侯軒，朱聰英，應(yīng)永飛，陸春波，周煒，張航俊

(浙江省獸藥飼料監(jiān)察所，杭州 310000)

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定飼料中地克珠利的含量

侯軒，朱聰英，應(yīng)永飛，陸春波，周煒，張航俊

(浙江省獸藥飼料監(jiān)察所，杭州 310000)

建立了一種測(cè)定飼料中地克珠利的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法。以乙腈提取樣品中的待測(cè)物，正己烷除脂，離心后用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，選擇多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)、負(fù)離子模式進(jìn)行定性和定量分析。結(jié)果表明，地克珠利在0.5～100 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)≥0.999，檢出限為0.1 μg/kg，定量限為0.5 μg/kg。地克珠利在0.5、1和5 μg/kg三個(gè)添加水平下，三種飼料的平均加標(biāo)回收率在79.2%～94.5%之間，相對(duì)偏差在1.7%～14.3%之間。本方法抗干擾能力強(qiáng)，操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，適用于飼料中地克珠利的測(cè)定。

飼料；地克珠利；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

地克珠利(DIC)為類白色或淡黃色粉末，屬于三嗪類抗球蟲藥，具有高效抗球蟲能力，廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)中，尤其在防治雞球蟲病方面有著重大意義[1]。地克珠利具有低毒、廣譜、用量小、無(wú)交叉耐藥性等特點(diǎn)。2015年1月14日，歐盟發(fā)布法規(guī)(EU)2015/46，批準(zhǔn)地克珠利作為雞和兔飼料添加劑使用，預(yù)混合劑添加量為5 g/kg，且不應(yīng)與其他抗球蟲藥混合使用。我國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第168號(hào)飼料藥物添加劑使用規(guī)范中規(guī)定，地克珠利預(yù)混合劑每1 kg飼料中含地克珠利2 g或5 g，全飼料添加量為1 g/1000 kg，蛋雞產(chǎn)蛋期禁用。在國(guó)內(nèi)，地克珠利作為獸用藥物從1996年開始大規(guī)模使用[2]，但是在地克珠利應(yīng)用的過(guò)程中，濫用藥物、不遵守休藥期等不合理的使用情況較為嚴(yán)重，易引發(fā)球蟲耐藥性，帶來(lái)一系列獸藥殘留問(wèn)題。因此從源頭出發(fā)，對(duì)飼料中地克珠利的含量進(jìn)行監(jiān)測(cè)顯得勢(shì)在必行。

目前對(duì)地克珠利檢測(cè)研究多有報(bào)道。針對(duì)雞肉樣品，施祖灝等[3]建立了雞組織中地克珠利和妥曲珠利殘留HPLC檢測(cè)方法，蘇曉紅等[4]利用MISPE技術(shù)，采用高效毛線管電泳技術(shù)建立雞肉中地克珠利的殘留分析方法；De等[5]建立液相色譜法對(duì)飼料中地克珠利進(jìn)行檢測(cè)，Mortier L等[6]、趙岳等[7]均選擇固相萃取裝置對(duì)飼料樣本進(jìn)行凈化，液質(zhì)聯(lián)用法進(jìn)行檢測(cè)。本研究針對(duì)三種飼料樣本，對(duì)儀器條件及前處理方法進(jìn)行優(yōu)化，成功建立了一種快速有效監(jiān)測(cè)飼料中地克珠利含量的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 高效液相色譜儀(LC 30A，島津公司)、串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀(TRIPLE QUAD 4500， ABSCIEX公司)；電子天平(XS-205，Mettler公司)；電子天平(SL502 N，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)；氮吹儀(N-EVAP，Organomation公司)；冷凍離心機(jī)(3-18k ，Sigma公司)；振蕩器(ZD-8800，華立達(dá)公司)。

1.2 藥品與試劑 地克珠利標(biāo)準(zhǔn)品( H0130805，含量≥99.7%，100 mg，購(gòu)于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)，甲醇、甲酸、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺(色譜純，購(gòu)于默克公司)，乙腈(分析純，購(gòu)于上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)。

1.3 溶液配制

1.3.1 地克珠利標(biāo)準(zhǔn)貯備液的配制 準(zhǔn)確稱取適量地克珠利標(biāo)準(zhǔn)品，用N,N-二甲基甲酰胺溶解配制成100 μg /mL，4 ℃保存，有效期1個(gè)月。

1.3.2 地克珠利標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制 準(zhǔn)確量取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用甲醇稀釋成10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，4 ℃保存，有效期1個(gè)月。1.3.3 地克珠利基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液的配制 分別取空白配合飼料、預(yù)混合飼料和濃縮飼料按樣品前處理方法進(jìn)行處理后，在洗脫溶液中加入適當(dāng)體積標(biāo)準(zhǔn)工作溶液混合，使之成0.5、1.0、10、50、100 ng/mL基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)上機(jī)液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4 方法

1.4.1 儀器條件

1.4.1.1 色譜條件 用十八烷基鍵合硅膠色譜柱(Waters C18 3 μm， 3.0×150 mm)，以0.2%甲酸水溶液為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，按表1進(jìn)行梯度洗脫，流速為0.3 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量5 μL。

表1 梯度洗脫程序表

1.4.1.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源；負(fù)離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)，離子源電壓：4500 V；碰撞氣能量：高；輔助加熱氣溫度：500 ℃；氣簾氣流速：10 L/h；離子源氣流流速：Gas1 為50 L/h，Gas2為50 L/h。目標(biāo)化合物MRM參數(shù)見表2。

表2 地克珠利多反應(yīng)監(jiān)測(cè)條件

DP：去簇電壓，EP：碰撞室入口電壓，CE：碰撞能量，CXP：碰撞室出口電壓，333.9*為定量離子

1.4.2 樣品前處理 稱取樣品2 g(精確到0.05 g)于50 mL離心管中，加入15 mL乙腈，300 r/min振蕩提取10 min，10000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至另一50 mL離心管中，殘?jiān)?5 mL乙腈重復(fù)提取一次，合并兩次上清液，50 ℃氮?dú)獯蹈伞＜尤?.2%甲酸乙腈和正己烷各2 mL，渦旋1 min，10000 r/min離心取下層，過(guò)0.22 μm微孔濾膜后液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

1.4.3 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 取空白配合飼料、預(yù)混合飼料和濃縮飼料按1.3.3項(xiàng)處理，所得溶液過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，HPLC-MS/MS分析。以藥物濃度為橫坐標(biāo)，地克珠利定量離子峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.4 樣品添加回收率、準(zhǔn)確度和精密度測(cè)定 分別對(duì)配合、預(yù)混合和濃縮飼料進(jìn)行0.5、1.0、5.0 μg/kg的藥物空白添加回收實(shí)驗(yàn)，按1.4.2項(xiàng)前處理后進(jìn)行HPLC-MS/MS檢測(cè)。每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)平行，連續(xù)做3 d，計(jì)算添加回收率、日內(nèi)變異系數(shù)和日間變異系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化 為了獲得更高的離子強(qiáng)度，在MRM模式下優(yōu)化質(zhì)譜條件，確定了地克珠利在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下信號(hào)采集的特征離子對(duì)，具體監(jiān)測(cè)條件列于表2。

2.2 液相色譜條件優(yōu)化 為了獲得較好的色譜峰型，本文對(duì)色譜柱及流動(dòng)相進(jìn)行了優(yōu)化。采用1.4.1.1項(xiàng)所述色譜柱及流動(dòng)相條件，色譜行為良好，能滿足檢測(cè)要求。從標(biāo)準(zhǔn)品、加標(biāo)樣品的MRM色譜圖(圖1～圖3)可見，在待測(cè)藥物出峰的位置沒有雜質(zhì)干擾。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品的MRM圖(濃度1.0 μg/L)

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限及定量限 按1.4.2項(xiàng)處理三種空白飼料樣品后，高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)，以峰面積作為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由表3可知，在濃度為0.5～100 ng/mL濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，r>0.999，取信噪比S/N=3的樣品濃度為方法檢出限(LOD)，取信噪比S/N=10 的樣品濃度為方法定量限(LOQ)。

a：配合飼料 b：預(yù)混合飼料 c：濃縮飼料圖2 空白飼料的MRM圖

a：配合飼料 b：預(yù)混合飼料 c：濃縮飼料圖3 空白飼料添加樣品的MRM圖(地克珠利濃度1.0 μg/kg)

2.4 方法的回收率、精密度 在0.5、1.0、5.0 μg/kg濃度添加水平下對(duì)配合、預(yù)混合和濃縮飼料進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)平行，連續(xù)做3 d，計(jì)算添加回收率、日內(nèi)變異系數(shù)和日間變異系數(shù)，結(jié)果見表4。

由表4可見，配合飼料、預(yù)混合飼料、濃縮飼料中，地克珠利平均回收率在79.2%～94.5%之間，日內(nèi)變異系數(shù)、日間變異系數(shù)均小于15%，方法回收率高，精密度好。

表3 配合飼料、預(yù)混合飼料和濃縮飼料中地克珠利基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限和定量限

表4 地克珠利回收率及日內(nèi)、日間變異系數(shù)

3 討論與小結(jié)

3.1 色譜條件優(yōu)化 地克珠利色譜條件在多篇文獻(xiàn)中均有研究。楊麗萍等[8]選用乙睛∶0.1%乙酸(65∶35，V/V)等度洗脫，Ai等[9]選用乙睛∶0.1%乙酸(55∶45，V/V)，流速為等度洗脫，羅浩師等[10]選用乙睛∶0.1%甲酸梯度洗脫，劉永濤等[11]選用乙腈∶0.3%乙酸(45∶55，V/V)等度洗脫，考慮到地克珠利離子化效率以及快速檢測(cè)目的，本試驗(yàn)對(duì)色譜流動(dòng)相進(jìn)行了研究，經(jīng)過(guò)優(yōu)化條件，最后采用乙腈-0.2%甲酸水按表1梯度洗脫，地克珠利在5 min左右出峰并且峰形尖銳，達(dá)到良好的洗脫效果。

3.2 定量、定性離子的確定 根據(jù)歐盟對(duì)殘留鑒定的技術(shù)文件規(guī)定，采用液質(zhì)聯(lián)用法確證動(dòng)物源食品中的殘留物質(zhì)需要獲得4個(gè)鑒定分(1個(gè)母離子為1.0分，1個(gè)子離子為1.5分)。地克珠利的分子結(jié)構(gòu)中含有3個(gè)同位素氯，具有多個(gè)明顯的氯離子同位素峰，根據(jù)各天然同位素所占比例的不同，試驗(yàn)最終選擇豐度最高的m/z405.0和m/z406.9兩個(gè)離子為母離子，之后通過(guò)對(duì)碰撞能量和碰撞室出口電壓的選擇優(yōu)化，選擇m/z333.9和m/z335.8兩個(gè)子離子分別作為各自的子離子，由于m/z333.9響應(yīng)值較高，因此作為地克珠利的定量離子。這樣共獲得5個(gè)確證分，滿足歐盟對(duì)殘留物的確證檢測(cè)要求。

3.3 樣品前處理方法的優(yōu)化 Mortier L等[6]采用0.1%甲酸乙腈提取雞肉和飼料基質(zhì)中的樣品，濃縮提取后，用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量；趙岳等[7]在測(cè)定雞飼料中地克珠利含量時(shí)，采用硅膠固相萃取柱進(jìn)行凈化后上機(jī)檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)研究，省去固相萃取凈化步驟，而是在樣品復(fù)溶的同時(shí)加入正己烷進(jìn)行提脂凈化，最后取下層澄清溶液上機(jī)檢測(cè)，結(jié)果可見空白樣品基線清晰，加標(biāo)樣品峰形銳利且無(wú)其他雜峰干擾，采用外標(biāo)法定量，回收率在79.2%～94.5%之間，能夠滿足檢測(cè)要求。

本實(shí)驗(yàn)建立的飼料中地克珠利HPLC-MS/MS檢測(cè)方法，地克珠利的回收范圍為79.2%～94.5%，日內(nèi)變異系數(shù)范圍為1.7%～9.0%，日間變異系數(shù)范圍為3.0%～14.3%，檢測(cè)限為0.1 μg/kg，定量限為0.5 μg/kg。該方法優(yōu)化了前處理?xiàng)l件，操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)方法靈敏度高，重現(xiàn)性強(qiáng)，符合獸藥殘留分析性能要求，可用于日常樣品分析。

[1] 周變?nèi)A, 王宏偉, 薛飛群, 等. 地克珠利抗雞球蟲作用機(jī)理研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)家禽, 2011, 33(21): 40-42.

[2] 才鳳峰. 雞球蟲病的防治—抗球蟲藥的使用[J].中國(guó)家禽, 2004, 26(6): 30-34.

[3] 施祖灝, 朱良強(qiáng), 盧運(yùn)站, 等. 雞組織中地克珠利和妥曲珠利殘留 HPLC 檢測(cè)方法的建立[J]. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2009, 29(1): 79-81.

[4] 蘇紅曉. 動(dòng)物源性食品及環(huán)境中抗球蟲藥物殘留分析技術(shù)的研究[D]. 合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué), 2013.

[5] Jan De Kock, Maurits De Smet, Rudy Sneyers. Determination of diclazuril in animal feed by liquid chromatography[J]. Journal of chromatography A, 1992, 606(1): 141-146.

[6] Leen Mortier, Els Daeseleire, Carlos Van Peteghem. Determination of the coccidiostat diclazuril in poultry feed and meat by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Analytica chimica acta, 2005, 529(1): 229-234.

[7] 趙岳，沈建忠，程林麗，等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定雞飼料中地克珠利的含量[J]. 中國(guó)飼料, 2012,(3):36-39.

[8] 楊麗萍，高淑霞，孫海濤，等. 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法研究地克珠利在家兔組織中殘留及消除規(guī)律[J]. 畜牧與飼料科學(xué), 2011, (12): 6-9.

[9] Lianfeng Ai, Hanwen Sun, Fengchi Wang,etal. Determination of diclazuril, toltrazuril and its two metabolites in poultry tissues and eggs by gel permeation chromatography-liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Journal of chromatography B, 2011, 879(20): 1757-1763.

[10]羅浩師，張麗芳，薛飛群. 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定雞脂肪中地克珠利殘留量[J]. 中國(guó)家禽, 2012, 34(20): 14-17.

[11]劉永濤，艾曉輝，李樂，等. 超高效液相色譜法測(cè)定魚體組織中地克珠利殘留量[J]. 分析試驗(yàn)室, 2014,(4):420-423.

(編輯：侯向輝)

Determination of Diclazurilin Feeds by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

HOU Xuan，ZHU Cong-ying，YING Yong-fei，LU Chun-bo，ZHOU Wei，ZHANG Hang-jun

(ZhejiangProvincialSupervisoryInstituteofVeterinaryDrug，Hangzhou310000，China)

An analytical HPLC-MS/MS method was established for determination of diclazuril in feeds. The samples were extracted with acetonitrile, then defatted with n-hexane. The treated samples were analyzed by HPLC-MS/MS after centrifuged. The analysis was performed with Multi Reaction Monitor(MRM) in negative ion mode. The results indicated good lineartites in the concentration range from 0.5 to 100 ng/mL for diclazuril, the correlation coefficient was over 0.999. The limit of detection(LOD) and the limit of quantitation(LOQ) were 0.1 and 0.5 μg/kg,respectively. While the spiked contents of diclazuril standard at 0.5,1,5 μg/kg, the recoveries and relative standard deviations(RSD) were in range of 79.2%～94.5% and 1.7%～14.3%,respectively. With the advantages of good anti-interference ability, rapidness and sensitivity, the method adapted to the determination of diclazuril in feeds.

feeds; diclazuril; HPLC-MS/MS

侯軒，碩士研究生，從事獸藥和畜產(chǎn)品質(zhì)量安全相關(guān)檢測(cè)研究。E-mail：zjmy607@sina.com

2016-01-08

A

1002-1280 (2016) 04-0057-05

S859.2