陳凱，李慧，王佳奇，王月亮，宋明銘，丁傳波，李瑩，劉文叢*，鄭毅男, 徐曉華

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院化學(xué)教研室，長春 130118；2.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所制劑中心，北京 100000； 3.吉林大學(xué)中日聯(lián)醫(yī)院， 長春 130031)

響應(yīng)面法優(yōu)化黃連飲片中鹽酸小檗堿提取工藝

陳凱1,2，李慧2，王佳奇1，王月亮1,2，宋明銘1，丁傳波1，李瑩1，劉文叢1*，鄭毅男1, 徐曉華3*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院化學(xué)教研室，長春 130118；2.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所制劑中心，北京 100000； 3.吉林大學(xué)中日聯(lián)醫(yī)院， 長春 130031)

運用Box-Behnken響應(yīng)曲面法設(shè)計料液比、提取次數(shù)、H2SO4濃度及提取時間4因素3水平的試驗?zāi)Ｐ停喳}酸小檗堿的得率為評價指標(biāo)，對黃連飲片中鹽酸小檗堿的提取工藝進行優(yōu)化。優(yōu)選出最佳提取工藝參數(shù)為：H2SO4濃度為3%，料液比為1∶10，提取3次，每次2 h。測定鹽酸小檗堿的得率為8.36%，與預(yù)測值8.30%基本相符合，偏差較小。該工藝穩(wěn)定，可靠，為黃連飲片中鹽酸小檗堿的研究提供了依據(jù)。

黃連飲片；鹽酸小檗堿；響應(yīng)面法

黃連為毛莨科植物黃連(CoptischinensisFranch.)、三角葉黃連(CoptisdeltoideaC.Y.Cheng et Hsial ) 或云連 (CoptisteetaWall.) 的干燥根莖，主要含鹽酸小檗堿、黃連堿、巴馬汀等原小檗堿型生物堿。其中鹽酸小檗堿為主要活性成分，含量高達11.3%[1-3]，對多種革蘭陽性及陰性菌均具有抑制作用，其中，對溶血性鏈球菌，金黃色葡萄球菌，霍亂孤菌、痢疾桿菌有較強的抑制作用，低濃度時抑菌，高濃度時殺菌。多項體外實驗結(jié)果證明小檗堿能夠增強白細菌性痢疾等腸道感染，效果顯著。鹽酸小檗堿是臨床上一種常用的廣譜抗菌藥，主要用于豬、馬、牛、羊菌痢、胃腸炎、癰腫等細菌性感染[4-5]，廣泛用于多種制劑。

黃連中鹽酸小檗堿的含量直接影響其在臨床上的療效，而提取方法是影響其得率的最主要因素。傳統(tǒng)提取小檗堿方法主要有酸法、堿法、醇法3類。目前，將響應(yīng)面法應(yīng)用于優(yōu)化黃連中鹽酸小檗堿酸水提取法的報道相對較少，本文選擇酸水法提取，依據(jù)單因素提取實驗結(jié)果，選取對提取有影響的酸水濃度、提取時間、提取次數(shù)及料液比四個因素，以小檗堿含量為指標(biāo)，采用中心組合設(shè)計-響應(yīng)面法確定最佳酸水提取工藝，并且具有試驗次數(shù)少、精度高的優(yōu)點，以期為提高黃連的利用率提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材 黃連飲片，購于河北安國市昌達中藥材飲片有限公司，自然風(fēng)干，粉碎，過60目篩。

1.1.2 鹽酸小檗堿對照品 批號：110713-201212，純度98%，購于中國食品藥品檢定研究院。

1.1.3 儀器與試劑 LC20AT型高效液相色譜儀(日本島津)；酒精計(河北省滄縣杜生熱工儀表廠)；乙腈(色譜純，F(xiàn)isher 公司)；甲醇(色譜純，F(xiàn)isher公司)；純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 Welch C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相：乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(50：50)(每100 mL中加十二烷基硫酸鈉0.4 g，再以磷酸調(diào)節(jié)pH值為4.0)，流速1 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長為345 nm。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取鹽酸小檗堿對照品5 mg，用甲醇定容于25 mL容量瓶中，分別移取2、4、6、8 mL對照品溶液于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL的對照品溶液。按照 1.2.1項分析條件檢測，進樣量10 μL，以峰面積對質(zhì)量濃度進行線性回歸,計算標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。

1.2.3 鹽酸小檗堿的提取及測定 稱取黃連粉末3.00 g至50 mL圓底燒瓶內(nèi)，稱重，以一定的料液比加入不同濃度的H2SO4溶液進行回流提取后，放冷至室溫，提取數(shù)次后，合并提取液，濾過，取10 μL濾液，按照1.2.1項下的色譜條件進行測定。

1.2.4 單因素實驗

1.2.4.1 最佳H2SO4濃度的篩選 根據(jù)文獻，提取鹽酸小檗堿H2SO4濃度的范圍為2%～5%，選擇了1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%的稀硫酸作為考察的濃度，料液比為1∶8(g/mL)，熱回流提取1 h，濾過，放冷，得供試品溶液，測定，計算鹽酸小檗堿得率。

1.2.4.2 最佳料液比的篩選 選擇H2SO4濃度為3%，料液比分別為1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14(g/mL)，熱回流提取1 h，濾過，放冷，得供試品溶液，測定，計算鹽酸小檗堿得率。

1.2.4.3 最佳提取時間的篩選 選擇H2SO4濃度為3%，料液比為1∶10(g/mL)，分別熱回流提取0.5、1、1.5、2、2.5、3 h，濾過，放冷，得供試品溶液，測定，計算鹽酸小檗堿得率。

1.2.4.4 最佳提取次數(shù)的篩選 選擇H2SO4濃度為3%，料液比為1∶10(g/mL)，分別熱回流提取1、2、3、4、5次(每次提取后將藥液濾除后，按照料液比重新添加溶劑)，每次2 h，濾過，放冷，得供試品溶液，測定，計算鹽酸小檗堿得率。

1.2.5 響應(yīng)曲面分析試驗 綜合單因素試驗結(jié)果，應(yīng)用響應(yīng)曲面分析法對提取工藝進行優(yōu)化。選取4個因素：硫酸濃度，料液比，提取時間及提取次數(shù)，通過Design Expert 8.0.6 軟件，根據(jù)Box-Behnken 試驗設(shè)計原理，對提取工藝進行響應(yīng)面分析。分析因素和水平設(shè)計如表1所示。

表1 響應(yīng)面分析試驗因素與水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系考察 測定不同濃度的鹽酸小檗堿對照品溶液在345 nm下的峰面積，以質(zhì)量濃度X(mg/mL)對峰面積Y繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為Y=3.7076X-3.9048，R2=0.99996，在0.6954～1.9845 μg范圍內(nèi)進樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2 單因素試驗

2.2.1 H2SO4濃度對鹽酸小檗堿得率的影響 由圖1可知，隨著H2SO4濃度的升高，鹽酸小檗堿的得率也隨之增加，當(dāng)H2SO4濃度為3%時，小檗堿的得率達到最高，之后又隨著H2SO4濃度的增加而降低。因此，Box-Behnken 試驗選取的H2SO4濃度的范圍為2.5%～3.5%。

圖1 H2SO4濃度對鹽酸小檗堿得率的影響

2.2.2 料液比對鹽酸小檗堿得率的影響 由圖2可知，隨著料液比的增加，鹽酸小檗堿的得率也隨之增加，當(dāng)料液比為1∶10時，小檗堿的得率達到最高，之后又隨著料液比的增加而降低。因此，Box-Behnken 試驗選取的料液比的范圍為1∶8～1∶12。

2.2.3 提取時間對鹽酸小檗堿得率的影響 由圖3可知，隨著提取時間的增加，鹽酸小檗堿的得率也隨之增加，當(dāng)提取時間為2 h時，鹽酸小檗堿的得率達到最高，之后又隨著提取時間的增加而降低。原因可能為鹽酸小檗堿具有熱不穩(wěn)定性，隨著提取時間的不斷增加，鹽酸小檗堿達到峰值，持續(xù)加熱，使其分解[6-7]，繼而含量降低。因此，Box-Behnken 試驗選取的提取時間的范圍為1～2 h。

圖2 料液比對鹽酸小檗堿得率的影響

圖3 提取時間對鹽酸小檗堿得率的影響

2.2.4 提取次數(shù)對鹽酸小檗堿得率的影響 由圖4可知，隨著提取次數(shù)的增加，鹽酸小檗堿的得率也隨之增加。綜合考慮小檗堿的得率、成本、能源節(jié)約等因素[8-10]，Box-Behnken 試驗選取的提取次數(shù)的范圍為1～3次。

圖4 提取次數(shù)對鹽酸小檗堿得率的影響

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗分析

2.3.1 響應(yīng)面試驗優(yōu)化結(jié)果 由單因素試驗分析，根據(jù)Box-Behnken 中心組合實驗原理設(shè)計了4因素3水平的響應(yīng)面分析方法進行優(yōu)化試驗。1～24 為析因?qū)嶒灒?5～29 為中心試驗，分析方案及實驗結(jié)果見表2。X1表示H2SO4濃度，X2表示料液比，X3表示提取時間，X4表示提取次數(shù)。

2.3.2 建立模型方程與顯著性檢驗 利用Design-Exper8.0.6 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行多元化回歸擬合分析，得到鹽酸小檗堿得率與各因素變量的二次方程模型為：

Y= 8.30+ 0.35X1+ 0.15X2- 0.04X3+

0.1075X4+0.06X1X2+0.07X1X3+

0.043X1X4+0.029X2X3-0.35X2X4-

表2 Box-Behnken 的中心組合方案及響應(yīng)值

表3 回歸方程方差分析表

續(xù)表

注：*表示有顯著影響(P<0.05)；**表示有極顯著影響(P<0.01)

根據(jù)方差分析，響應(yīng)面方程極顯著地表示了Y與X1，X2，X3及X4的關(guān)系，響應(yīng)面方程計算的理論值與實際值的比較見表4。

表4 理論值和實際值的比較

2.3.3 響應(yīng)曲面分析 各兩因素交互作用對鹽酸小檗堿得率影響的響應(yīng)曲面見圖5。A圖為等高線，B圖為其相對應(yīng)的響應(yīng)曲面圖。

圖5 各兩因素交互作用對鹽酸小檗堿影響

2.4 鹽酸小檗堿提取條件驗證試驗 當(dāng)H2SO4濃度為3%，料液比1∶10，提取時間為2 h，提取次數(shù)為3次時，測定鹽酸小檗堿的得率為8.36%，與預(yù)測值8.30%基本相符合，偏差較小。說明得到的回歸方程與實際情況擬合較好，進一步驗證了該模型的可行性。

3 討論與小結(jié)

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)曲面分析對黃連中鹽酸小檗堿的提取工藝進行優(yōu)化，并得到回歸方程。結(jié)果表明，各影響因素對鹽酸小檗堿的影響程度大小依次為H2SO4濃度>料液比>提取時間>提取次數(shù)。料液比和提取次數(shù)對鹽酸小檗堿得率的交互影響最為顯著。經(jīng)回歸分析并結(jié)合實際條件確定黃連中鹽酸小檗堿最佳提取工藝為H2SO4濃度為3%，料液比1∶10，提取時間為2 h，提取3次，測定實際鹽酸小檗堿得率為8.36%，與預(yù)測值8.30%相符。據(jù)文獻報道，肖美鳳等[13]用正交實驗法對黃連中小檗堿提取工藝進行優(yōu)選，小檗堿的得率為6.72%；孫波等[14]就水提法部分進行正交優(yōu)選， 確定水提法用水煎煮3次，3.5 h，加水量14倍為最佳工藝，小檗堿得率為5.28%；呂霞等[15]報道用0.5%硫酸水溶液提取黃連中小檗堿，分別采用索氏提取、超聲提取和浸漬提取，HPLC法分析小檗堿濃度分別為16.401、14.246、 13.415 μg/mL。與浸漬提取方法相比，本研究相對省時，較超聲方法提取的更加完全，且本研究鹽酸小檗堿的得率相對較高。實驗結(jié)果說明該回歸方程可以較好預(yù)測實驗結(jié)果。因此，選擇響應(yīng)曲面法來優(yōu)化黃連中鹽酸小檗堿的提取工藝是可行的。

鹽酸小檗堿遇高溫易被破壞[16-17]，并且受熱時間延長，可致黃連中其他生物堿分解[18-20], 因此，在處理樣品全過程中應(yīng)盡量避免高溫。低溫時，生物堿較穩(wěn)定[21-23]，室溫貯藏一段時間后總生物堿含量基本保持不變。

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(編輯：侯向輝)

Optimization of Extract Process for Berberine Hydrochloride in Coptis chinensis Franch. by Response Surface Methodology

CHEN Kai1,2, LI HUI2,WANG Jia-qi1, WANG Yue-liang1,2,SONG Ming-ming1, DING Chuan-bo1, LI Ying1,LIU WEN-cong1*,ZHENG Yi-nan1, XU Xiao-hua3*

(1JilinAgriculturalUniversityCollegeofTraditionalChineseMedicine，Changchun130118 ,China；2.InstituteofChineseMateriaMedica,ChineseAcademyofMedicalSciences,Beijing100700,China; 3.China-JapanFriendshipHospitalAffiliatedJilinUniversity,Changchun130031,China)

To optimize the conditions for purification of berberine hydrochloride inCoptischinensisFranch, Box-behnkn response surface method was used to design the test modls with four factors including liquid ratio, extraction times, H2SO4concentration and extraction time at three levels based on the single factor experiment, and the pureness of berberine hydrochloride was used as the evaluation index, to optimize purification process of berberine hydrochloride.The optimal purification conditions were determined as extracted three times for 2 h, at a solid-liquid ratio was 1∶10, and the H2SO4concentration was 3%. The determination of berberine hydrochloride at a rate of 8.36%,and the predictive value of 8.30% conforms to the basisi deviation is smaller. The process is stable and reliable,and the results of the study can provide scientific basis for the determination of the purification process of extraction of berberine hydrochloride inCoptischinensisFranch.

CoptischinensisFranch; berberine hydrochloride; response surface methodology

中國中醫(yī)科學(xué)院自主選題(Z02063) ；2009年中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(200907001-5)

陳凱，在讀碩士，從事中藥制劑評價與新藥研發(fā)。

劉文叢。E-mail:jwlw6803@126.com; 徐曉華。E-mail: xuxiaohua681002@qq.com

2016-01-24

A

1002-1280 (2016) 04-0021-08

R931.6