黃宇翔，劉力威，王志強(qiáng)，張軍，鄒越，楊旭東，李洪彬

(黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所， 黑龍江齊齊哈爾 161006 )

鵝細(xì)小病毒滅活疫苗種子批建立

黃宇翔，劉力威，王志強(qiáng)，張軍，鄒越，楊旭東，李洪彬

(黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所， 黑龍江齊齊哈爾 161006 )

為保證制苗所用毒種質(zhì)量和穩(wěn)定性，在對(duì)制苗毒種病毒含量、病毒純凈性、特異性、免疫原性及擴(kuò)繁代次等研究的基礎(chǔ)上，建立了鵝細(xì)小病毒滅活疫苗毒種種子批。試驗(yàn)使用鵝胚對(duì)鵝細(xì)小病毒YA98株進(jìn)行了20次傳代。傳代毒種的鑒定結(jié)果表明：抽檢的各代次的毒種均無(wú)細(xì)菌、支原體、外源病毒污染，且病毒含量檢測(cè)穩(wěn)定，每0.3 mL 含104.78～4.85ELD50；各代次特異性檢測(cè)均能被鵝細(xì)小病毒抗血清中和；將各代次病毒液制成滅活疫苗，免疫成鵝后均能產(chǎn)生完全保護(hù)。以此為依據(jù)，最終確定原始毒種和基礎(chǔ)毒種的擴(kuò)繁代次宜控制在5代以?xún)?nèi)，生產(chǎn)毒種的最高擴(kuò)繁代次宜控制在15代以?xún)?nèi)。種子批的建立，為鵝細(xì)小病毒滅活疫苗的生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

種子批建立；YA98株；培養(yǎng)特性；特異性

鵝細(xì)小病毒(Goose parvovirus, GPV)病又稱(chēng)小鵝瘟(Gosling plague)，是由鵝細(xì)小病毒引起的急性或亞急性的敗血性傳染病[1]，對(duì)雛鵝具有高度的致死性，給養(yǎng)鵝業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，疫苗接種仍是控制小鵝瘟的主要措施之一[2]?，F(xiàn)有疫苗為活疫苗，在小鵝瘟的防疫中起到了良好的效果，由于，在小鵝瘟病發(fā)生流行的地區(qū)，種、雛鵝都存在水平不一的相應(yīng)抗體，對(duì)現(xiàn)有活疫苗的接種免疫起到了中和、干擾，使活疫苗不能正常發(fā)揮免疫作用。因此，研制出不受殘余抗體干擾的油乳劑滅活疫苗，對(duì)小鵝瘟病防治將起到更好的效果。

強(qiáng)毒株因有較好的免疫原性，被廣泛用于滅活疫苗的制備[3]。近年，國(guó)內(nèi)分離的鵝細(xì)小病毒有十余株，但用于鵝細(xì)小病毒滅活疫苗的研究不是很多，目前還沒(méi)有研制出鵝細(xì)小病毒滅活疫苗正規(guī)產(chǎn)品。研究表明，小鵝瘟病毒只有一個(gè)血清型，不同毒株具有相同的抗原性，能起到免疫交叉保護(hù)作用，由于各毒株的培養(yǎng)特性存在一定的差異，將導(dǎo)致免疫原性存在著一定的差異，以至臨床免疫動(dòng)物后產(chǎn)生的抗體效價(jià)參差不齊。因此，具有較強(qiáng)的毒力和免疫原性的優(yōu)質(zhì)毒株，是制備疫苗的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定的鵝細(xì)小病毒YA98株，經(jīng)動(dòng)物回歸試驗(yàn)(前期試驗(yàn))表明，毒力較強(qiáng)，經(jīng)鵝胚傳代，得到了鵝胚適應(yīng)毒[4-5]。與國(guó)內(nèi)近年分離的8株鵝細(xì)小病毒VP3基因核苷酸和推導(dǎo)氨基酸同源性比較[6]，核苷酸同源性為93.0%～97.9%，推導(dǎo)的氨基酸同源性為96.8%～99.7%，毒株的親緣性很近。應(yīng)用該毒株病毒制備滅活疫苗，通過(guò)本動(dòng)物免疫攻毒試驗(yàn)表明，對(duì)后代雛鵝完全包保護(hù)，可作為鵝細(xì)小病毒滅活疫苗的制苗用種毒。本試驗(yàn)在對(duì)GPV YA98株傳代培養(yǎng)以及對(duì)各代次的生物學(xué)特性和免疫原性的研究基礎(chǔ)上，建立了種子批，以期為小鵝瘟滅活疫苗生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 毒種 小鵝瘟病毒YA98株，鵝細(xì)小病毒強(qiáng)毒(HH98株)，由黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所鑒定保存。

1.2 鵝胚 12日齡易感鵝胚，在孵化前用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)同批鵝蛋的卵黃抗體，小鵝瘟抗體呈陰性。

1.3 鵝只 120日齡健康鵝，試驗(yàn)前用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)血清，小鵝瘟抗體呈陰性。

1.4 小鵝瘟陽(yáng)性血清 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)王君偉教授惠贈(zèng)。

1.5 種子批的建立 試驗(yàn)以前期經(jīng)過(guò)系統(tǒng)鑒定確認(rèn)具有良好免疫原性、繁殖特性、特異性和純凈性的YA98毒株為原始種子，將原始種子用滅菌生理鹽水作10倍稀釋?zhuān)蚰仪唤臃N12日齡易感鵝胚連續(xù)傳代，每胚0.3 mL，收取各代次48～120 h死亡鵝胚液，進(jìn)行病毒培養(yǎng)特性、病毒含量、特異性、免疫原性、病毒純凈性及保存期試驗(yàn)。將檢驗(yàn)合格的鵝胚液與凍干保護(hù)劑1∶1混合均勻，進(jìn)行定量分裝，各代次命名為YA98F1～20。抽取原始毒種、YA98F3、YA98F5、YA98F7、YA98F10、YA98F12、YA98F15、YA98F20凍干后產(chǎn)物用于后續(xù)檢驗(yàn)，依據(jù)檢驗(yàn)結(jié)果建立種子批。

1.6 培養(yǎng)特性 將毒種用滅菌生理鹽水作10倍稀釋?zhuān)?jīng)尿囊腔內(nèi)接種12日齡易感鵝胚10枚，每胚0.3 mL，置37～38 ℃繼續(xù)孵育，觀察并記錄鵝胚接種后24～168 h死亡與剖檢情況。

1.7 病毒含量 隨機(jī)抽取10%凍干產(chǎn)品，用滅菌生理鹽水作10倍系列稀釋?zhuān)?0-2、10-3、10-4、10-54個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度，經(jīng)尿囊腔接種12日齡鵝胚，5枚，每胚0.3 mL，置37 ℃孵育觀察168 h，24 h前死亡鵝胚不計(jì)，記錄24～168 h鵝胚死亡情況，計(jì)算ELD50。1.8 特異性 將毒種稀釋至病毒含量為200 ELD50/0.3 mL，與等量抗小鵝瘟病毒特異性血清混合，置37 ℃水浴中和1 h后，尿囊腔接種12日齡易感鵝胚5枚，每胚0.3 mL；同時(shí)設(shè)病毒對(duì)照組5枚，每胚接種同條件處理的病毒液和生理鹽水混合液0.3 mL，37 ℃孵育觀察168 h，記錄24～168 h鵝胚死亡情況，并取病毒液做雞紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)(HA)。

1.9 免疫原性 將甲醛滅活后的含毒尿囊液與油相按1∶1制備油乳劑滅活疫苗。肌肉接種120日齡易感鵝10只(公、母比例為1∶4)，每只1 mL，于接種疫苗后的28日，連同對(duì)照鵝5只，分別采血，分離血清，測(cè)定鵝細(xì)小病毒的瓊擴(kuò)抗體(AGP)效價(jià)。并收集種蛋孵育后代雛鵝，于3日齡進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)，試驗(yàn)組與對(duì)照組各皮下接種鵝細(xì)小病毒強(qiáng)毒(HH98株)病毒液,每組10只，每只0.2 mL。觀察10日，統(tǒng)計(jì)保護(hù)率。

1.10 純凈性檢查 無(wú)菌檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)、外源病毒檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》方法[7]進(jìn)行。1.11 毒種保存期試驗(yàn) 抽檢保存時(shí)間分別為2年、3年、4年的YA98F5、YA98F10、YA98F15三個(gè)代次的毒種，經(jīng)鵝胚培養(yǎng)復(fù)壯，測(cè)定ELD50。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)特性 將原始毒種、YA98F3、YA98F5、YA98F7、YA98F10、YA98F12、YA98F15、YA98F20抽檢樣品，在接種鵝胚后72～168 h，各批次病毒均致8枚以上鵝胚死亡，剖檢死亡胎兒，頭部、頸部及絨毛尿囊膜呈明顯水腫，胚頭、頸部、胸部、爪、翅尖及喙旁均有出血，病變特征明顯。對(duì)鵝胚培養(yǎng)特性穩(wěn)定。

2.2 病毒含量 結(jié)果見(jiàn)表1。各代次病毒含量的測(cè)定結(jié)果都在104.7ELD50/0.3 mL以上，表明連續(xù)傳代20次時(shí)各代次毒株對(duì)凍干處理的耐受能力未發(fā)生明顯改變。

表1 鵝胚半數(shù)致死量(ELD50)的測(cè)定結(jié)果

2.3 特異性檢驗(yàn) 結(jié)果見(jiàn)表2。各代次病毒均能被抗小鵝瘟血清中和，接種鵝胚全部存活，且各代次病毒液做雞紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)，均無(wú)血凝性，符合小鵝瘟病毒特性。

表2 病毒特異性鑒定結(jié)果

分母為試驗(yàn)鵝胚數(shù)，分子為存活鵝胚數(shù)

2.4 免疫原性 結(jié)果見(jiàn)表3?？梢钥闯觯鞔蚊庖呖贵w效價(jià)無(wú)明顯差異，免疫組血清抗體效價(jià)≥1∶1，連續(xù)傳代未影響免疫效果，對(duì)后代雛鵝有良好保護(hù)作用，有效保護(hù)率可達(dá)90%。

表3 免疫原性試驗(yàn)結(jié)果

“-”表示檢驗(yàn)結(jié)果為陰性

2.5 純凈性檢驗(yàn) 結(jié)果顯示：檢測(cè)的各代次種毒，分別接種于三種培養(yǎng)基中，進(jìn)行細(xì)菌和霉菌檢驗(yàn)，結(jié)果均無(wú)細(xì)菌和霉生長(zhǎng)；在液體和固體兩種培養(yǎng)基上進(jìn)行的支原體檢驗(yàn)也均未見(jiàn)支原體生長(zhǎng)；各代次種毒外源病毒檢驗(yàn)，分別進(jìn)行了雞胚和細(xì)胞檢驗(yàn)，結(jié)果均未檢測(cè)到外源病毒(表4)，各代次種毒純凈。

表4 外源病毒檢驗(yàn)(雞胚和細(xì)胞檢查法)結(jié)果

“-”表示紅細(xì)胞凝集陰性

2.6 基礎(chǔ)種毒保存期測(cè)定 將-70 ℃保存2年、3年、4年的YA98F5 、YA98F10、YA98F15種毒(凍干毒)取出，接種12日齡鵝胚，測(cè)定ELD50，并與保存前的結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表5?？梢钥闯?，凍干毒種于-70 ℃經(jīng)4年保存，種毒的病毒含量未見(jiàn)降低。

表5 基礎(chǔ)種毒保存期測(cè)定結(jié)果

3 小結(jié)

通過(guò)對(duì)YA98株各代次凍干種毒的病毒含量測(cè)定、純凈性、特異性和免疫原性等鑒定證明，各代次病毒傳代穩(wěn)定；純凈性檢驗(yàn)均無(wú)細(xì)菌、霉菌、支原體和外源病毒污染；特異性檢驗(yàn)均能夠被小鵝瘟抗血清特異性中和；各代次病毒制成滅活疫苗免疫動(dòng)物后，均能夠產(chǎn)生完全的攻毒保護(hù)，以此為依據(jù)，建立了毒種的種子批，確定原始毒種和基礎(chǔ)毒種的擴(kuò)繁代次宜控制在5代以?xún)?nèi)，適宜的保存方法和保存期為-70 ℃保存3年；生產(chǎn)毒種的最高擴(kuò)繁代次宜控制在15代以?xún)?nèi)，適宜的保存方法和保存期為-70 ℃保存3年。

本試驗(yàn)種子批的建立可為小鵝瘟滅活疫苗的研制,以及將來(lái)的規(guī)?；a(chǎn)提供穩(wěn)定、可靠的生產(chǎn)用種毒。

[1] B W 卡爾尼克.禽病學(xué)[M]. 高 褔,主譯. 第10版. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1999.

[2] 費(fèi)恩閣，李德昌，丁 壯.動(dòng)物疫病學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2004.[3] 寧宜寶.獸用疫苗學(xué)[M].第1版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2008.

[4] 黃宇翔，劉力威，李洪彬，等.鵝細(xì)小病毒、鵝副黏病毒流行病學(xué)調(diào)查及病原分離鑒定[J].中國(guó)家禽，2013，(2)：22-26.

[5] 黃宇翔，李洪彬，劉力威，等.鵝細(xì)小病毒的分離鑒定與生物學(xué)特性研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2008，(2)：77-78.

[6] 王志強(qiáng)，劉力威，楊旭東，等.鵝細(xì)小病毒VP1-VP3非重疊區(qū)基因的克隆與序列分析[J].中國(guó)家禽，2011，(19)：28-31.

[7] 中國(guó)獸藥典委員會(huì).中國(guó)人民共和國(guó)獸藥典二0一0年版三部[S].

(編輯：李文平)

The Seed Lots Built of Goose Parvovirus Inactivated Vaccine Candidate

HUANG Yu-xiang, LIU Li-wei, WANG Zhi-qiang, ZHANG Jun, ZOU Yue, YANG Xu-dong,LI Hong-bin

(HeilongjiangInstituteofVeterinaryScience,Qiqihar,Heilongjiang161006,China)

In order to ensure vaccine-made virus seed quality and stability, we established a goose parvovirus inactivated vaccine virus seed lot, on the research basis of vaccine-made virus seed virus content, virus pure, specific, immunogenicity and expanding propagation generations. The goose parvovirus YA98 strain was propagated and passaged 20 generations on goose embryo. Passage of virus identification results showed that there were not found bacteria, mycoplasma, contamination with exogenous virus in sampling of each propagation generations virus; and virus content test was stable, containing 104.78～4.85ELD50per 0.3 mL; and it can be neutralized by goose parvovirus antiserum in specific detection; when it was made inactivated vaccine to inject geese, they could produce complete protection. On this basis, we ultimately determined that the propagation generations of the original virus and virus should be controlled within 5 ones and the highest propagation generation of production virus should be controlled within 15 ones. The establishment of the seed lot laid the foundation for the goose parvovirus inactivated vaccine production.

seed lots built; strain YA98; culture characteristics; specificity

黃宇翔，碩士，研究員，從事家畜傳染病防治及相關(guān)生物制品的研究。E-mail：huangyuxiang-2007@163.com

2015-11-05

A

1002-1280 (2016) 04-0011-05

S858.33