畢國(guó)東,牛春,黃文福,張萍

(寧夏泰瑞制藥股份有限公司技術(shù)研發(fā)中心,銀川 750100)

三重復(fù)合誘變選育林可霉素高產(chǎn)菌株

畢國(guó)東,牛春*,黃文福,張萍

(寧夏泰瑞制藥股份有限公司技術(shù)研發(fā)中心,銀川 750100)

以提高林可霉素的生產(chǎn)水平為目的，將林可霉素產(chǎn)生菌LK15-012先用0.6%甲基磺酸乙酯(EMS)處理3 h，然后常壓室溫等離子體(ARTP-200W)照射90 s、最后紫外線(UV)照射50 s。結(jié)果表明：致死率為98.5%，正突變率為71.8%。最終獲得2株高產(chǎn)突變株LK16-032和LK16-049，搖瓶效價(jià)比出發(fā)菌株LK15-012提高了42.50%和35.25%。將兩株突變株分別通過100 L小試、10 t中試和60 t大生產(chǎn)進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證，發(fā)酵效價(jià)明顯高于生產(chǎn)菌株。采用EMS-ARTP-UV三重復(fù)合誘變明顯提高了林可霉素的生產(chǎn)水平。

林可霉素;EMS-ARTP-UV三重復(fù)合誘變;高產(chǎn)突變株

林可霉素(Lincomycin，簡(jiǎn)稱LK)是首先被發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)林可酰胺類抗生素中的一種，人們?cè)?962年從內(nèi)布拉斯加州林肯市附近土壤中分離得到一種鏈霉菌——林肯霉菌林肯變種所產(chǎn)生的抗生素，并因此得名，林可霉素?zé)o交叉耐藥性且本身毒性較低，是臨床上常用的抗生素之一[1-2]。林可霉素通過抑制菌體中蛋白質(zhì)的合成起作用，能夠抗大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌和少量厭氧的革蘭氏陰性菌。其本身的毒性較低，且不像其他的抗生素那樣有交叉耐藥性，因此臨床上被廣泛用來治療由革蘭氏陽(yáng)性菌引發(fā)的疾病。林可霉素和其下游的半合成產(chǎn)品被統(tǒng)稱為林可酰胺類抗生素。林可霉素的抑菌機(jī)制是作用于敏感菌中核糖體，抑制肽基轉(zhuǎn)移酶的活性，從而阻止肽鏈的延長(zhǎng)，抑制了細(xì)菌細(xì)胞中蛋白質(zhì)的合成。但在較高濃度的時(shí)候，也會(huì)對(duì)一些菌起到殺死的作用。林可霉素的產(chǎn)量低，不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求[3]，因此，提高林可霉素的效價(jià)對(duì)于大生產(chǎn)來說是必要的基礎(chǔ)。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基因工程、雜交育種、原生質(zhì)體融合等技術(shù)的運(yùn)用也為工業(yè)微生物發(fā)酵提供了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)[4-5],本文采用EMS-ARTP-UV三重復(fù)合誘變法對(duì)林可霉素產(chǎn)生菌LK15-012進(jìn)行誘變，通過初篩、復(fù)篩，HPLC法測(cè)定林可霉素的含量，最終獲得了2株高產(chǎn)突變株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 出發(fā)菌株LK15-012，由寧夏泰瑞制藥股份有限公司技術(shù)中心進(jìn)行分離純化獲得。

1.1.2 培養(yǎng)基 分離/斜面培養(yǎng)基(%，W/V)：可溶性淀粉2，黃豆餅粉(生)0.6、KNO32，NaCl 0.06，K2HPO40.06，MgSO4· 7H2O 0.06，F(xiàn)eSO4·7 H2O 0.002，pH:7.0～7.5。種瓶培養(yǎng)基(%，W/V)：可溶性淀粉2，黃豆餅粉(生)2，葡萄糖1，(NH4)2SO40.2，CaCO30.5，pH:7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基(%，W/V)：黃豆餅粉(生)3，葡萄糖10，玉米漿0.3、(NH4)2SO40.8，NaCl 0.6，K2HPO40.02，NaNO30.8，CaCO30.8，pH:7.0。

1.1.3 試劑 甲基酸酸乙酯(分析純)，硝酸鈉(分析純)，硫酸鎂(分析純)，葡萄糖(分析純)，氯化鈉(分析純)，硝酸鉀(分析純)，磷酸二氫鉀(分析純)，磷酸氫二鉀(分析純)，十水合四硼酸鈉(分析純)，甲醇(色譜純)。

1.1.4 設(shè)備 ARTP誘變系統(tǒng)ARTP-Ⅱ-026，北京思清源生物科技有限公司；BSC-1500ⅡA2-X生物安全柜，濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司；CR21GⅢ高速冷凍離心機(jī)，日立HITACHI；DHZ-2001B全溫度振蕩培養(yǎng)箱，太倉(cāng)市華美生化儀器廠；LC-20AT型高效液相色譜儀，日本島津公司；C18色譜柱4.6 mm×250 mm，5 μm；XDW25/96型旋轉(zhuǎn)搖瓶機(jī)，樂山長(zhǎng)征制藥機(jī)械有限公司；凈化工作臺(tái)，無錫市榮豐凈化空調(diào)設(shè)備廠；XDW25/160搖瓶機(jī)，樂山長(zhǎng)征制藥機(jī)械有限責(zé)任公司；PHS-3C酸度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；BSA3202S-CW型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；DHZ-2001B恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；BC-118F、DW-86L286冰箱，青島海爾電器有限公司；SP-400型冰箱，沈陽(yáng)市偉民醫(yī)療器械有限公司；紫外誘變箱和78-1型磁力攪拌器，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；低速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠； 10 μL、50 μL、100 μL、1 mL和5 mL移液槍，Eppendorf公司;SPX-250B型生化培養(yǎng)箱，上海申光儀器儀表有限公司。

1.2 方法

1.2.1 林可霉素單孢子懸浮液的制備 取林可霉素產(chǎn)生菌菌種斜面(LK15-012)，加入0.85%的生理鹽水15 mL, 洗脫斜面，將洗脫液移入組織研磨器中，充分研磨，將研磨后的孢子懸浮液過濾至已滅過菌的帶蓋小瓶中待用。

1.2.2 甲基磺酸乙酯(EMS)處理 取5 mL孢子懸浮液置于三角瓶中，加入20 μL 0.5%的EMS，在搖床上振蕩，分別取不同時(shí)間的處理液，稀釋，按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6梯度進(jìn)行稀釋涂雙碟，于溫度29～31℃、相對(duì)濕度15%～25%的環(huán)境下倒置培養(yǎng)8 d，得到EMS誘變后的單菌落，計(jì)算致死率和正變率。

1.2.3 常壓室溫等離子體(ARTP)誘變 吸取孢子懸浮液20 μL，加到無菌芯片上(每五個(gè)芯片為一組)，將ARTP功率調(diào)至200 W,將加有孢子懸浮液的芯片置于ARTP誘變系統(tǒng)中，設(shè)定不同照射時(shí)間，將照射后的芯片放入試管中，加生理鹽水振蕩，稀釋，按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6梯度進(jìn)行稀釋涂雙碟[6]，于溫度29～31℃、相對(duì)濕度15%～25%的環(huán)境下倒置培養(yǎng)8 d，得到ARTP誘變后的單菌落，計(jì)算致死率和正變率。

1.2.4 紫外線(UV)誘變 吸取5 mL孢子懸浮液，放入Φ60含攪拌子的雙碟中，置于磁力攪拌器上，開動(dòng)攪拌，在避光條件下用15 W紫外燈距離30 cm照射不同時(shí)間[7]，將照射后的孢子懸浮液稀釋，按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6梯度進(jìn)行稀釋涂雙碟，于溫度29～31℃、相對(duì)濕度15%～25%的環(huán)境下培養(yǎng)8 d，得到UV誘變后的單菌落，計(jì)算致死率和正變率。

1.2.5 EMS-ARTP-UV三重復(fù)合誘變處理 按1.2.1項(xiàng)方法制備單孢子懸浮液，吸取孢子懸浮液10 mL至三角瓶中，加3 mL 0.5%的EMS溶液處理3 h。吸取EMS處理過的孢子懸浮液20 μL加到無菌芯片上。將芯片置于ARTP-200W照射90 s，將照射后的芯片放入無菌試管中，加無菌生理鹽水洗脫照射的芯片，充分振搖后，吸取孢子懸浮液5 mL放入含Φ60攪拌子的雙碟中，置于磁力攪拌器上，開動(dòng)攪拌，在避光條件下，用15 W紫外燈距離30 cm照射20、30、40、50、60、70、80 s。照射完畢后將誘變后的菌懸液按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6梯度進(jìn)行稀釋涂雙碟，于溫度29～31℃、相對(duì)濕度15%～25%的環(huán)境下倒置培養(yǎng)8 d，計(jì)算致死率和正變率。

1.2.6 出發(fā)菌株的選擇 用生產(chǎn)斜面進(jìn)行分離純化，經(jīng)篩選選擇LK15-012為出發(fā)菌株，含量為4182 U/mL。

1.2.7 單菌落篩選

1.2.7.1 挑選單菌落 在無菌條件下挑取培養(yǎng)成熟的單菌落接種至試管斜面上，共挑取110支斜面，于溫度29～31℃、相對(duì)濕度15%～25%培養(yǎng)。

1.2.7.2 初篩 將培養(yǎng)好的試管斜面接入一級(jí)發(fā)酵瓶，一支斜面接一個(gè)發(fā)酵瓶，于溫度29～31℃、相對(duì)濕度15%～25%的條件下進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后放瓶測(cè)定含量。

1.2.7.3 復(fù)篩 根據(jù)初篩結(jié)果挑取8個(gè)含量高的一級(jí)搖甁進(jìn)行復(fù)篩，復(fù)篩采用二級(jí)發(fā)酵，一支斜面接一個(gè)種子瓶，于溫度29～31℃、相對(duì)濕度15%～25%的條件下進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后接發(fā)酵瓶，一瓶種子瓶接三瓶發(fā)酵瓶，于溫度29～31℃、相對(duì)濕度15%～25%的條件下進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后放瓶測(cè)定含量。

1.2.8 穩(wěn)定性考察 對(duì)篩選出的2個(gè)單菌落同時(shí)進(jìn)行傳代，連續(xù)傳五代，待斜面培養(yǎng)成熟后進(jìn)行含量測(cè)定。

1.2.9 保藏方法 將誘變篩選出的2個(gè)單菌落進(jìn)行分離純化，用沙土管和低溫管保藏法保藏，以備發(fā)酵生產(chǎn)使用。

1.2.10 HPLC測(cè)定 取搖瓶發(fā)酵液10 mL，轉(zhuǎn)入10 mL離心管中，于10000 r/min，離心10 min，取上清液0.5 mL轉(zhuǎn)入另一支10 mL離心管中，加入4.5 mL硼砂-甲醇溶液，搖勻后于3000 r/min離心10 min，取上清液用孔徑0.22 μm水相針式濾膜過濾，取過濾液10 μL進(jìn)液相色譜柱，峰面積為林可霉素含量(U/mL)。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)LK15-012出發(fā)菌株誘變處理結(jié)果

2.1.1 甲基磺酸乙酯(EMS)處理 如表1所示。

表1 EMS誘變的致死率和正突變率

從結(jié)果看，當(dāng)EMS處理時(shí)間達(dá)到6 h時(shí)，菌體致死率為100%?？紤]后續(xù)的ARTP誘變和UV誘變，需要選擇EMS處理時(shí)間不宜過長(zhǎng)，保留一定的菌體存活量，可順利進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)操作。為此選擇EMS處理3 h為宜。

2.1.2 常壓室溫等離子體(ARTP)誘變處理 結(jié)果見表2和圖1?？梢钥闯觯珹RTP照射時(shí)間越長(zhǎng)，致死率和正變率越高，考慮后期UV照射，最后選擇ARTP照射90 s為處理時(shí)間。2.1.3 紫外線(UV)誘變處理 如圖2和表3所示。

圖1 ARTP誘變致死曲線

圖2 UV誘變致死曲線

處理時(shí)間/s致死率/%正變率/%6068.430.17078.637.58085.448.69091.856.810096.552.411099.560.2120100-

由結(jié)果可知，紫外線照射時(shí)間越長(zhǎng)，致死率和正變率也越高，綜合前期對(duì)孢子懸浮液進(jìn)行EMS和ARTP的處理，最后對(duì)其進(jìn)行的處理時(shí)間不宜過長(zhǎng)，所以選擇照射時(shí)間為50 s為宜。

2.1.4 EMS、ARTP和UV三種方式組合的處理 結(jié)果如表4所示。

表3 UV誘變的致死率和正突變率

表4 不同方式組合處理的致死率和正突變率

從以上數(shù)據(jù)可知，EMS、ARTP和UV的三重復(fù)合處理后，其致死率達(dá)到98.5%，正變率71.8%，高于其他任何組合方式以及各種方式單獨(dú)處理,所以選擇三重復(fù)合誘變有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

2.1.5 對(duì)高產(chǎn)突變株進(jìn)行穩(wěn)定性驗(yàn)證 如表5、表6和表7所示。

表5 初篩結(jié)果

表6 復(fù)篩結(jié)果

表7 穩(wěn)定性驗(yàn)證

從復(fù)篩結(jié)果可知，兩株高產(chǎn)突變株相對(duì)于初篩效價(jià)比較穩(wěn)定，從傳代結(jié)果可以得出菌株LK16-049的穩(wěn)定性比LK16-032高?？傮w誘變效果對(duì)比，在傳代5次后，相對(duì)于其他誘變方法，菌株的傳代穩(wěn)定性比較高。

2.1.6 將高產(chǎn)突變株LK16-032和LK16-049通過100 L小試罐、10 t中試罐和60 t發(fā)酵罐驗(yàn)證 如圖3、圖4和圖5所示。將高產(chǎn)突變菌株分別通過100 L小試、10 t中試和60 t大生產(chǎn)進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證(圖3～圖5)，高產(chǎn)突變株LK15-032比生產(chǎn)菌株分別提高17.3%、15.4%和5.7%；LK15-049比生產(chǎn)菌株分別提高了15.7%、14.2%和4.9%。兩支高產(chǎn)突變株在各級(jí)發(fā)酵罐上的產(chǎn)率和穩(wěn)定性較好。

3 討論和小結(jié)

目前國(guó)內(nèi)在菌種選育方面,李紅德[8]經(jīng)紫外線(UV)處理林可霉素，其平均效價(jià)比自然分離株相對(duì)能力只提高了2%，單一的誘變方式效果不明顯。而曹書祥等[9]采用硫酸二乙酯(DES)和紫外線(UV)對(duì)林可霉素進(jìn)行了二重復(fù)合誘變，篩選的菌株產(chǎn)量比出發(fā)菌株高29.6%。朱立元等[10]用紫外線(UV)、氯化鋰(LiCl)和甲基磺酸乙酯(EMS)三重復(fù)合誘變處理林可霉素，其搖瓶的產(chǎn)量比出發(fā)菌株高25%。多種誘變方式的組合可以明顯提高菌種誘變的概率。

圖3 100 L小試罐

圖4 10 t中試罐

圖5 60 t發(fā)酵罐

本文主要采用EMS-ARTP-UV三重復(fù)合誘變，尤其是應(yīng)用了現(xiàn)在最新的誘變系統(tǒng)-常壓室溫

等離子體(ARTP)，常壓低溫等離子體中的高濃度活性粒子能夠作用于微生物的遺傳物質(zhì)，使其在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生致畸突變，相比傳統(tǒng)的離子束注入、放射線誘變和化學(xué)誘變的效率更高。通過實(shí)驗(yàn)證明應(yīng)用EMS-ARTP-UV誘變效果顯著，最終獲得了2株穩(wěn)定性較好的LK16-032和LK16-049高產(chǎn)突變株，搖瓶效價(jià)比對(duì)照高42.5%和35.25%。而且在后期的小試罐、中試罐和發(fā)酵大生產(chǎn)上放罐效價(jià)明顯高于生產(chǎn)菌株，兩支高產(chǎn)突變株在各級(jí)發(fā)酵罐上的產(chǎn)率和穩(wěn)定性較好，明顯提高了林可霉素的生產(chǎn)水平。

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(編輯：侯向輝)

Triple Breeding of Lincomycin Producing Strain

BI Guo-dong,NIU Chun*, HUANG Wen-fu,ZHANG Ping

(TerryPharmaceuticalCoLtd，NingxiaInstituteofBacteria,Yinchuan750100，China)

In order to improve the level of production of lincomycin, clindamycin producing bacteria LK15-012 treated with 0.6% ethyl methyl sulfonic acid (EMS)3 h, the second with atmospheric pressure plasma (ARTP-200w) at room temperature irradiation of 90 s, finally by ultraviolet (UV) radiation 50 s. The results showed that the mortality rate was 98.5%, the positive mutation rate is 71.8%. Won 2 strains of high yield mutant strains LK16-032and LK16-049, shake flask titer than the starting strain LK15-012 increased by 42.50% and 35.25%.Will be high yield mutant strain respectively through the test in 100 L, 10 t pilot and 60 t fermentation carried out to verify the mass production, significantly higher than the production strains fermentation titer. The EMS-ARTP-UV triple compound mutagenesis lincomycin production levels are increased obviously.

lincomycin; EMS-ARTP-UV mutation mutated；high-producing strain

畢國(guó)東，助理工程師，從事抗生素發(fā)酵菌種選育研究。

2016-08-04

A

1002-1280 (2016) 11-0022-05

S859.796