陳培榮，吳海港，彭升武

(1.信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院，河南信陽(yáng) 46400；2.河北省承德縣農(nóng)牧局，河北承德 067400)

磺胺嘧啶鈉與兔血漿蛋白結(jié)合率的檢測(cè)研究

陳培榮1，吳海港1，彭升武2

(1.信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院，河南信陽(yáng) 46400；2.河北省承德縣農(nóng)牧局，河北承德 067400)

為研究磺胺嘧啶鈉與兔血漿中血漿蛋白結(jié)合情況，采用平衡透析法和超濾法模擬磺胺嘧啶鈉與血漿蛋白結(jié)合過(guò)程，高效液相色譜法測(cè)定透析內(nèi)液及外液中藥物濃度，計(jì)算磺胺嘧啶鈉血漿蛋白結(jié)合率。結(jié)果表明：血漿中其他成分對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，各待測(cè)物在選擇濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系均良好，精密度及穩(wěn)定性結(jié)果均符合方法學(xué)要求。透析外液線性范圍為0.5～20 μg/mL，透析內(nèi)液的線性范圍為1～100 μg/mL，提取回收率在78.67%～98.36%之間，日內(nèi)、日間變異均小于10%，磺胺嘧啶鈉的體外血漿蛋白結(jié)合率平均為32.47%，體內(nèi)血漿蛋自結(jié)合率平均為36.43%。本試驗(yàn)建立的方法簡(jiǎn)單，靈敏、專屬性強(qiáng)，磺胺嘧啶鈉在兔血漿中蛋白結(jié)合率較低，且具有濃度依賴性。

磺胺嘧啶鈉；血漿蛋白結(jié)合率；平衡透析法，兔

磺胺嘧啶是獸醫(yī)臨床方面廣泛應(yīng)用的抗微生物藥物之一，通常與磺胺甲氧芐啶合用，通過(guò)雙重阻斷細(xì)菌葉酸合成而抑制細(xì)菌繁殖，兩者合用，抗菌作用可增效數(shù)倍至數(shù)十倍，并可減少抗藥菌株的出現(xiàn)[1]。藥物血漿蛋白結(jié)合率是藥代動(dòng)力學(xué)的重要參數(shù)之一，藥物與血漿蛋白結(jié)合對(duì)藥物具有貯存、運(yùn)輸和緩沖毒性的作用，影響藥物在體內(nèi)的分布、代謝、排泄，甚至吸收，進(jìn)而影響藥物在靶位的效應(yīng)[2]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，磺胺嘧啶鈉與血漿蛋白結(jié)合率具有種屬差異性，存在飽和現(xiàn)象[3]，因此研究磺胺嘧啶鈉兔體內(nèi)血漿蛋白結(jié)合率具有重要臨床意義。本文用平衡透析法結(jié)合超濾法，并用高效液相色譜法測(cè)定了磺胺嘧啶鈉家兔體內(nèi)及體外血漿蛋白結(jié)合率，為臨床上科學(xué)使用磺胺嘧啶鈉提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑 Agilent1100型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；JY2002型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn))；管狀半透膜(上海興亞凈化材料廠生產(chǎn))；磺胺嘧啶鈉標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供，批號(hào)H080401，含量99.7%)；磺胺嘧啶鈉原料(浙江新昌國(guó)邦獸藥廠生產(chǎn)，批號(hào)070814，含量98%)；甲醇、乙腈、乙酸乙酯、三乙胺均為分析純(上海國(guó)藥集團(tuán))。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 健康大耳白兔6只，雌雄各半，體重(2±0.2) kg，信陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)前禁食24 h自由飲水。1.1.3 溶液配制 磺胺嘧啶鈉貯存液：取標(biāo)準(zhǔn)品0.125 g溶于蒸餾水中，并稀釋至1000 mL?；前粪奏もc標(biāo)準(zhǔn)液：精確吸取貯存標(biāo)準(zhǔn)液3 mL，置100 mL容量瓶中，用3%三氯醋酸稀釋至刻度。透析液：精密稱取磷酸氫二鉀14.11 g，磷酸二氫鉀2.59 g，氯化鈉1.99 g于1 L容量瓶中，加去離子水溶解并稀釋至刻度，得pH 7.4磷酸緩沖液。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent TC-C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相：水:乙腈：磷酸(體積分?jǐn)?shù)為12.5%)：三乙胺(體積分?jǐn)?shù)為15%)=85∶13∶1∶1；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL[4]。

1.2.2 樣品處理方法 透析內(nèi)液樣品的預(yù)處理：取血漿樣品(透析內(nèi)液)0.5 mL，置10 mL具塞離心管中，加入乙腈1 mL渦旋混合30 s，4000 r/min 離心20 min，取上清液過(guò)微孔濾膜(0.22 μm)，取濾液20 μL注入高效液相色譜儀測(cè)定。

透析外液樣品的預(yù)處理：取透析外液樣品微孔濾膜(孔徑0.22 μm)過(guò)濾后,精密吸取1 mL，離心(3000 r/min) 5 min，取上清液20 μL注入高效液相色譜儀測(cè)定。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線 取空白血漿0.5 mL，加入磺胺嘧啶鈉標(biāo)準(zhǔn)液，配成相當(dāng)于磺胺嘧啶鈉血漿濃度為1、2、5、10、20、50、100 μg/mL的模擬透析內(nèi)液樣品；另取空白透析液1 mL，加入磺胺嘧啶鈉標(biāo)準(zhǔn)液，配成相當(dāng)于磺胺嘧啶鈉血漿濃度為0.5、1、2、5、10、20 μg/mL的模擬透析外液樣品，按1.2.2項(xiàng)下方法操作。以SD的峰而積(y)對(duì)其血藥濃度(c)作圖，求得回歸方程。

1.2.4 準(zhǔn)確度和精密度 取空白血漿0.5 mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下的方法操作，分別配制成低、中、高3個(gè)濃度透析內(nèi)液(1、10、100 μg/mL)和透析外液(0.5、2、20 μg/mL)?？疾旆椒ǖ娜諆?nèi)和日間精密度(RSD)和準(zhǔn)確度。

1.2.5 回收率測(cè)定 精密吸取空白血漿0.5 mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下的方法操作，配制成低、中、高3種濃度，每個(gè)濃度5樣品，計(jì)算加樣提取后進(jìn)樣的藥物峰面積和標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣的峰面積之比，考察樣品的回收率。

1.2.6 穩(wěn)定性測(cè)定 精密吸取空白血漿0.5 mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下的方法操作，配制成低、中、高3種濃度，每個(gè)濃度3樣品，考察血漿樣品預(yù)處理后室溫放置4 ℃和-20 ℃下放置7 d的穩(wěn)定性。1.2.7 體外血漿蛋白結(jié)合率測(cè)定方法 參考文獻(xiàn)[5]，將管狀半透膜一端折疊用線結(jié)扎，將空白血漿2.0 mL于上述半透膜袋內(nèi)，并扎緊口袋另一端(注意：袋口不得污染血漿)。將兩端扎緊的半透膜置于盛有9.75 mL透析液的30 mL廣口瓶中，透析外液的質(zhì)量濃度分別為0.0125、0.025、0.05 mg/mL將該廣口瓶于冰箱中放置至藥物擴(kuò)散平衡。透析結(jié)束后，吸出袋外透析液少許，加等量磺基水楊酸試劑，檢查有無(wú)血漿蛋白漏出。如檢查為陽(yáng)性，則該樣品作廢。另取加2.0 mL透析液代替血漿于半透膜袋內(nèi)，作平衡時(shí)間對(duì)照樣品，以確定藥物從袋內(nèi)外自由擴(kuò)散達(dá)到平衡所需時(shí)間。分別測(cè)定透析袋內(nèi)外的藥物濃度，計(jì)算血漿蛋白結(jié)合率，其公式為fb=(Dt-Df)/Dt×100%，其中fb:血漿蛋白結(jié)合率,Dt:血藥總濃度(透析袋內(nèi)的血漿藥物濃度),Df：游離藥物濃度(透析袋外緩沖液中藥物濃度)。

1.2.8 體內(nèi)血漿蛋白結(jié)合率實(shí)驗(yàn)方法 健康大耳白兔6只耳靜脈注射SD 100 mg/kg，10 min心臟取血， 4 ℃，3000 r/min離心 10 min，取血漿0.5 mL 按“透析內(nèi)液樣品的預(yù)處理”項(xiàng)下操作。另取0.5 mL于超濾離心管中、4 ℃，10000 r/min離心20 min，取濾液20 μL注入高效液相色譜儀測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法專屬性 在本試驗(yàn)建立的色譜條件下，基線走動(dòng)平穩(wěn)，峰形良好，無(wú)雜質(zhì)峰出現(xiàn)，色譜圖見(jiàn)圖1～圖4。該測(cè)定方法簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性好，分析樣品的時(shí)間均不超過(guò)10 min，分析效率高。

圖1 空白緩沖溶液色譜圖

圖2 空白血漿色譜圖

圖3 透析內(nèi)液色譜圖

圖4 透析外液色譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 本研究所建立的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線相見(jiàn)圖5、圖6。透析內(nèi)液的標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線為y=0.0219x+0.1742，線性范圍為1～100 μg/mL。透析外液的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0588x+0.0616,線性范圍為0.5～20 μg/mL。其相關(guān)系數(shù)均在0.9990以上。

圖5 透析內(nèi)液標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

圖6 透析外液標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.3 回收率、準(zhǔn)確度和精密度 參透析內(nèi)液和透析外液回收率、準(zhǔn)確度及精密度數(shù)據(jù)見(jiàn)表1、表2，從表1、表2可以看出,3種濃度磺胺嘧啶鈉的回收率的值在78.67%～98.36%之間，準(zhǔn)確度高。日內(nèi)變異系數(shù)均小于10%，日間變異系數(shù)均小于10%，方法具有較好的精密度。

表1 透析內(nèi)液回收率、準(zhǔn)確度和精密度結(jié)果表

表2 透析外液回收率、準(zhǔn)確度和精密度結(jié)果表

2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 考察結(jié)果表明：血漿樣品在室溫放置4 h和-20 ℃下放置7 d等條件下穩(wěn)定性良好。

2.5 平衡時(shí)間 磺胺嘧啶鈉平衡時(shí)間見(jiàn)表3，由表3可以看出，平衡時(shí)間為60 h時(shí)，透析袋內(nèi)外磺胺嘧啶鈉的濃度達(dá)到平衡。

表3 磺胺嘧啶鈉平衡時(shí)間表

2.6 血漿蛋白結(jié)合率 體外血漿蛋白結(jié)合率試驗(yàn)結(jié)果：低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的血漿蛋白結(jié)合率分別為(41.3±1.1)%、(32.2±1.3)%和(23.9±0.8)%。

體內(nèi)血漿蛋白結(jié)合率試驗(yàn)結(jié)果：母兔和公兔的血漿蛋白結(jié)合率分別為(35.2±2.3)%和(37.7±4.5)%。

3 討論與小結(jié)

3.1 藥物與血漿蛋白結(jié)合率測(cè)定方法的選擇 藥物與血漿蛋白結(jié)合的方法包括平衡透析(equilibrium dialysis)、超過(guò)濾(ultrafiltration)、超離心(ultracentrifugation、快速或動(dòng)力透析、分配平衡、光譜等各類方法[6]。在這些常用的方法中，平衡透析(ED)和超過(guò)濾(UF)是兩種使用最多的方法。ED法基于藥物結(jié)合的平衡原理，且受實(shí)驗(yàn)因素的干擾很小，常被認(rèn)為是研究藥物一蛋白結(jié)合的經(jīng)典參比方法。UF的最大優(yōu)點(diǎn)是實(shí)現(xiàn)血漿中游離藥物的快速分離，加之與高靈敏度的液相聯(lián)用檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合，UF已被廣泛運(yùn)用于大規(guī)模生物樣品的游離藥物濃度分析。微透析方法是以生理溶液不斷灌注埋在組織中的微透析探針，組織中小分子物質(zhì)經(jīng)探針頭部的半透膜彌散進(jìn)入灌注液而在膜兩側(cè)達(dá)成動(dòng)態(tài)平衡，同時(shí)被連續(xù)流動(dòng)的灌注液不斷帶出從而達(dá)到活體取樣的目的，但是微透析法不能進(jìn)行血液藥物總濃度檢測(cè)[7]。

3.2 磺胺嘧啶鈉血漿蛋白結(jié)合率的影響因素 藥物與血漿蛋白之間的結(jié)合反應(yīng)不僅關(guān)系到藥物在體內(nèi)的分布和消除，還與藥物相互作用密切相關(guān)，影響藥物和血漿蛋白結(jié)合的因素比較多，主要有藥物性質(zhì)、血漿pH值、血漿蛋白對(duì)藥物的親和率等[8]。文獻(xiàn)報(bào)道，一般帶負(fù)電荷的藥物及酸性藥物和血漿蛋白結(jié)合率較高[9]?；前奉愃幬锏南俾逝c其血漿蛋白結(jié)合率關(guān)系密切，蛋白結(jié)合率高，半衰期相對(duì)長(zhǎng)。對(duì)SD的血漿蛋白結(jié)合率的研究發(fā)現(xiàn)，SD血漿蛋白結(jié)合率存在著種屬差異性，其中SD與綿羊血漿蛋白結(jié)合率最高，為40.76%，而在雞體內(nèi)SD血漿蛋白的結(jié)合率為33.69%。本試驗(yàn)中磺胺嘧啶鈉與兔體外血漿蛋白結(jié)合率平均為32.47%，其血漿蛋白率結(jié)合較高原因可能是在動(dòng)物血漿中，磺胺嘧啶鈉是一種帶負(fù)電的弱酸性藥物容易和血漿蛋白結(jié)合，此外血漿pH值、血漿中血漿蛋白組成及含量也可能會(huì)影響磺胺嘧啶鈉在兔體內(nèi)的血漿蛋白結(jié)合率。此外，從試驗(yàn)結(jié)果中可以看出磺胺嘧啶鈉和血漿蛋白結(jié)合率存在著質(zhì)量濃度依賴性，表明磺胺嘧啶鈉和血漿蛋白結(jié)合具有一定的飽和性，隨著藥物濃度增加血漿蛋白結(jié)合率降低，這和文獻(xiàn)報(bào)道的相一致[10-11]。

本試驗(yàn)中采用平衡透析和超濾法模擬磺胺嘧啶鈉與兔血將蛋白的結(jié)合過(guò)程，建立了磺胺嘧啶鈉在透析外液及透析內(nèi)液中含量測(cè)定方法。試驗(yàn)結(jié)果顯示：本試驗(yàn)所建立的試驗(yàn)方法簡(jiǎn)便、專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高，血漿中其他成分對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，各待測(cè)物在選擇濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系均良好，精密度及穩(wěn)定性結(jié)果均符合方法學(xué)要求，能夠滿足臨床上對(duì)生物樣品檢測(cè)和分析的要求。

[1] 陳仗榴.獸醫(yī)藥理學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2009.

[2] Dust K,Jones D C,Davidson G. Detemunation of sulfanamides packed column supercritical fluid chromatography with atmosheric pressure chemical ionnizatian mass spectrometric detection[J].Analyst,2000, 125(7): 1243.

[3] 李在建，吳玉容，易維學(xué)，等.三種不同磺胺類藥物對(duì)鯉魚(yú)干細(xì)胞色素P450酶系生化指標(biāo)的影響[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2010， 40 (9)：970-974.

[4] 林麗聰，樊海平，廖碧釵，等.磺胺嘧啶在歐洲鰻鱺體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究[J].檢驗(yàn)檢疫學(xué)刊，2010，4(20)：14-17.

[5] 孫言春，王瑛，杜寧寧，等.液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定磺胺間甲氧嘧啶鈉與鯉魚(yú)血漿蛋白結(jié)合率[J].中國(guó)漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)，2012，2(4)：81-85.

[6] 肖超，陳風(fēng)春，劉忠文，等.磺胺二甲嘧啶及其乙?；x產(chǎn)物與血漿蛋白體外結(jié)合特點(diǎn)[J].解放軍預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2012，30(4)：243-245.

[7] 郭賓，李川.藥物與血漿蛋白結(jié)合的藥理學(xué)基礎(chǔ)及其研究進(jìn)展[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2005，10(3)：241-253.

[8] 關(guān)瑾，丁爽，劉芷含，等.藥物-血漿蛋白結(jié)合率測(cè)定方法的研究進(jìn)展[J].中國(guó)新藥雜志，2014，10(23)：1149-1153.

[9] Zhong J, Tang M K, Zhang Y,etal. Effect of salvianolicacid B on neural cells damage and neurogenesis after brainischemia-reperfusion in rats [J].Acta Pharm Sin，2007, 42: 716-721.

[10]Lund T,Bylund G. Effect oI sulphadiazine and trimethoprimnn the immune response oI rainbow trout(On corhyachus mykiss) [J].Vet Immunol Immunop,2002,85 (1/2):99-108.

[11]Hou X,Shen J,Zhang S,etal.Bioconcentration and elimination on sullamethazine and its main metabolite insturgeon (Acipenser.schrenkii) [J].J Agric Food Chem,2003,51 (26):7725-7729.

(編輯：侯向輝)

Determination of the Binding Rate of Rabbit Plasma Protein with Sulfadiazine Sodium

CHEN Pei-rong1，WU Hai-gang1，PENG Sheng-wu2

(1.XinyangCollegeOfAgriculturalandForestry,Xinyang,Henan464000，China；2.AgricultureandAnimalBureauofChengdeCity，Chengde，Hebei067400，China)

To study the plasma protein binding rate of sulfadiazine sodium in rabbit plasma. The equilibrium dialysis method and the ultrafiltration method were used to imitate the binding process between sulfadiazine sodium and plasma protein, The HPLC was adopted to determined sulfadiazine sodium in plasma. The results showed that there was no interference from other ingredients for the determination of sulfadiazine sodium. The calibrationcurve of the analytes was in good linearity in certain range of contents. The precision and stability of the analytes met the methodology requirements. The calibration curve of the buffer solution was linear in the range of0.5～20 μg/mL,The calibration curve of the plasma was linear in the range of 1～100 μg/mL,The extract recovery was 78.67%～98.36%,RSDs of infra and inter-day precisions were all less than 10%.The binding rates of plasma protein with sulfadiazine sodium in vitro was 32.47% andinvivowas 36.43%. The HPLC method established in the paper is simple sensitive and stable. SD has a lower protein binding rate with rabbit plasma and The binding of SD to plasma protein was concentration dependent.

sulfadiazine sodium(SD); protein binding rate; equilibrium dialysis; rabbit

陳培榮，講師，從事畜牧獸醫(yī)專業(yè)教學(xué)工作及研究。E-mail:xycpr@126.com

2015-12-11

A

1002-1280 (2016) 02-0041-05

S859.796