SYBR GreenⅠ實時熒光PCR法檢測禽活疫苗中禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒

黃小潔，楊承槐，劉丹，陳曉春，侯力丹，李啟紅，李慧姣，李俊平

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

SYBR GreenⅠ實時熒光PCR法檢測禽活疫苗中禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒

黃小潔，楊承槐，劉丹，陳曉春，侯力丹，李啟紅，李慧姣*，李俊平*

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

為快速、準確檢測禽活疫苗中的禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(REV)，根據(jù)REV p30基因上的一段保守序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計合成了1對特異性引物，建立了基于SYBR Green I 模式的實時熒光PCR 方法，并以常規(guī)PCR產(chǎn)物為標準品繪制了標準曲線，對方法的特異性、敏感性、重復(fù)性、與經(jīng)典方法的符合率進行了評價。結(jié)果表明：擴增產(chǎn)物片段大小為222 bp，與預(yù)期片段大小相符，測序結(jié)果證實為REV靶序列；標準曲線具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為1.0，擴增效率為94.2%，溶解溫度Tm=(86.0±0.50)℃，無引物二聚體；該方法只從REV陽性樣本檢出擴增信號，其他病原無擴增信號，特異性好；最低可檢測26.97拷貝數(shù)的陽性標準品，比常規(guī)PCR敏感1000倍；組內(nèi)變異系數(shù)、組間變異系數(shù)分別為0.79%～5.36%，1.61%～5.25%。運用建立的實時熒光PCR方法對17批禽用活疫苗進行檢測，并與間接免疫熒光法(IFA)進行同步比較試驗，結(jié)果兩者符合率為100%。且實時熒光PCR法更快捷、更方便，結(jié)果判定更為直觀可用于疫苗中REV污染情況的監(jiān)測。

網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒；實時熒光PCR；禽活疫苗

禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥(RE)是指由反轉(zhuǎn)錄病毒科網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(REV)引起的禽類以急性網(wǎng)狀細胞腫瘤、生長抑制綜合癥、淋巴組織和其他組織的慢性腫瘤形成為特征的一群病理綜合癥。REV屬正反轉(zhuǎn)錄病毒科，γ反轉(zhuǎn)錄病毒屬，為單股、正鏈、線性RNA。REVS基因組RNA是由兩個30～40S的RNA亞單位的60～70復(fù)合體組成[1]，分離株存在3個明顯的亞型，網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病病毒 T株(REV-T 株)、脾壞死病毒(SNV)和鴨傳染性貧血病毒(DIAV)、雞合胞體病毒(CSV)[2]，不同毒株具有相同的抗原性。

普遍認為疫苗中污染REV是引起該病傳播和流行的主要原因，而且國內(nèi)外均有因REV污染疫苗引起嚴重損失的案例和報道[3-6]。因此，為了保證病毒性生物制品安全有效，對禽源活疫苗進行REV污染檢測是確保疫苗產(chǎn)品質(zhì)量，防止REV傳播的有效手段。本實驗參考2010年版《中華人民共和國獸藥典》[7]對禽源生物制品外源病毒檢驗的各項檢驗要求，建立了SYBR GreenⅠ實時熒光PCR法以檢測禽活疫苗中禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 REV MD-2株、傳染性法氏囊病毒(IBD)、傳染性支氣管炎病毒(IB)、禽呼腸孤病毒(ARV)、新城疫病毒(NDV)、禽白血病(ALV)病毒均由本實驗室保存。

1.1.2 SPF雞胚 9日齡SPF雞胚購自北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司

1.1.3 主要試劑 高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、蛋白酶K溶液、Top10感受態(tài)細胞購于天根生化科技有限公司；OMEGA總RNA提取試劑盒，購于OMEGA公司；pMD18-T載體、Ex Taq DNA聚合酶、dNTPs、Maker Ⅴ、T4 DNA連接酶；SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒均購自大連寶生物(Takara)工程有限公司；瓊脂糖購自Invitrogen公司；無水乙醇、苯酚、氯仿、異戊醇均購自國藥集團。

1.1.4 其他材料 抗REV特異性血清由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所生產(chǎn)；FITC標記的兔抗雞Ig G購自Sigma公司；SPF雞胚購自梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司。

1.1.5 禽活疫苗樣品 雞痘活疫苗6批(鵪鶉化弱毒株)；雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗2批；雞傳染性法氏囊病活疫苗2批；雞新城疫中等毒力活疫苗(I系)3批；傳染性喉氣管炎活疫苗1批；小鵝瘟活疫苗(GD)株1批；鴨瘟活疫苗1批；雞馬立克氏病火雞皰疹病毒活疫苗1批。

2 方法

2.1 制作雞胚成纖維細胞 參照《中華人民共和國獸藥典》[7]附錄方法制作。

2.2 REV SYBY GreenⅠ實時熒光PCR 的建立

2.2.1 病毒增殖 REV MD-2株接種雞胚成纖維細胞，放于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng), 每隔3 d傳代一次，連傳2代，-80 ℃保存。2.2.2 引物設(shè)計 在p30基因上選取一段保守序列，用Primer Version 5.00軟件設(shè)計引物，由華大基因(中國北京)合成，擴增目的基因片段長度為222 bp。引物序列如下：上游引物：5’-CGAGCGAGAAATAGAAGC-3’；下游引物：5’ -GTCCGATAAGCCTGATAGA-3’。

2.2.3 標準品的制備

2.2.3.1 前病毒DNA提取 用酚-氯仿法[8]提取REV的前病毒DNA。2.2.3.2 PCR擴增 在25 uL體系中進行：反應(yīng)管中依次加入ddH2O 16.3 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，ExTaq酶0.2 μL，病毒DNA 2 μL。反應(yīng)在94 ℃預(yù)變性2 min，然后按以下參數(shù)(變性：94 ℃ 30 s；退火：55 ℃ 30 s；延伸：72 ℃ 30 s)進行30個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸10 min，同時以ddH2O為陰性對照。

2.2.3.3 標準質(zhì)粒制備 將鑒定正確的PCR 產(chǎn)物采用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行純化回收，回收產(chǎn)物與pMD-18T載體進行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(Top10)，通過克隆、篩選，選擇出陽性菌液，送測序，測序正確的的菌液用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒做為標準品。

2.2.3.4 反應(yīng)條件和反應(yīng)體系 參照試劑盒說明采用SYBR Green I 染料法，按照Takara 試劑盒說明推薦的反應(yīng)體系，以最小的Ct 值和最高的熒光值(ΔRn)及熔解曲線不出現(xiàn)非特異性峰、最大程度提高擴增效率為標準，25 uL反應(yīng)體系的條件為：95 ℃ 30 s ；95 ℃ 5 s；55 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s ，共40個循環(huán)，最后進行溶解曲線分析。反應(yīng)體系見表1。

表1 SYBR Green I 實時熒光PCR反應(yīng)體系

2.2.4 標準曲線的建立 分別以經(jīng)過回收純化的標準質(zhì)粒作為標準品，用BECKMAN紫外分光光度計測定標準質(zhì)粒的D260 nm、D280 nm值及在260 nm條件下的核酸濃度，并計算D260 nm與D280nm的比值。根據(jù)濃度與拷貝數(shù)之間的換算關(guān)系:拷貝數(shù)=濃度×阿伏加德羅常數(shù)/(一個堿基對的平均分子質(zhì)量×總長度)，阿伏加德羅常數(shù)為6.02×1023，計算出標準品的拷貝數(shù)。用雙蒸水將標準品進行10倍連續(xù)稀釋，并選取7個稀釋梯度的標準品，進行SYBR Green I實時PCR檢測，構(gòu)建標準曲線。

2.2.5 特異性試驗 使用OMEGA 公司總RNA提取試劑盒提取REV、IBD、IB、ND、ARV 、ALV的RNA，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說明操作將上述RNA合成cDNA，應(yīng)用已建立的SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR方法進行檢測，驗證方法的特異性。

2.2.6 重復(fù)性試驗 選取3批10倍連續(xù)稀釋的6個稀釋梯度的標準品作為模板，應(yīng)用已建立的SYBR GreenⅠ實時熒光PCR方法進行檢測，對同一批次，6個稀釋梯度的標準品進行3次批內(nèi)重復(fù)；不同批次，相同稀釋度的標準品進行3次批間重復(fù)，得出Ct值并計算Ct值的變異系數(shù)CV。

2.2.7 敏感性試驗 取7個稀釋度的標準品，應(yīng)用已建立的SYBR GreenⅠ實時熒光PCR方法在BIO-RAD IQTM5實時熒光定量PCR儀上進行擴增，以出現(xiàn)標準擴增曲線的最高稀釋倍數(shù)的模板Ct值來推算其最小檢出量。

2.3 普通PCR敏感性試驗 用2.1.2建立的常規(guī)PCR方法對2.1.7中7個稀釋度的標準品進行檢測，并與SYBR Green I 實時PCR 檢測結(jié)果進行比較。

2.4 熒光定量PCR法與間接免疫熒光方法(IFA)最低病毒檢出量比較 將REV MD-2株進行10倍連續(xù)稀釋，取0.01 TCID50、0.1 TCID50、1 TCID50、10 TCID50四個梯度病毒含量的病毒接種CEF細胞，放入5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)1～5 d，每天收集上清，分別運用實時熒光PCR法和間接免疫熒光法IFA方法[7]進行檢測，確定兩種方法對病毒的最低檢出量。

2.5 臨床初步應(yīng)用 分別運用建立的SYBR GreenⅠ實時熒光PCR方法和IFA法，對17批禽活疫苗樣品進行檢測，比較兩種方法檢測結(jié)果的符合率。

3 結(jié)果

3.1 病毒PCR擴增結(jié)果 采用設(shè)計的引物對提取的DNA進行常規(guī)PCR擴增，PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠進行電泳，出現(xiàn)222 bp的特異性擴增條帶，與預(yù)計的目的片段大小一致。

M：Marker V；1：REV MD-2株；2：去離子水圖1 MD-2株P(guān)CR擴增結(jié)果

3.2 熒光定量PCR引物的驗證 以標準質(zhì)粒為模板進行實時熒光PCR反應(yīng)，對反應(yīng)產(chǎn)物進行的熔點曲線分析表明，熒光定量PCR產(chǎn)物的Tm=(86.0±0.50)℃，無引物二聚體，只出現(xiàn)了一個特異性的吸收峰(圖2)，該引物反應(yīng)性能良好。

3.3 SYBR Green I 實時熒光PCR擴增曲線和標準曲線 用BECKMAN紫外分光光度計測定標準質(zhì)粒的D260nm/D280nm值為1.99，濃度為65.65 μg/mL，根據(jù)濃度與拷貝數(shù)的換算關(guān)系，標準質(zhì)粒的拷貝數(shù)為2.697×1011copies /μL。3.3.1 標準曲線的構(gòu)建 選取2.697×109～2.697×103copies/μL共7個稀釋梯度的標準品作為模板進行熒光定量PCR反應(yīng)，生成擴增曲線(圖3)。對擴增曲線進行處理繪制出熒光定量反應(yīng)的標準曲線(圖4)，標準曲線公式為y=-3.768x-4.541，其斜率為-3.768，截距為-4.541，相關(guān)系數(shù)為1.0，反應(yīng)擴增效率為94.2%。

1-7：2.697×109～2.697×103 copies/μL標準品圖3 熒光定量PCR擴增曲線

FAM E= 94.2% Squared=1.000 Slope=-3.768 y-Intercept=-4.541圖4 熒光定量PCR標準曲線

3.3.2 特異性試驗結(jié)果 應(yīng)用已建立的熒光定量PCR方法，對REV與IBD、IB、ARV、NDV、ALV一起作為模板進行熒光定量PCR反應(yīng)，結(jié)果表明，只有REV出現(xiàn)了明顯的擴增曲線，其余樣品均沒有出現(xiàn)擴增曲線(圖5)，表明檢測方法的特異性良好。

1：REV 2：IBD 3：IB 4：ARV 5：NDV 6：ALV圖5 熒光定量PCR特異性試驗結(jié)果

3.3.3 重復(fù)性試驗結(jié)果 選取2.697×107～2.697×102copies/μL共6個稀釋梯度的標準品為模板進行熒光定量PCR反應(yīng)，對標準品分別做3次批內(nèi)、批間重復(fù)，獲得擴增曲線(圖6和圖7)。PCR擴增結(jié)束后獲得樣品Ct值，組內(nèi)變異系數(shù)為0.79%～5.36%；組間變異系數(shù)為1.61%～5.25%，符合重復(fù)性實驗要求。

圖6 批內(nèi)重復(fù)試驗結(jié)果

圖7 批間重復(fù)試驗結(jié)果

3.3.4 敏感性試驗結(jié)果 將標準品進行10倍連續(xù)稀釋，取2.697×106～2.697×100copies/μL 7個稀釋度的標準品做為模板，在實時熒光定量PCR儀上進行擴增，結(jié)果顯示，該方法最低可檢出2.697×101copies/μL的標準品(圖8)。3.4 常規(guī)PCR敏感性試驗結(jié)果 常規(guī)PCR對標準品的最低檢出量為2.697×104copies/μL(圖9)，熒光定量PCR的敏感性是常規(guī)PCR的1000倍。

1-7：2.697×106～2.697×100 copies/μL標準品圖8 熒光定量PCR敏感性試驗結(jié)果

1-7：2.697×106～2.697×100copies/μL；8：去離子水；M：Marker V圖9 常規(guī)PCR敏感性試驗結(jié)果

3.5 實時熒光PCR法和IFA方法最低病毒檢出量結(jié)果 實時熒光PCR方法最低能在0.1 TCID50的REV感染CEF細胞后2 d檢出，而IFA方法只能在1 TCID50的REV感染CEF后3 d檢出(表1)。

表1 實時熒光PCR和IFA法最低病毒檢出量結(jié)果

-表示陰性；+表示陽性

3.6 IFA方法檢測疫苗中的REV結(jié)果 有1批疫苗(雞馬立克氏病火雞皰疹病毒活疫苗)出現(xiàn)特異性綠色熒光，其余16批被檢樣品接種孔均未出現(xiàn)特異性綠色熒光(圖10)。

A.陽性樣品檢測結(jié)果; B.陰性樣品檢測結(jié)果圖10 疫苗樣品IFA檢測結(jié)果

3.7 實時熒光PCR法檢測結(jié)果及與IFA方法的檢測結(jié)果比較 圖11顯示，1批雞馬立克氏病火雞皰疹病毒活疫苗樣品經(jīng)實時熒光PCR檢測出現(xiàn)擴增曲線，拷貝數(shù)為9.5×106copies/μL，其余16批疫苗樣品均未出現(xiàn)擴增曲線，與IFA方法檢測結(jié)果一致，符合率達到100%。

1～6：2.697×109～2.697×104copies/μL模板； 7：REV陽性血清； 8：雞馬立克氏病火雞皰疹病毒活疫苗樣品； 9：其他樣品圖11 疫苗樣品熒光定量PCR檢測結(jié)果

4 討論

根據(jù)2010年版《中華人民共和國獸藥典》中外源病毒檢驗要求，我國疫苗外源病毒檢驗主要有雞胚檢查法、細胞檢查法和雞檢查法等三種方法。一般情況下，只需采用雞胚檢查法和細胞檢查法進行外源病毒檢驗，如檢驗無結(jié)果或結(jié)果可疑時，才使用雞檢查法[9]。本實驗室成功建立了REV IFA檢測方法，已被《中國獸藥典》收錄，完善了我國禽活疫苗檢驗方法，為疫苗質(zhì)量監(jiān)管提供有力的技術(shù)手段。然而，此方法需要對疫苗樣品進行中和處理(不同種類疫苗處理方法不同)，接種CEF傳代，再進行IFA檢測，耗時比較長，需要約兩周左右的時間。并且操作過程中，容易出現(xiàn)因洗滌不徹底而存在非特異熒光，影響結(jié)果判定。近年來，實時熒光定量PCR法因其特異性好、靈敏度高、快速簡便、高精度、高通量、易于標準化等優(yōu)點，廣泛被運用于病原檢測研究中。國內(nèi)有采用REV LTR片段設(shè)計引物，建立基于 SYBR Green I 模式的實時熒光 PCR 方法(Real-time PCR SYB)[10]的報道，其敏感性是普通PCR的1000倍。

本研究從p30基因上選取一段片段為222 bp保守片段設(shè)計引物，片段長度適中，符合熒光定量片段擴增的要求。引物特異性好，重復(fù)實驗變異系數(shù)低，敏感性高，與LTR片段相似，敏感性是普通PCR的1000倍，避免了常規(guī)PCR敏感性不高及凝膠成像儀分辨率低等原因造成結(jié)果假陰性的問題。與經(jīng)典的IFA方法比較，實時熒光PCR方法最低能在0.01 TCID50的REV感染CEF細胞后的3 d檢出，而IFA方法只能在1 TCID50的REV感染CEF后的3 d檢出，由此可見，實時熒光PCR方法敏感性高于IFA法。IFA方法不僅耗時長，且步驟繁瑣，檢驗結(jié)果容易受到細胞培養(yǎng)、熒光染色等多種因素的影響。實時熒光PCR法不需要對樣品進行任何處理，直接從樣本中提取RNA，體外反轉(zhuǎn)錄成cDNA即可檢測，可在2 h 內(nèi)對樣品做出定性和定量的檢測和鑒定，整個操作過程一天內(nèi)可完成，結(jié)果可疑當天便可重檢。本試驗運用建立的實時熒光PCR方法對疫苗樣品進行檢測，結(jié)果與IFA方法的檢測結(jié)果完全符合。

綜上所述，實時熒光PCR法操作簡單、快捷，敏感性高，結(jié)果可定量，用于活疫苗REV外源病毒檢測結(jié)果與經(jīng)典方法結(jié)果完全符合，說明運用該方法對活疫苗進行REV外源病毒檢可行性強。本次實驗樣品數(shù)據(jù)比較少，我們將在后續(xù)的實驗中增加樣品檢測量，積累更為豐富的檢測數(shù)據(jù)。

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(編輯：李文平)

Detection of Avian Reticuloendotheliosis Virus of Avian Live Vaccine by SYBR Green Real-time PCR

HUANG Xiao-jie，YANG Cheng-huai，LIU Dan,CHEN Xiao-chun，HOU Li-dan，LI Qi-hong，LI Hui-jiao*，LI Jun-ping*

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China)

In order to detect avian reticuloendotheliosis virus(REV) of avian live vaccine quickly and accurately，a pair of specific primer was designed and synthesized using Primer Premier 5.0 according to conservative sequence of REV p30 gene in this study. The real-time PCR method based on the SYBR Green I pattern(Real-time PCR)was developed.The standard curve was constructed by using the product of conventional PCR,the specificity, sensitivity, reproducibility and the coincidence rate to IFA were evaluated. The result showed that the length of the PCR product was 222 bp as expected and the amplified sequence was approved to be identical with the REV target sequence. The standard curve had a good linear relationship, the correlation coefficient was 1.0 and the amplification efficiency was 94.2%. Melting peak appeared at (86.8±0.5)℃ without primer-dimer. This method only detected amplified signals from REV positive sample,so it was identified to have good specificity. The standard curve covered a linear range of 2.697×109～2.697×103copies. The minimum copy of the positive sample detected was 26.97, 1000 times more sensitive than the conventional PCR. The coefficient of variations (CVs) of intra assay and inter assay were in the range of 4.80%～5.72% and 0.75%～3.87%, respectively. The real-time PCR was used to detect 17 batches of avian live vaccine, comparing with indirecting immunofluorescence(IFA).The results showed that the coincidence rate of these two methods was 100%. This real time PCR method has been proven to be a useful tool for the detection of REV in avian live vaccine because it was more rapid,more convenient and more intuitive.

REV；real-time PCR；avian live vaccine

黃小潔，從事實驗動物管理工作。

李慧姣，E-mail: lihuijiao@ivdc.org.cn;李俊平, E-mail: lijunping@ivdc.org.cn

2015-05-28

A

1002-1280 (2016) 07-0007-07

S855.3