朱良全, 孫曄，，李聰研，蔣卉，彭小薇，陳祥，丁家波*

(1.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2.北京中海生物科技有限公司，北京 100081；3.江蘇省人獸共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州 225009)

仔豬副傷寒活疫苗生產(chǎn)用菌株生長(zhǎng)曲線的建立及合成培養(yǎng)基初步應(yīng)用

朱良全1, 孫曄1，2，李聰研2，蔣卉1，彭小薇1，陳祥3*，丁家波1*

(1.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2.北京中海生物科技有限公司，北京 100081；3.江蘇省人獸共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州 225009)

建立了仔豬副傷寒活疫苗生產(chǎn)用菌株生長(zhǎng)曲線，獲取菌株培養(yǎng)參數(shù)，從而實(shí)現(xiàn)合成培養(yǎng)基初步應(yīng)用。將豬霍亂沙門氏菌(CVCC79500株)運(yùn)用試管和三角瓶分別靜置和振蕩培養(yǎng)30 h，期間取4、8、12、18、24、30 h等6個(gè)點(diǎn)進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)并建立生長(zhǎng)曲線，確定37 ℃靜置培養(yǎng)18～24 h，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)8～24 h為培養(yǎng)穩(wěn)定期。不同接菌量比較結(jié)果表明，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h均可達(dá)到菌體穩(wěn)定期。在穩(wěn)定期參數(shù)條件下，比較合成培養(yǎng)基與常規(guī)普通肉湯培養(yǎng)基對(duì)該菌的增殖效果，結(jié)果表明，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h,試管及三角瓶培養(yǎng)菌數(shù)分別為27×108～31×108、33×108～41×108CFU/mL；37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，試管及三角瓶培養(yǎng)菌數(shù)分別為58×108～66×108、78×108～88×108CFU/mL。而同條件3批普通肉湯培養(yǎng)菌數(shù)均低于合成培養(yǎng)基，且批次間穩(wěn)定性較合成培養(yǎng)基差。將合成培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)12 h的菌液接種小鼠均10/10存活；免疫后攻毒家兔達(dá)4/5～5/5保護(hù)，與普通肉湯基本一致。合成培養(yǎng)基保存期試驗(yàn)表明，25 ℃避光保存28 d與當(dāng)天配制的液體合成培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)菌數(shù)基本一致。獲取的培養(yǎng)參數(shù)適合用于合成培養(yǎng)基的初步評(píng)價(jià)，研制的合成培養(yǎng)基培養(yǎng)菌數(shù)優(yōu)于普通肉湯，且不影響菌體安全性及免疫原性，室溫保存期可達(dá)28 d。

仔豬副傷寒活疫苗生產(chǎn)用菌株；培養(yǎng)參數(shù)；合成培養(yǎng)基

接種仔豬副傷寒活疫苗(C500株)是預(yù)防和控制豬霍亂沙門氏菌病的有效途徑[1-2]。但制苗用菌液生產(chǎn)一直采用的是普通肉湯，其主要成分牛肉湯易受動(dòng)物的種類、年齡、肉源的新鮮度及消化程度的影響，造成疫苗批次間的質(zhì)量不穩(wěn)定[3-4]。而合成培養(yǎng)基由于其成分相對(duì)確定且質(zhì)量穩(wěn)定，是解決培養(yǎng)批次間穩(wěn)定性差的關(guān)鍵，并逐漸成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[4]。不過，如何實(shí)現(xiàn)大量合成培養(yǎng)基的篩選研制是廣大科研工作者面臨的難題。通過建立仔豬副傷寒活疫苗生產(chǎn)用菌株生長(zhǎng)曲線，了解該菌株的生長(zhǎng)規(guī)律，選擇其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期或穩(wěn)定期的培養(yǎng)參數(shù)和培養(yǎng)菌數(shù)作為參考，通過在同培養(yǎng)條件下，篩選較高培養(yǎng)菌數(shù)的培養(yǎng)基是實(shí)現(xiàn)合成培養(yǎng)基研制的重要途徑之一[5]。

對(duì)于小型實(shí)驗(yàn)室和獸用生物制品企業(yè)，試管和三角瓶是日常最常用的培養(yǎng)器具。而靜置培養(yǎng)和振蕩培養(yǎng)，因其操作簡(jiǎn)便、需要儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，廣泛用于生產(chǎn)用種子液制備及科學(xué)研究中大規(guī)模發(fā)酵工藝生產(chǎn)的前期小試。一直以來，我國(guó)現(xiàn)行獸用生物制品規(guī)程(2000版)(以下簡(jiǎn)稱《規(guī)程》[3])雖規(guī)定仔豬副傷寒制苗用生產(chǎn)種子采用37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，但缺少完整的培養(yǎng)參數(shù)。而對(duì)于三角瓶振蕩培養(yǎng)(也稱搖瓶發(fā)酵培養(yǎng))，因其體積小，培養(yǎng)基需求量小，模擬了發(fā)酵培養(yǎng)的換氣頻率和溶氧環(huán)境，雖已廣泛用于實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)基篩選、大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)前的小試，但對(duì)于仔豬副傷寒活疫苗生產(chǎn)用菌株的培養(yǎng)參數(shù)的幾無報(bào)道，這為日常菌液培養(yǎng)凍干、基因組及質(zhì)料提取、新型合成培養(yǎng)基篩選研究帶來困難。本研究運(yùn)用試管及三角瓶進(jìn)行豬霍亂沙門氏菌(CVCC79500株)系統(tǒng)的靜置和振蕩培養(yǎng)試驗(yàn)，確定了該菌的生長(zhǎng)曲線，通過選擇菌數(shù)穩(wěn)定期的培養(yǎng)參數(shù)條件，從而實(shí)現(xiàn)在同條件下對(duì)研制的合成培養(yǎng)基進(jìn)行初步應(yīng)用評(píng)價(jià)，為開展細(xì)菌合成培養(yǎng)基的研究提供經(jīng)驗(yàn)方法和借鑒思路。

1 材料

1.1 菌種 生產(chǎn)用菌種為豬霍亂沙門氏菌(CVCC79500株)(2006.8.29凍干，0.3 mL/支)；檢驗(yàn)用菌種為豬霍亂沙門氏菌(CVCC79102株)(2006.8.29凍干，0.3 mL/支)，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保管和供應(yīng)。

1.2 試劑及耗材 仔豬副傷寒活疫苗合成培養(yǎng)基(批號(hào)為200701、200702、200703)，由北京中海生物科技有限公司配制及提供。其主要成分：胰酪蛋白胨(批號(hào)VM732731-644)， 購自MERCK公司；酵母浸粉(批號(hào)911948)購自O(shè)XOID公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈉、葡萄糖等均為分析純化學(xué)試劑，購自北京化學(xué)試劑公司。

普通肉湯(批號(hào)為20070130、20070115、20070122及20070205)， 由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察培養(yǎng)基組配制和供應(yīng)。

A 型試管，規(guī)格：25 mL；三角瓶，規(guī)格：500 mL, 由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察培養(yǎng)基組購自北京化工玻璃廠。

1.3 儀器 37 ℃恒溫培養(yǎng)箱及HZL-250恒溫雙層振蕩培養(yǎng)箱，江蘇太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠。

1.4 動(dòng)物 小鼠：ICR系，30～35日齡、體重18～22 g，清潔級(jí)；大耳白兔：體重1.5～2.0 kg，普通級(jí)；由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物組采購并提供。

2 方法

2.1 種子液制備 按《規(guī)程》[3]方法進(jìn)行。

2.2 生長(zhǎng)曲線的建立

2.2.1 靜置培養(yǎng) 將普通肉湯分別分裝于6支25 mL A型試管(分裝10 mL/管)和1瓶500 mL三角瓶(分裝200 mL/瓶)，按2%接入種子液，37 ℃靜置培養(yǎng)30 h，期間分別于4、8、12、18、24、30 h取出1管樣品及從三角瓶中取樣5 mL，按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》[6]方法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

2.2.2 振蕩培養(yǎng) 普通肉湯按2.2.1項(xiàng)方法分裝，按2%接入種子液，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)30 h，期間分別于4、8、12、18、24、30 h取出1管樣品及從三角瓶中取樣5 mL，按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》[6]方法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

2.2.3 不同接種菌數(shù)的比較研究 種子液按《規(guī)程》[3]制備500 mL，以3500 r/min離心20 min，棄上清，菌泥用60 mL的滅菌生理鹽水懸浮，然后分別稀釋成每4 mL含20×108、40×108、80×108、160×108、320×108CFU活菌。

將普通肉湯按200 mL/瓶分裝10瓶500 mL三角瓶，2%接入種子液(每瓶4 mL)，接入菌數(shù)分別為20×108、40×108、80×108、160×108、320×108CFU，其中5瓶37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，另5瓶置37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，期間分別取37 ℃靜置培養(yǎng)18、24 h， 37 ℃振蕩培養(yǎng)8、12 h樣品各5 mL，按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》[6]方法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

2.3 合成培養(yǎng)基的初步應(yīng)用

2.3.1 研制的合成培養(yǎng)基與常規(guī)培養(yǎng)基的比較

2.3.1.1 培養(yǎng)菌數(shù) 運(yùn)用已建立的仔豬副傷寒活疫苗生產(chǎn)用菌株培養(yǎng)參數(shù)，制備3批合成培養(yǎng)基(批號(hào)分別為200701、200702及200703)與3批普通肉湯培養(yǎng)基(批號(hào)分別為20070115、20070122及20070205)，各分裝于A型試管(10 mL/管)和500 mL三角瓶(200 mL/瓶)中。按2.2項(xiàng)建立的培養(yǎng)參數(shù)，按2%加入種子液，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h和37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，分別取樣進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

2.3.1.2 培養(yǎng)菌體的安全性及免疫原性 將三角瓶中每批合成培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌液，3500 r/min離心20 min，棄上清，菌體沉淀用適量生理鹽水懸浮后，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。分別皮下注射體重18～22 g的小鼠10只，0.2 mL/只(含1×108CFU活菌)，觀察21 d，記錄存活情況；肌肉注射體重1.5～2.0 kg的家兔5只，1.0 mL/只(含25×108CFU活菌)，30 d后，連同條件相同的不免疫對(duì)照家兔5只，各皮下注射經(jīng)肉肝胃(膜)消化湯培養(yǎng)2代的豬霍亂沙門氏菌(CVCC79102株)1.0 mL(含3 MLD的活菌)，觀察30 d，記錄存活情況。2.3.2 合成培養(yǎng)基保存期 將3批合成培養(yǎng)基分別按說明書用注射用水配制成5000 mL溶液，116 ℃滅菌30 min，置室溫(25 ℃)避光保存0、7、14、21、28 d。然后分裝于滅菌的500 mL三角瓶中(培養(yǎng)基裝量200 mL)，各按2%加入種子液，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)8、10、12 h，分別取樣進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 靜置及振蕩培養(yǎng) 結(jié)果見表1。從表1看出， 靜置培養(yǎng)，A管與三角瓶菌數(shù)變化趨勢(shì)一致，18～24 h可達(dá)到菌數(shù)穩(wěn)定期；振蕩培養(yǎng)，A管與三角瓶菌數(shù)變化趨勢(shì)基本一致，8～12 h可達(dá)到菌數(shù)穩(wěn)定期。

表1 豬霍亂沙門氏菌(CVCC79500株)培養(yǎng)計(jì)數(shù)結(jié)果(單位：×108CFU/mL)

注：種子液活菌計(jì)數(shù)為8.3×108CFU/mL。

3.2 不同接種菌數(shù)的比較 從表2看出，接入菌數(shù)多，其培養(yǎng)到達(dá)穩(wěn)定期時(shí)間提前，而接入菌數(shù)少，其培養(yǎng)到達(dá)穩(wěn)定期時(shí)間慢，但37 ℃靜置培養(yǎng)24 h、37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h均各自達(dá)到菌數(shù)穩(wěn)定期。

表2 不同接種菌數(shù)豬霍亂沙門氏菌(CVCC79500株)培養(yǎng)計(jì)數(shù)結(jié)果(單位：×108CFU/mL)

3.3 合成培養(yǎng)基與普通肉湯的比較試驗(yàn) 結(jié)果見表3、表4。從表3結(jié)果看出，在相同培養(yǎng)條件下，3批合成培養(yǎng)基的培養(yǎng)菌數(shù)均較3批普通肉湯的培養(yǎng)菌數(shù)高。從表4結(jié)果看出，合成培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌體對(duì)小鼠安全，均10/10健活；免疫效果與普通肉湯結(jié)果基本一致，免疫兔達(dá)4/5～5/5保護(hù)，對(duì)照5/5死亡。

表3 培養(yǎng)基比較試驗(yàn)結(jié)果(單位：×108CFU/mL)

200701批與20070115批接入活菌計(jì)數(shù)為9.2×108CFU/mL種子液、200702批與20070122批接入活菌計(jì)數(shù)為11×108CFU/mL種子液、200703批與20070205批接入活菌計(jì)數(shù)為11×108CFU/mL種子液

表4 培養(yǎng)菌體安全及免疫原性試驗(yàn)結(jié)果

注：因《規(guī)程》[3]中無“效力檢驗(yàn)”方法，“效力試驗(yàn)”參考《規(guī)程》[3]中“免疫原性試驗(yàn)”進(jìn)行。

3.4 保存期結(jié)果 從表5顯示，合成培養(yǎng)基室溫(25 ℃)保存28 d的培養(yǎng)菌數(shù)與保存當(dāng)日基本一致。

表5 培養(yǎng)基不同保存期活菌計(jì)數(shù)結(jié)果(單位：×108CFU/mL)

注：200701批接種菌液為11.3×108CFU/mL; 200702批接種菌液為10.1×108CFU/mL；200703批接種菌液為9.5×108CFU/mL

4 小結(jié)與討論

細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)繁殖，可分為遲緩期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期[2]。通常需要選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期或穩(wěn)定期的細(xì)菌，用于進(jìn)一步的冷凍、提取基因組、培養(yǎng)基篩選等試驗(yàn)[4,7]。靜置與振蕩培養(yǎng)是常規(guī)試驗(yàn)的兩種培養(yǎng)方法，但因?yàn)檎袷幣囵B(yǎng)的溶氧和換氣頻率遠(yuǎn)高于靜置培養(yǎng)，因而兩者培養(yǎng)所達(dá)到的細(xì)菌含量以及到達(dá)穩(wěn)定期的時(shí)間不同,從而能從表1中得出靜置和振蕩培養(yǎng)菌數(shù)差異大。

運(yùn)用試管及三角瓶以靜置和振蕩培養(yǎng)建立的生長(zhǎng)曲線，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基只要按容器體積的標(biāo)準(zhǔn)盛裝量(體積的1/3～1/2)，在培養(yǎng)主要參數(shù)一致的情況下，如振蕩培養(yǎng)時(shí)試管與三角瓶均采用透氣塞、均垂直置于搖床中，并采用同樣的溫度、轉(zhuǎn)速、接菌比例、培養(yǎng)時(shí)間，其培養(yǎng)趨勢(shì)基本一致。但由于容器及內(nèi)部空間體積不一樣，三角瓶溶氧含量高于試管，因而三角瓶培養(yǎng)菌數(shù)高于試管。而對(duì)于靜置培養(yǎng)，試管與三角瓶均采用透氣塞，溫度及接菌比例一致，其培養(yǎng)趨勢(shì)基本一致，而且培養(yǎng)菌數(shù)與容器無關(guān)，僅與培養(yǎng)方式有關(guān)。

不同接菌量的種子液比較試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，接入菌數(shù)多，培養(yǎng)到達(dá)穩(wěn)定期時(shí)間提前，而接入菌數(shù)少，到達(dá)穩(wěn)定期時(shí)間慢。按照表2中設(shè)計(jì)的接菌量，如果按靜置培養(yǎng)20×108CFU/mL計(jì)，則20×108～320×108CFU/mL 相對(duì)于含200 mL培養(yǎng)基的三角瓶中接菌量達(dá)0.5%～8%。由于我國(guó)獸用生物制品種子液一般都采用靜置培養(yǎng)，因而表2接入菌數(shù)所占比例完全能覆蓋獸用生物制品種子液常用的1%～3%接菌量[3]，表明按此標(biāo)準(zhǔn)的接菌量對(duì)整個(gè)振蕩培養(yǎng)中培養(yǎng)菌數(shù)影響不大。

由生長(zhǎng)曲線獲得的細(xì)菌培養(yǎng)參數(shù)，在此參數(shù)下可得出研制的合成培養(yǎng)基批次間相對(duì)穩(wěn)定，培養(yǎng)菌數(shù)優(yōu)于普通肉湯。由于牛肉湯難以質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化，因此3批普通肉湯培養(yǎng)菌數(shù)差異大[3-4]。同時(shí)運(yùn)用合成培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌體對(duì)小鼠的安全檢驗(yàn)及對(duì)家兔的免疫攻毒結(jié)果與普通肉湯一致，符合《規(guī)程》[3]中“仔豬副傷寒活疫苗制造及檢驗(yàn)規(guī)程”的要求。另外合成培養(yǎng)基保存28 d，其培養(yǎng)菌數(shù)與當(dāng)天新配制培養(yǎng)基一致。因此，初步試驗(yàn)表明，研制的合成培養(yǎng)基質(zhì)量穩(wěn)定，培養(yǎng)菌數(shù)高，而且不改變菌體的安全性及免疫原性，可替代普通肉湯。當(dāng)然，合成培養(yǎng)基在發(fā)酵生產(chǎn)中的實(shí)用性有待進(jìn)一步研究。

本文采用實(shí)驗(yàn)室最常用的培養(yǎng)器具(試管和三角瓶)，首次系統(tǒng)建立了靜置和振蕩培養(yǎng)仔豬副傷寒活疫苗生產(chǎn)用菌株的生長(zhǎng)曲線。明確了37 ℃靜置培養(yǎng)24 h或37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，可獲得培養(yǎng)菌體穩(wěn)定期。在此參數(shù)下，初步完成了培養(yǎng)基的比較篩選和應(yīng)用評(píng)價(jià)。上述工作的完成，為我國(guó)獸用細(xì)菌類疫苗合成培養(yǎng)基的篩選研究提供了經(jīng)驗(yàn)借鑒，從而進(jìn)一步為實(shí)現(xiàn)獸用細(xì)菌類疫苗高密度培養(yǎng)工藝化改造奠定基礎(chǔ)。

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(編輯：侯向輝)

Establishment of the Growth Curve of Paratyphoid Live Vaccine Strain for Production and Its Application in Synthetic Medium

ZHU Liang-quan1， SUN Ye1,2， LI Cong-yan2，JIANG Hui1，PENG Xiao-wei1，CHEN Xiang3*, DING Jia-bo1*

(1.ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China; 2.BeijingZhonghaiBiotechCo.,Ltd,Beijing100081,China;3.JiangsuKeyLaboratoryofZoonosis,YangzhouUniversity,Yangzhou，Jiangsu225009,China)

In this study, we established the growth curve of the paratyphoid live vaccine strain and obtained the parameter for bacteria cultivation, resulting in its application on the production of paratyphoid live vaccine using the synthetic medium.Salmonellaentericaserovar Choleraesuis (S. Choleraesuis) strain CVCC79500 was cultured for 30 h in the test tube or flask, via either static culture at 37 ℃ or shaking culture at 37 ℃/200 r/min. Culturing samples were taken out for live bacteria counting at 4, 8, 12, 18, 24 and 30 h, to establish the growth curve. It was shown that the growth of the strain CVCC79500 would reach its stationary phase by static culture at 37 ℃ for 18～24 h or shaking culture at 37 ℃/200 r/min for 8～24 h. While inoculated with different amount, the growth of the strain CVCC79500 could reach its stationary phase by static culture at 37 ℃ for 24 h or shaking culture at 37 ℃/200 r/min for 12 h. The effect for proliferation of strain CVCC79500 in synthetic medium and conventional common broth were compared using the obtained parameter. While static culture at 37 ℃ for 24 h in synthetic medium, the obtained bacteria count was 27～31×108CFU/mL and 33～41×108CFU/mL in test tube and flask, respectively. While shaking culture at 37 ℃/200 r/min for 12 h in synthetic medium, the obtained bacteria count was 58～66×108CFU/mL and 78～88×108CFU/mL in test tube and flask, respectively. However, the obtained bacteria count was lower when cultured in common broth at same condition. Using different batches of medium, the difference among obtained bacteria count was larger while cultured in common broth than in synthetic medium. TheS. Choleraesuis strain CVCC79500 was cultured in synthetic medium at 37 ℃/200 r/min for 12 h. The mice was inoculated with the harvested bacteria and showed a survival ratio (number of alive species / number of vaccinated species) of 100% (10/10). The inoculated mice were challenged with virulent strain, and had a protective ratio (number of protected species / number of challenged species) of 80%～100% (4/5～5/5). The safety and the protective efficacy of the strain cultured in synthetic medium were coincident with the strain cultured in common broth. The obtained bacteria count via shaking culturing was similar while the synthetic medium was kept in dark at 25 ℃ for 28 days, compared to fresh prepared synthetic medium. Therefore, the synthetic medium was evaluated under condition of obtained optimum parameter for production of paratyphoid live vaccine. The synthetic medium was better than the common broth, as higher bacteria count was obtained in the former than in the latter. Moreover, the synthetic medium had no influence on safety and immunogenicity of harvested bacteria. The preservation period of the synthetic medium could reach 28 days at room temperature and away from light.

strain for the production of paratyphoid live vaccine；cultivating parameters；synthetic medium

江蘇省人畜共患病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(R1410)；北京市科技新星計(jì)劃項(xiàng)目(No. XX2013099)

朱良全，從事人畜共患病病原學(xué)、細(xì)菌類疫苗合成培養(yǎng)基及相關(guān)獸用生物制品研究。

陳祥。chenxiang@yzu.edu.cn;丁家波。dingjiabo@126.com

2015-12-19

A

1002-1280 (2016) 02-0051-06

S859.797