1200；分辨率(R)：70000；掃描模式：Fullscan+ddms2(一級全掃描+自動觸發(fā)二級質(zhì)譜掃描)，碰撞裂解氣為高純氮氣，碰撞能量為20、40、60 eV。

1.2.3 樣品前處理 稱取飼料2.00 g，加入10 mL乙腈-0.1%甲酸溶液(80:20，V/V)，混勻，超聲提取10 min，8500 r/min離心5 min，取上清液0.1 mL與0.9 mL 0.1%甲酸溶液混勻，12000 r/min高速離心5 min，取上清液待測。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性范圍 本方法線性范圍為0.1～200 μg/L，線性相關(guān)良好，相關(guān)系數(shù)r均大于0.99，線性結(jié)果見表1。

表1 磺胺類藥物線性方程及相關(guān)系數(shù)表

2.2 回收率與精密度 采用空白飼料進行添加回收率試驗，添加濃度為50、100、10000 μg/kg，每個濃度做6個平行，處理方法按1.2.3項進行，用相近濃度的空白基質(zhì)添加標準單點對樣品進行定量，結(jié)果見表2。19種磺胺類藥物的平均回收率為59.61%～106.45%，相對標準偏差為0.40%～35.94%，實際測得精確分子量與理論精確分子量的差值均<2 mDa。

表2 回收率、精密度與質(zhì)量偏差

續(xù)表

續(xù)表

2.3 檢測限與定量限 按照檢測限信噪比S/N(Peak to Peak)>3，定量限信噪比S/N(Peak to Peak)>10的要求，本方法檢測限為50 μg/kg，定量限為100 μg/kg(表3)?？瞻讏D譜、檢測限圖譜和定量限圖譜見圖1、圖2和圖3。

表3 檢測限與定量限表

圖1 空白飼料提取離子色譜圖

圖2 空白飼料添加50 μg/kg檢測限提取離子色譜圖(A: 苯甲?；前稡: 磺胺醋酰 C: 磺胺氯噠嗪 D: 磺胺嘧啶E: 磺胺間二甲氧嘧啶F: 磺胺鄰二甲氧嘧啶G: 磺胺甲基嘧啶H: 磺胺對甲氧嘧啶 I: 磺胺二甲嘧啶J: 磺胺甲噻二唑K: 磺胺甲基異惡唑L: 磺胺甲氧噠嗪M: 磺胺間甲氧嘧啶 N: 磺胺苯吡唑O: 磺胺吡啶P: 磺胺喹噁啉Q: 磺胺噻唑R: 磺胺二甲惡唑S: 磺胺二甲異嘧啶)

2.4 實際樣品篩查 隨機抽取11份飼料樣品，用已優(yōu)化的色譜-質(zhì)譜條件和前處理方法進行篩查分析，采集一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)及二級碎片信息，進行譜庫檢索，根據(jù)保留時間、碎片離子和質(zhì)量誤差等信息確證并同時定量。結(jié)果表明，隨機抽取的11份樣品中檢出1份樣品含有磺胺間甲氧嘧啶，一級母離子精確質(zhì)量偏差為0.028×10-6，含量為311.85 μg/kg，篩查結(jié)果見圖4。

3 討論與小結(jié)

3.1 色譜柱的選擇 本實驗比較了Thermo Hypersil GOLD C18(150 mm×2.1 mm,1.9 μm)與Agilent SB C18(100 mm × 2.1 mm，1. 8 μm)兩款色譜柱。實驗表明，雖然兩款色譜柱對磺胺類藥物的檢測靈敏度及藥物峰形均無明顯差異，但在分離度方面Agilent SB C18柱的表現(xiàn)更優(yōu)于Thermo Hypersil GOLD C18柱，尤其是分離同分異構(gòu)體磺胺甲氧噠嗪和磺胺對甲氧嘧啶。Thermo Hypersil GOLD C18柱無法將這兩個同分異構(gòu)體分離，但Agilent SB C18柱就能很好的分離開。

圖3 空白飼料添加100 μg/kg定量限提取離子色譜圖(A-S代表物質(zhì)與圖2相同)

圖4 飼料樣品中檢出磺胺間甲氧嘧啶的篩查結(jié)果圖(A：母離子精確質(zhì)量提取色譜圖；B：母離子同位素精確質(zhì)量質(zhì)譜圖；C：碎片離子精確質(zhì)量質(zhì)譜圖)

3.2 提取溶劑比較 磺胺類藥物都屬于弱堿性藥物，本方法選用酸性水溶液與有機溶劑不同的比例組合作為提取溶劑進行比較，6種提取溶劑分別為乙腈-0.1%甲酸溶液(80+20)、乙腈-0.2%甲酸溶液(95+5)、甲醇-0.1 mol/L鹽酸溶液(50+50)、乙腈-0.1 mol/L鹽酸溶液(50+50)、純乙腈和純甲醇。實驗結(jié)果表明，大部分藥物用乙腈-0.1%甲酸溶液(80+20)提取效果最好、乙腈-0.2%甲酸溶液(95+5)和純甲醇的提取效果相對弱些，純乙腈的提取效果最差回收率約30%，因此本方法選用乙腈-0.1%甲酸溶液(80+20)作為提取溶劑。

3.3 濾膜比較 考察了不同品牌、不同材質(zhì)的濾膜對磺胺類藥物的吸附影響。選用了進口的Millipore Millex-GN尼龍、PALL-GHP和國產(chǎn)的PTFE、尼龍、聚醚砜材質(zhì)濾膜進行比較，實驗表明國產(chǎn)的PTFE對大部分磺胺類藥物影響較小，但對磺胺甲氧噠嗪影響較大，過濾后損失50%。其余濾膜對不同的藥物均會有一定的影響，所以本實驗最終未使用濾膜過濾。

目前，高分辨質(zhì)譜在飼料中藥物的篩查應用主要是以液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜為主[10]，而液相色譜-四級桿-靜電場軌道肼質(zhì)譜的應用則更多在蛋白質(zhì)組學、代謝組學研究[11]和食品安全[12]等方面，在國內(nèi)飼料領(lǐng)域的應用甚少。本方法用四級桿-靜電場軌道肼質(zhì)譜建立飼料中藥物篩查方法，也是該技術(shù)在飼料領(lǐng)域應用的初探。

本文建立了飼料中19 種磺胺類藥物的超高效液相色譜-四級桿-靜電場軌道肼質(zhì)譜篩查與確證方法。飼料所含成分復雜，因此采用高選擇性、高準確性的分析手段是檢測方法建立的關(guān)鍵。本法通過母離子精確分子質(zhì)量、二級質(zhì)譜碎片的精確分子量和液相色譜保留時間信息，達到對化學物質(zhì)準確定性，可快速、準確地對飼料中磺胺類藥物同時進行定性及定量檢測。

[1] 吳永寧，邵兵，沈建忠.獸藥殘留檢測與監(jiān)控技術(shù)[M].北京:化學工業(yè)出版社，2007: 189.

[2] 趙書景.賀紹君.羅國琦，等.動物性食品中磺胺類藥物殘留檢測方法的研究進展[J].中國畜牧獸醫(yī),2009,36(8):60-63.

[3] GB/T 19542-2007.飼料中磺胺類藥物的測定—高效液相色譜法[S].

[4] 陳吉之.閆超.飼料中9種磺胺類藥物的HPLC法快速分離與檢測中國醫(yī)藥工業(yè)雜志[J].2015, 46(8):892-894.

[5] 陳文慧.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定飼料中九種磺胺類藥物的殘留量[J].分析試驗室，2010,29(9):52-56.

[6] 羅輝泰.黃曉蘭.吳惠勤，等.分散固相萃取/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定飼料中87種藥物殘留[J].分析測試學報,2015,34(9):979-985.

[7] 熊岑.李苑雯.鄭彥婕，等.靜電場軌道阱質(zhì)譜分析技術(shù)在食品分析中的應用進展[J].食品科學，2015, 36(13):283-287.

[8] 姚鳳花.馮永巍.高效液相色譜串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜法快速檢測飼料中多種β-受體激動劑[J].食與飼料工業(yè)，2013,1：62-64.

[9] 貢松松.顧欣.曹慧，等.超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜法快速篩查生鮮牛乳中的14 種磺胺類藥物[J].分析測試學報,2014，33(12)：1342-1348.

[10]吳寧鵬.班付國.彭麗，等.超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜法篩查飼料中11種鎮(zhèn)靜劑類藥物[J].質(zhì)譜學報,2012,33(2)：94-98,117.

[11]李明.馬家辰.李紅梅，等.靜電場軌道阱質(zhì)譜的進展[J].質(zhì)譜學報，2013,34(3)：185-192.

[12]熊岑.李苑雯.鄭彥婕，等.靜電場軌道阱質(zhì)譜分析技術(shù)在食品分析中的應用進展[J].食品科學，2015,36(13)：283-287.

(編輯：侯向輝)

Screening and Confirmation of 19 Sulfonamides in Feed by Ultra High Performance Liquid Chromatography-quadrupole-exactive Orbitrap Mass Spectrometry

YAN Feng1, LI Dan-ni1,WU Jian-pin1,ZHOU Zhe2, ZHANG Xin1, PAN Juan1,ZHANG Jing1

(1.ShanghaiMunicipalSupervisoryInstituteVeterinaryDrugsandFeedstaff，Shanghai201103，China;2.ThermofisherScientific(China),Shanghai201206，China)

An ultra high performance liquid chromatography- quadrupole-exactive orbitrap mass spectrometry method( UPLC-Q-Exactive Orbitrap) was developed for rapid screening，confirmation and quantitative of 19 sulfonamides in feed. The samples were extracted with acetonitrile-0.1% aqueous formic acid solution (80∶20,V/V), and the extracts were then separated on an Agilent SB C18 (50 mm×3.0 mm, 1.8 μm) using a binary solvent system composed of 0.1% formic acid acetonitrile solution and 0.1% aqueous formic acid solution by gradient elution. The relative molecular masses of the target compounds were obtained in full scan mode with a relative deviation in the range of 0.006×10-6～1.252×10-6compared to the theoretical value, indicating effective elimination of the matrix interference. Tandem mass spectrometric database based on characteristic fragment ions for the 19 sulfonamides was built. This method allowed qualitative screening and quantitative analysis at the same time. Calibration curve was linear between 0.1 and 200 μg/L, with the correlation coefficientr>0.99.The limit of detection was 50 μg/kg. The recovery in feed was from 59.61% to 106.45%.

sulfonamides；feed；ultra high performance liquid chromatography (UPLC); quadrupole-exactive orbitrap

嚴鳳，畜牧師，從事獸藥殘留分析工作。E-mail:yan508@163.com

2015-11-25

A

1002-1280 (2016) 02-0029-08

S859.83