吉元剛，張國利，李澤鴻，岳玉環(huán)，吳廣謀，田園，劉雨玲，李玉潔，趙鑫付玉和，王冬冬，張培培，侯天全，徐艷玲，馬洪園

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，長春 130118；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，長春130122)

抗B型肉毒毒素治療性胞內(nèi)抗體的制備及活性研究

吉元剛1,2，張國利2，李澤鴻1，岳玉環(huán)2，吳廣謀2，田園2，劉雨玲2，李玉潔1，趙鑫1,2付玉和1,2，王冬冬2，張培培2，侯天全2，徐艷玲2，馬洪園1,2

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，長春 130118；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，長春130122)

以克隆表達的B型肉毒毒素輕鏈蛋白(BoNT/BL)為抗原，從噬菌體抗體庫Tomlinson I+J篩選出得到活性高和特異性高的全人源單鏈抗體(ScFv)，結(jié)合能夠攜帶外源蛋白有效通過生物膜的小片段跨膜肽(TAT)制備跨膜單鏈抗體(TAT-ScFv)。經(jīng)PCR后酶切，克隆到原核表達載體(pET-28a-TAT)中，構(gòu)建含有跨膜肽(TAT)的抗B型肉毒毒素胞內(nèi)抗體融合蛋白，并在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達，進行純化工藝，對產(chǎn)物進行濃度純度、親和常數(shù)測定及生物活性研究。成功構(gòu)建TAT-ScFv表達載體，融合蛋白相對分子量為32.7 kDa，主要以可溶形式表達，純度也達到95%以上，胞內(nèi)抗體中和B型肉毒毒素致病輕鏈得到TAT-ScFv的親和常數(shù)為(1.133±0.273)×106L/mol，小鼠神經(jīng)細胞乙酰膽堿定量測定實驗證明胞內(nèi)抗體具有較好的抗毒素活性。此結(jié)果為B型肉毒毒素治療性胞內(nèi)抗體的研制和肉毒中毒治療奠定了基礎(chǔ)。

跨膜肽(TAT)；重組蛋白；表達；蛋白純化；親和常數(shù)；乙酰膽堿

肉毒芽胞梭菌是一種革蘭氏陽性菌，菌體形態(tài)不一，多數(shù)呈現(xiàn)直桿狀或稍帶彎曲[1]。肉毒毒素BoNT是由肉毒梭菌分泌的一類具有致死性毒性極強的神經(jīng)毒素，在國際上被歸為A類生物戰(zhàn)劑[2]。目前發(fā)現(xiàn)有7個血清型(A～G)，有一定的相似結(jié)構(gòu)，每個肉毒毒素是一個近似的分子量為150 kDa的蛋白分子[3]。但是具有不同的抗原性，其中A、B型最為常見，A、B、E和F型是引起人類中毒的主要亞型[4]。肉毒神經(jīng)毒素是通過裂解SNARE蛋白抑制鈣依賴的胞吐釋放神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿和突觸的弛緩性麻痹引起潛在的死亡[5]。各型的肉毒毒素對靶蛋白特異性位點的切割，干擾了突觸小泡的功能，阻斷了神經(jīng)介質(zhì)的外泌作用，減少了神經(jīng)介質(zhì)乙酰膽堿的釋放[6]，最終引起機體肌肉馳緩性麻痹。其中B型肉毒毒素以單一位點切割SNARE蛋白中突觸小泡膜蛋白(VAMP)[7]。談及其治療中毒有效的藥物，目前要數(shù)多價馬血清，但由于種屬原因人體存在過敏反應(yīng)等不良作用，并且制備程序昂貴復(fù)雜；另外馬匹數(shù)量的有限性，也使其得不到推廣利用[8]。從免疫人血清中提取純化抗體這一方案，更是無法滿足對抗體的需求。目前新型肉毒毒素疫苗和中和抗體的研究主要以Hc為抗原進行[9]，包括有重鏈抗原表位預(yù)測研究，對重鏈功能進行詮釋；重鏈?zhǔn)荏w結(jié)合區(qū)的表達及免疫原性研究；重鏈結(jié)構(gòu)域單克隆抗體制備和篩選[10]。生物技術(shù)和先進設(shè)備的顯著發(fā)展，使基因工程手段成為開發(fā)制備BoNT/B中和抗體的一種有效可行策略，這也是目前眾多研究領(lǐng)域中常用設(shè)計方法和新思路。本課題針對于從人源噬菌體庫中篩選出的BoNT/B輕鏈活性最高的中和抗體，與具有穿梭細胞膜功能的TAT蛋白核心肽段進行基因重組，表達具有穿梭功能的抗BoNT/B人源單鏈抗體，以期為研發(fā)B型BoNT中和抗體治療藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌種及檢測蛋白 受體菌 JM109及BL21(DE3) 工程菌均由軍事獸醫(yī)研究所生物技術(shù)應(yīng)用研究室保存；B型肉毒毒素輕鏈抗體由軍事獸醫(yī)研究所六室制備保存；抗B型肉毒毒素單鏈抗體(ScFv)由軍事獸醫(yī)研究所生物技術(shù)應(yīng)用研究室篩選保存；原核表達載體(pET-28a-TAT-EGFP)由解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所生物技術(shù)應(yīng)用研究室保存。

1.2 主要試劑 T4DNA連接酶和Taq DNA聚合酶、限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ等分子生物學(xué)工具酶及BSA均購于大連寶生物工程技術(shù)有限公司；DNA凝膠回收試劑盒購于康為試劑生物科技有限公司；卡那霉素及氨芐西林購于寶泰克生物技術(shù)有限公司；甘氨酸、丙烯酰胺、誘導(dǎo)劑IPTG及SDS購于Progmega公司；過硫酸銨、溴酚藍及TEMED購于Sigma公司；質(zhì)粒提取試劑盒購于Omega Biotek Inc；抗B型肉毒毒素單鏈抗體PCR引物合成由寶生物工程技術(shù)公司完成，引物序列如表1所示。

表1 克隆目的基因(ScFv)的引物

1.3 抗B型肉毒毒素單鏈抗體(ScFv)基因克隆及重組質(zhì)粒的構(gòu)建 以篩選的單鏈抗體基因組DNA為模板，PCR擴增目的基因片段(ScFv)，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增的結(jié)果，按照DNA膠回收試劑盒的步驟回收，經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切3 h，用T4 Ligase和T4 Ligase Buffer克隆到同樣雙酶切的原核表達載體上16 ℃過夜，構(gòu)建重組表達載體(pET-28a-TAT-ScFv)，表達載體轉(zhuǎn)化到制備好的感受態(tài)E.coliJM109中，將菌液涂布于LB抗性平板上(含有50 μg/mL Kan)，37 ℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。從抗性平板中挑取單菌落，擴大培養(yǎng)。

1.4 重組質(zhì)粒(TAT-ScFv)的鑒定 經(jīng)菌落PCR鑒定，提取質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，選取陽性克隆菌株進行重組質(zhì)粒(TAT-ScFv)提取，用T7promotor和T7terminator引物委托寶生物工程有限公司進行測序鑒定。

1.5 胞內(nèi)抗體融合蛋白(TAT-ScFv)的誘導(dǎo)表達 將測序正確的重組表達質(zhì)粒以氯化鈣法轉(zhuǎn)化到表達菌E.coliBL21(DE3)中，從長滿菌落的LB平板上隨機挑選優(yōu)異的單菌落轉(zhuǎn)接于5 mL LB培養(yǎng)基中(含有50 μg/mL Kan)，37 ℃搖床培養(yǎng)，次日轉(zhuǎn)接進行大瓶培養(yǎng)，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為1 mmol/L，30 ℃誘導(dǎo)表達3.5 h。10000 r/min離心10 min，棄上清，用PBS(pH 7.0)重懸菌體，超聲破碎處理，并鏡檢確定細胞破碎完全，4 ℃ 10000 r/min離心5 min，收集上清，沉淀用PBS(pH 7.0)重懸，進行SDS-PAGE分析蛋白表達形式，以未誘導(dǎo)的菌體做陰性對照。

1.6 融合蛋白的純化

1.6.1 Cu2+金屬螯合層析純化蛋白 A液：20 mmol/L PBS (pH 7.0)，B液：20 mmol/L PBS 20 mmol/L 咪唑( pH 7.0)，C液：20 mmol/L PBS 80 mmol/L 咪唑( pH 7.0)，D液：20 mmol/L PBS 200 mmol/L咪唑( pH 7.0)。樣品進行Cu2+Chelating SepharoseTMFast Flow金屬螯合層析，用A液平衡層析柱約5個柱床體積，2 mL/min上樣(菌體裂解離心得到的上清液)，上樣結(jié)束以A液以相同流速洗脫流川，用B液以相同的流速洗脫至讀數(shù)不再下降，收集洗脫液，用C液以不變的流速洗脫，讀數(shù)不再下降時，收集洗脫液，用D液以不變的流速洗脫，收集洗脫液。然后用0.1 mol/L NaOH洗脫柱子上殘留的雜蛋白，大約5個柱床體積，用水洗脫，最后用20%乙醇封閉。

1.6.2 rProtein-A FF親和層析純化蛋白 A液：20 mmol/L PBS (pH 7.0)，B液：0.1 mol/L甘氨酸(pH 3.0)，C液：1 mol/L Tris (pH 8.0)，采用A液平衡Protein A FF，將過Cu2+金屬螯合層析柱的80 mmol/L和200 mmol/L咪唑洗脫液分別上樣，用A液以相同的流速洗脫至讀數(shù)不再下降，用B液緩慢洗脫，同時用C液以1/10接樣(0.5 mL C液接甘氨酸洗脫流川至5 mL)，最后用甘氨酸(pH 2.5)和C液交替洗脫柱子，用NaN3封柱。

1.7 蛋白親和常數(shù)測定 取無菌96孔板一個，抗原1/2梯度稀釋包被每孔，4 ℃過夜。次日，傾去包被液，倒置拍板，以去除殘余的包被液。Wash buffer洗板3次，每次3 min，拍干。添加200 μL 2%牛奶(取牛奶1 g，加PBS 50 mL)封閉37 ℃反應(yīng)2 h。洗板3次。每孔加1/2梯度稀釋一抗100 μL，留2孔作陰性對照(200 μL 2%牛奶)，37 ℃反應(yīng)2 h，洗板3次，加二抗100 μL，37 ℃反應(yīng)1 h，洗板3次。最后加100 μL顯色液避光反應(yīng)15 min，加50 μL終止液2 mol/L H2SO4，酶標(biāo)儀讀數(shù)。每個樣品三組平行實驗，根據(jù)抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的S型曲線圖，能夠求解出在不同抗原濃度下，半數(shù)吸光值時ScFv濃度，帶入到公式KA=(n-1)/2(nAb’-Ab)計算親和常數(shù)，其中Ab’和Ab表示當(dāng)抗原為Ag’和Ag時，半數(shù)吸光值的ScFv濃度(mol/L)，n=Ag/Ag’，當(dāng)n=2時，可以得到3個KA值，n=4時，可以得到2個KA值，n=8時，可以得到1個KA值，把6個KA值取平均值數(shù)即最終的親和常數(shù)。

1.8 小鼠神經(jīng)細胞乙酰膽堿定量測定實驗 培養(yǎng)小鼠神經(jīng)瘤樹突狀細胞，采用小鼠乙酰膽堿酶聯(lián)免疫分析試劑盒，用于體外定量檢測培養(yǎng)基中小鼠乙酰膽堿的含量，如果細胞培養(yǎng)加入B型肉毒毒素，干擾了突觸小泡的功能，阻斷了神經(jīng)介質(zhì)的外泌作用，減少了神經(jīng)介質(zhì)乙酰膽堿的釋放，培養(yǎng)基中的乙酰膽堿含量就會減少，加入跨膜肽融合抗體進入到小鼠神經(jīng)細胞并中和毒素，具有一定的治療作用。實驗大體分四組：DC神經(jīng)細胞；DC神經(jīng)細胞+跨膜抗體蛋白；DC神經(jīng)細胞+Bont-B；DC神經(jīng)細胞+Bont-B+跨膜抗體蛋白。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒(TAT-ScFv)的鑒定 重組表達質(zhì)粒PCR和質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見930 bp片段，委托吉林省庫美生物科技有限公司進行測序，測序結(jié)果表明，插入DNA片段與設(shè)計基因序列一致(圖1～圖2)。

1:PCR產(chǎn)物；M:DNA marker DL200圖1 重組質(zhì)粒PCR鑒定

1～4:質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物；M：DNA marker DL2000圖2 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

2.2 表達產(chǎn)物(TAT-ScFv)鑒定 誘導(dǎo)表達菌及菌體裂解產(chǎn)物經(jīng)12% SDS-PAGE電泳，未誘導(dǎo)做陰性對照，在約32.7 kDa處出現(xiàn)一條明顯表達帶，與融合蛋白預(yù)期大小一致。電泳表明大部分目的蛋白呈可溶性表達形式(圖3)。

1：對照組 2：誘導(dǎo)組3：蛋白質(zhì)marker圖3 表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

2.3 跨膜抗體蛋白(TAT-ScFv)純化 表達產(chǎn)物經(jīng)金屬螯合Cu2+柱，梯度洗脫后，最終80 mmol/L和200 mmol/L 咪唑洗脫液得到含有雜帶的目的蛋白，SDS-PAGE電泳監(jiān)測表明，目的蛋白的相對分子質(zhì)量為32.7 kDa，SDS-PAGE電泳結(jié)果與此相符(圖4)。將金屬螯合Cu2+柱80 mmol/L和200 mmol/L 咪唑洗脫液進行Protein A柱層析，與預(yù)期條帶相符，如圖5所示。

M：蛋白質(zhì)marker； 1～3：流川液、20 mmol/L Tris·Cl流川液和20 mmol/L 咪唑洗脫；4、5：80 mmol/L和200mmol/L 咪唑洗脫圖4 純化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

M：蛋白質(zhì)marker； 1、2：80 mmol/L和200mmol/L 咪唑洗脫的目的蛋白圖5 純化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

2.4 蛋白濃度測定 采用BSA法測定兩組純化蛋白的濃度。測得蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.6392x+0.0656。80 mmol/L 和200 mmol/L咪唑洗脫液光吸收值分別為0.371和0.518，對應(yīng)純化的跨膜抗體蛋白的濃度分別是0.47 mg/mL和0.7 mg/mL。

2.5 跨膜抗體蛋白親和常數(shù)測定 利用非競爭酶免疫法測定TAT-ScFv的親和常數(shù)，分別對在不同抗原濃度下得到的曲線進行模擬，能夠得到4個半數(shù)吸光值的TAT-ScFv濃度(圖6)，然后利用公式KA=(n-1)/2(nAb’-Ab)，得到6個KA值，從表2中可以看出TAT-ScFv的親和常數(shù)為(1.133±0.273)×106L/mol。

表2 TAT-ScFv親和力測定曲線進行模擬后得到的KA值

圖6 TAT-ScFv親和力測定曲線

2.6 小鼠神經(jīng)細胞乙酰膽堿定量測定實驗 小鼠神經(jīng)細胞培養(yǎng)鋪板，每孔細胞數(shù)是2×104個。實驗組1是DC細胞，實驗組2是DC細胞加跨膜抗體蛋白，實驗組7是DC細胞加B型肉毒毒素，實驗組3～6是DC細胞加B型肉毒毒素加跨膜抗體蛋白1/2稀釋，通過實驗組1和2，培養(yǎng)基中乙酰膽堿的含量基本沒有變化，證明融合抗體蛋白對小鼠神經(jīng)細胞乙酰膽堿的釋放基本沒有影響。通過實驗組1和7，培養(yǎng)基中乙酰膽堿的含量明顯不同，用肉毒毒素作用的小鼠神經(jīng)細胞培養(yǎng)基中乙酰膽堿較正常有明顯減少，證明了肉毒毒素抑止小鼠神經(jīng)細胞乙酰膽堿的釋放。通過實驗組3,4,5和6，培養(yǎng)基中乙酰膽堿的含量都有顯著不同，隨著跨膜抗體蛋白濃度的降低，培養(yǎng)基中乙酰膽堿的含量減少。對比其他三組，證明跨膜抗體蛋白對肉毒毒素具有中和活性(圖7)。

圖7 小鼠神經(jīng)細胞培養(yǎng)基中乙酰膽堿含量

3 討論與小結(jié)

目前，沒有特定的藥物針對性治療B型肉毒毒素中毒，疫苗和抗血清治療是研究治療肉毒中毒的主要方向，人類最廣泛使用的疫苗是滅活疫苗如PBT。一些科學(xué)家研制出對肉毒毒素有抑制作用的抑制劑，尚無顯著地治療案例[11]。B型肉毒毒素輕鏈的單克隆抗體尚未有人研制出。先前的研究主要集中于肉毒毒素基因及蛋白結(jié)構(gòu)，包括有功能蛋白的研究，隨著肉毒毒素基因組測定以及基因解讀工作的不斷完善，揭示部分型別的肉毒毒素基因結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)。結(jié)構(gòu)研究表明，重鏈和輕鏈?zhǔn)侨舛径舅氐闹饕Y(jié)構(gòu)成分，先前對B型肉毒毒素的治療研究側(cè)重于重鏈，主要集中在采用大腸桿菌和酵母表達系統(tǒng)對肉毒毒素重鏈蛋白作為抗原方面[12]。但是重鏈的抗原決定簇難以定位且可產(chǎn)生中和性抗體，而輕鏈?zhǔn)侨舛径舅氐闹虏〔课籟13]。

本實驗結(jié)果表明，B型肉毒毒素輕鏈抗體已成功克隆入含有跨膜肽片段載體(PET28a-TAT)中，由于大腸桿菌表達系統(tǒng)比較成熟，且條件易于掌控，選擇大腸桿菌作為蛋白質(zhì)表達菌，經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)表達，在上清中抗體蛋白的表達量要明顯大于沉淀中的，所以重組蛋白主要還是以可溶性形式表達。重組蛋白純化過程中，由于重組蛋白含有組氨酸標(biāo)簽，與Cu2+結(jié)合相對較強，采用高濃度的咪唑 (80 mmol/L 咪唑和200 mmol/L咪唑) 洗脫，利用Protein A 可以與 IgG 特異性結(jié)合的特點, 對抗體蛋白進一步純化，得到高純度抗體蛋白。測定的蛋白濃度分別為0.47 mg/mL和0.7 mg/mL，并對蛋白活性進行了初步檢測，為后期的檢測奠定了基礎(chǔ)。B型肉毒毒素治療性輕鏈抗體的制備工藝經(jīng)過實驗室的特異載體重組，降低純化難度，結(jié)合抗體特異性，簡化了純化步驟，同時保證了較高的濃度和極高的純度。這為肉毒毒素中毒抗體治療法填補了空缺，將是肉毒毒素中毒治療上的一個突破性的飛躍。

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(編輯：侯向輝)

Preparation and Study on the Activity of Anti B Botulinum Toxin in the Treatment of Cytoplasmic Antibody

JI Yu-gang1,2, ZHANG Guo-li2, LI Ze-hong1, YUE Yu-huan2, WU Guang-mou2,TIAN Yuan2, LIU Yu-ling2, LI Yu-jie1, ZHAO Xin1,2, FU Yu-he1,2, WANG Dong-dong2,ZHANG Pei-pei2, HOU Tian-quan2, XU Yan-ling2, MA Hong-yuan1,2

Cloning and expression of botulinum toxin type B light chain protein (BoNT/BL) as antigen, the whole human single chain antibody (ScFv) with high activity and high specificity was obtained from phage antibody library I+J Tomlinson, Cross membrane peptide (TAT) preparation of transmembrane single chain antibodies (TAT-ScFv) by binding to a small fragment of a biological membrane capable of carrying a foreign protein by PCR,Connection with carrier(pET-28a-PTD), Construction of anti B type botulinum toxin recombinant antibody protein containing transmembrane peptide(TAT), And the expression was induced inE.coli. The purification process was carried out, and the concentration and purity of the product, the affinity constant and the search of biological activity.The TAT-ScFv expression vector was successfully constructed, and the relative molecular weight of the fusion protein was 32.7 kDa, which was mainly expressed in soluble form, and the purity reached more than 95%. Intracellular neutralizing antibodies against type B botulinum toxin light chain TAT-ScFv affinity constants for 1.133 + 0.273×106L/mol. The mouse neuronal acetylcholine quantitative determination experiments show that intracellular antibody has better anti toxin activity，which will lay a solid foundation for the type B botulinum toxin in the treatment of intracellular antibody development and treatment of botulism.

transmembrane peptide(TAT);Escherichiacoli; expression; protein purification; activity assay; acetylcholine

吉林省科技發(fā)展計劃資助(20130206012yy)

吉元剛，碩士研究生,從事生物技術(shù)應(yīng)用于基因工程藥物的研究。

張國利。E-mail：zhangguoli2001@126.com

2016-05-31

A

1002-1280 (2016) 07-0001-06

S852.43