邱天寶

(河南省獸藥飼料監(jiān)察所，鄭州 450008)

HPLC法測定麻黃魚腥草散中黃芩苷、穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量

邱天寶

(河南省獸藥飼料監(jiān)察所，鄭州 450008)

為了建立HPLC法測定麻黃魚腥草散中黃芩苷、穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯含量的方法，采用色譜柱Waters XBrigeTMC18(4.6 mm×150 mm，5μm)，黃芩苷以甲醇-0.2%磷酸溶液為流動相梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，柱溫: 30 ℃；穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯以甲醇-水(50∶50)為流動相，流速:1.0 mL/min，柱溫為30 ℃；黃芩苷、穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯檢測波長分別為276、225、254 nm。黃芩苷的線性范圍為0.0798～0.7975 μg(r=1.0000)，平均回收率為94.3%(RSD=0.8%)。穿心蓮內(nèi)酯的線性范圍為0.0109～0.2175μg(r=1.0000)，平均回收率為92.9%(RSD=0.7%)；脫水穿心蓮內(nèi)酯的線性范圍為0.0105～0.2105μg(r=0.9999)，平均回收率為92.4%(RSD=0.3%)。本方法快速、簡便、準確，能有效測定麻黃魚腥草散中穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量。

麻黃魚腥草散；黃芩苷；穿心蓮內(nèi)酯；脫水穿心蓮內(nèi)酯；含量測定；HPLC

麻黃魚腥草散收載于《中國獸藥典》2010年版二部，是獸藥中常用中藥散劑，由麻黃、黃芩、魚腥草、穿心蓮、板藍根組成，具有宣泄肺熱、平喘止咳的功效，主治肺熱咳嗽，雞支原體病[1]。組方中穿心蓮為爵床科植物Andrographispaniculata(Burm. f.)Nees的干燥地上部分，具有清熱解毒，涼血，消腫等功效，用于感冒發(fā)熱，咽喉腫痛，口舌生瘡，頓咳勞嗽，泄瀉痢疾，熱淋澀痛，癰腫瘡瘍，蛇蟲咬傷[2]。大量研究證明穿心蓮內(nèi)酯是穿心蓮的主要有效成，具有消炎、抗菌、抗病毒[3-5]、抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、保肝、抗艾滋病等藥理作用[6-8]。組方中黃芩具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血安胎等功效, 為麻黃魚腥草散中渲瀉肺熱之要藥，黃芩質(zhì)量直接影響其宣泄肺熱的療效，黃芩苷是黃芩中的主要活性成分之一，黃芩苷具有解熱、抗菌、抗炎、抗腫瘤等作用[9-11]，可作為衡量黃芩品質(zhì)的指標，通過對黃芩苷的含量測定，控制麻黃魚腥草散中的黃芩質(zhì)量。目前麻黃魚腥草散的質(zhì)量標準中僅有對黃芩、穿心蓮的顯微鑒別，不能很好地控制其質(zhì)量。本文通過對黃芩苷、穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量測定能有效地控制黃芩、穿心蓮的質(zhì)量，提升麻黃魚腥草散的質(zhì)量標準，為全面有效地控制其質(zhì)量提供了技術(shù)參考。

1 材料

1.1 試劑與藥品 黃芩苷對照品，含量98.8%，批號：Z0271109，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；穿心蓮內(nèi)脂對照品，含量98.7%，批號：110797-201108，購于中國食品藥品鑒定研究院；脫水穿心蓮內(nèi)脂對照品，含量99.4%，批號：110854-201509購于中國食品藥品鑒定研究院；麻黃魚腥草散及其相應陰性樣品按《中國獸藥典》二部組方自制，麻黃產(chǎn)地為內(nèi)蒙古，魚腥草、板藍根產(chǎn)地為河南，穿心蓮產(chǎn)地為廣東，黃芩產(chǎn)地為山西，甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.2 儀器 Waters e2695高效液相色譜儀，2998 PDA檢測器(美國Waters公司)；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)； METTLER-AE240 型電子分析天平。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[1]

2.1.1 黃芩苷 色譜柱Waters XBrigeTMC18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，黃芩苷以甲醇為流動相A，以0.2%磷酸溶液為流動相B,按表1進行梯度洗脫；柱溫30 ℃；檢測波長276 nm；流速1.0 mL/min；進樣體積10 μL。

表1 流動相梯度洗脫程序

2.1.2 穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯 色譜柱Waters XBrigeTMC18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，以甲醇-水(50∶50)為流動相；柱溫30 ℃；穿心蓮內(nèi)酯檢測波長225 nm，脫水穿心蓮內(nèi)酯檢測波長為254 nm；流速1.0 mL/min；進樣體積10 μL。

2.2 對照品溶液制備 取黃芩苷對照品約10 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為儲備液；精密吸取5 mL至25 mL的量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即黃芩苷得對照溶液(每1 mL含黃芩苷39.8757 μg)。

取穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯對照品約10 mg，精密稱定，分別置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為儲備液；分別精密吸取5 mL至50 mL的量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。(每1 mL含穿心蓮內(nèi)酯10.877 μg、脫水穿心蓮內(nèi)酯10.5265 μg)。

2.3 供試品溶液制備

2.3.1 黃芩苷供試品制備 取樣品1 g，精密稱定，置帶塞錐形瓶中，精密加甲醇50 mL，稱定重量，超生處理30 min，放至室溫，用甲醇補足重量，濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL至25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3.2 穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯供試品制備 取樣品1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入40%甲醇50 mL，浸泡1 h，稱定重量，超生處理30 min，放至室溫，再稱定重量，用40%甲醇補足重量，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL至中性氧化鋁柱(200～300目，5 g，內(nèi)徑1.5 cm)上，用甲醇20 mL洗脫，收集洗脫液，置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4 陰性對照溶液的制備 按麻黃魚腥草散處方比例分別制備不含黃芩、穿心蓮藥材的陰性樣品，然后稱取取適量，按2.3項下方法，制備相應的陰性對照溶液。

2.5 專屬性試驗 分別取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各10 μL注入液相色譜儀，分別按上述各成份色譜條件測定，記錄色譜圖，主峰與其它峰分離良好，陰性無干擾，色譜圖見圖1-圖6。

圖1 黃芩苷對照品色譜圖

圖2 麻黃魚腥草散色譜圖

圖3 缺黃芩陰性對照色譜圖

1-穿心蓮內(nèi)酯；2-脫水穿心蓮內(nèi)酯圖4 對照品色譜圖

1-穿心蓮內(nèi)酯；2-脫水穿心蓮內(nèi)酯圖5 麻黃魚腥草散色譜圖

圖6 缺穿心蓮陰性對照色譜圖

2.6 線性關(guān)系考察

2.6.1 黃芩苷線性關(guān)系 精密吸取黃芩苷對照品溶液2、5、10、15、20 μL注入液相色譜儀，照“2.1”項下色譜條件記錄峰面積。以峰面積為縱坐標，對照品含量為橫坐標進行線性回歸，得黃芩苷的回歸方程分別為:Y = 9E+08x-2076.7 (R=1.0000)；線性范圍為0.0798 ～0.7975 μg。

2.6.2 穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯線性關(guān)系 精密吸取穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯混合對照品溶液1、3、5、10、15、20 μL注入液相色譜儀，照“2.1”項下色譜條件記錄峰面積。以峰面積(Y)為縱坐標，對照品含量(X)為橫坐標進行線性回歸，得穿心蓮內(nèi)酯回歸方程為Y=2E+06X-7318.2 (R=1.0000)，線性范圍為0.0109～0.2175 μg、脫水穿心蓮內(nèi)酯的回歸方程分別為:Y=2E+06X-8215.5 (R=0.9999)；線性范圍為0.0105～0.2105 μg。

2.7 穩(wěn)定性實驗 取麻黃魚腥草散1.0 g，精密稱定，按“2. 3”項下方法分別制備供試品溶液，分別于制備后0、2、4、8、10、12 h進樣，每次10 μL，測定峰面積，黃芩苷、穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的RSD值分別為0.8%、0.5%和0.6%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。2.8 精密度實驗 取麻黃魚腥草散5份，每份1.0 g，精密稱定，按照“2.3”項下方法分別制備黃芩苷、穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯供試品溶液，精密吸取各供試品溶液10 μL 進樣，測定峰面積并計算黃芩苷含量為3.4791、3.4948、3.5024、3.4899、3.4974 mg/g，RSD值為0.3%；穿心蓮內(nèi)酯含量為：0.7631、0.7563、0.7677、0.7655、0.7584 mg/g，RSD值為0.6%；脫水穿心蓮內(nèi)酯含量為：1.0325、1.0269、1.0277、1.0364、1.0411 mg/g ，RSD值為0.6%，表明該方法重復性良好。

2.9 準確度實驗

2.9.1 黃芩苷回收率 稱取已知含量的樣品6份，每份0.5 g，分別精密加入對照品儲備液10.00 mL，再精密加入甲醇40 mL，超生處理30 min，放至室溫，用甲醇補足重量，濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL至25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，分別進樣。計算平均加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 黃芩苷加樣回收率結(jié)果(n=6)

2.9.2 穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯回收率 稱取已知含量的樣品6份，每份0.5 g，分別精密分別加稱取已知含量的樣品6份，每份0.5 g，分別精密分別加入穿心蓮內(nèi)酯對照品儲備液3 mL，脫水穿心蓮內(nèi)酯對照品儲備液5 mL，再精密加入40%甲醇42 mL，浸泡1 h，稱定重量，超生處理30 min，放至室溫，再稱定重量，用40%甲醇補足重量，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL至中性氧化鋁柱(200～300目，5 g，內(nèi)徑1.5 cm)上，用甲醇20 mL洗脫，收集洗脫液，置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。計算平均加樣回收率，結(jié)果見表3。

表3 穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯加樣回收率結(jié)果(n=6)

3 討論

獸用中藥散劑多為復方制劑，成份復雜，不易提取分離，本文采用HPLC梯度洗脫測定其黃芩苷的含量，使黃芩苷色譜峰達到基線分離，試驗考察了該洗脫程序在不同色譜柱上的分離效果，分離度均能滿足要求，為麻黃魚腥草散中黃芩的定量控制提供了技術(shù)參考。

黃芩中含有內(nèi)源酶，可降低黃芩苷的含量，尤其對于中藥散劑，更容易使黃芩苷降解，因此黃芩藥材預先通過炮制將內(nèi)源酶滅活，減少黃芩苷的降解[12]，從而保證黃芩苷含量的穩(wěn)定性，提高藥物療效。

黃芩苷的含量測定方法通常使用甲醇-磷酸溶液(50∶50)為流動相進行等度洗脫，不同樣品甲醇與磷酸溶液的比例略有差別，本實驗采用梯度洗脫的方法測定麻黃魚腥草散中的黃芩苷含量，主要為祛除雜質(zhì)峰的干擾，使黃芩苷色譜峰達到良好的分離效果。梯度洗脫過程中黃芩苷實質(zhì)上還是在甲醇-磷酸溶液(48∶52)時被洗脫出來。黃芩苷出峰后，流動相甲醇比例增加，目的是將樣品中其他雜質(zhì)從色譜柱中迅速洗脫出來，對色譜柱具有良好的保護作用，減少其他雜質(zhì)在色譜柱中的保留，避免在下一針的進樣洗脫過程中出現(xiàn)干擾。

本試驗考察了穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯在Waters XBrigeTMC18，4.6 mm×150 mm，5 μm和Agela Venusil XBP C18，4.6 mm×150 mm，5 μm兩種色譜柱的分離效果，XBrigeTMC18色譜柱較Agela Venusil XBP C18色譜柱出峰較快，分析時間短，節(jié)約流動相；Agela Venusil XBP C18色譜柱出峰較晚一些，但分離效果較好，對于復雜成份的樣品有較好效果。對于穿心蓮的含量測定，由于經(jīng)過氫氧化鋁柱的凈化，雜質(zhì)較少，容易分離，因此本試驗選用了XBrigeTMC18色譜柱。

穿心蓮中的成份具有熱不穩(wěn)定性，根據(jù)文獻的報道[13]加熱過程中穿心蓮內(nèi)酯容易脫水轉(zhuǎn)化為脫水穿心蓮內(nèi)酯，以及內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)的破壞，導致兩者總量降低。因此，本試驗在提取工藝中選擇超聲提??；此外，本試驗參考了《中國獸藥典》中穿心蓮及其制劑穿心蓮末的提取方法，提取后過氫氧化鋁柱凈化除雜，所得到供試品溶液比較純凈，色譜峰分離度好。

試驗中分別試驗了供試品提取液過氫氧化鋁柱和不過氫氧化鋁柱的差別，發(fā)現(xiàn)如果不經(jīng)過氫氧化鋁凈化，存在黃芩苷的干擾，凈化后能有效祛除干擾，分離效果好。此外，對穿心蓮藥材也做了氫氧化鋁凈化試驗，發(fā)現(xiàn)對于穿心蓮藥材經(jīng)超聲提取后，進行過氫氧化鋁柱對比，雜質(zhì)峰及含量無明顯差異。

麻黃魚腥草散對穿心蓮的質(zhì)量控制僅有顯微鑒別，顯微鏡下尋找穿心蓮葉表皮組織中的鐘乳體細胞，實際工作中發(fā)現(xiàn)，該特征不易找到，主要原因為企業(yè)生產(chǎn)過程中，使用的穿心蓮質(zhì)量較差，穿心蓮葉的含量較低，所以不易找到鐘乳體細胞顯微特征，此外穿心蓮的質(zhì)量會直接影響麻黃魚腥草散的療效，穿心蓮在治療治療呼吸道感染[14]、急性菌痢[15]、腸胃炎等[16-17]疾病方面具有確切療效，因此，控制穿心蓮質(zhì)量具有重要意義。不同廠家的產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，穿心蓮質(zhì)量差別較大，本實驗建立了穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量測定方法，為全面控制穿心蓮質(zhì)量保證麻黃魚腥草散的的療效提供技術(shù)參考。

《中國獸藥典》2010年版二部以及《中國藥典》2015年版均對穿心蓮中葉的含量有具體要求，不得少于30%，穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的總量不得少于0.80%。穿心蓮葉的含量直接關(guān)系到穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的總量，影響其療效，文獻報道葉中含穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯總量為2.39%[18],說明穿心蓮葉的含量直接影響其有效成分的含量。實際生產(chǎn)中，穿心蓮藥材根據(jù)葉含量的不同，價格各不相同，現(xiàn)有的標準無法準確有效地控制組方中穿心蓮的質(zhì)量，本試驗通過對穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量測定可有效控制麻黃魚腥草散中穿心蓮的質(zhì)量，保證其療效。

[1] 中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典2010年版二部[S].

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典.2015年版一部[S].

[3] 郭蓓.穿心蓮的研究及臨床開發(fā)[J].藥學進展.2004(12):542-546.

[4] 尹青,鄧明明.穿心蓮內(nèi)酯抗炎作用機制研究進展[J].廣東醫(yī)學.2014,35(5):786-788.

[5] 嚴園園,施高翔,邵菁,等.穿心蓮內(nèi)酯及其衍生物抗感染研究近10年進展[J].中國中藥雜志,2013,38(22):3819-3821.

[6] 陳倩倩,李清,齊會紅,等.HPLC 測定穿心蓮配伍綿茵陳后2種內(nèi)酯成分含量的變化[J].中國實驗方劑學雜志,2013,19(15):64-67.

[7] 徐錚奎.穿心蓮有望成為抗艾滋病新藥[J].中國制藥信息,2005,21(7):22-23.

[8] 王雅琪,伍振峰,鄭琴,等.穿心蓮藥材不同提取方式的合理性評價[J].中國實驗方劑學雜志,2014,20(10):1-5.

[9] 孫冬梅,鄺棗園,李巖,等.黃芩苷對耐藥性金黃色葡萄球菌的抑菌作用研究[J].吉林醫(yī)學,2011,32(13):2587-2588．

[10]辛文妤,宋俊科,何國榮,等.黃芩素和黃芩苷的藥理作用及機制研究進展[J].中國新藥雜志,2013,22(6):647-653,659.

[11]洪鐵,楊振,繩娟,等.黃芩苷抗腫瘤作用及機制的研究[J].中國藥理學通報,2008,24(12):1676-1678.

[12]李建華,王力生,鄒節(jié)明.水提工藝中黃芩內(nèi)源酶降解黃芩苷的研究[J].中草藥:2009,40(3):397-400.

[13]聶凌云,羅興平.穿心蓮提取工藝的研究及熱穩(wěn)定性考察[J].解放軍藥學學報,2005,21(1):32-33,86.

[14]王艷輝,王伽伯,郝慶秀,等.不同產(chǎn)地穿心蓮的含量測定、化學指紋圖譜及抑菌活性評價[J].中國實驗方劑學雜志,2014,20(9):78-82.

[15]管晨,李敏,任慶杰,等.穿心蓮內(nèi)酯通過抗炎和調(diào)節(jié)免疫提高EV71 感染小鼠的生存率[7].免疫學雜志,2013,29(9):737-741.

[16]程惠娟,劉江,張庚.穿心蓮內(nèi)酯抗銅綠假單胞菌生物被膜及與阿奇霉素協(xié)同抗菌作用[J].中國微生態(tài)學雜志,2012,24(2):120-124.

[17]官妍,劉麗,李春,等.亞抑菌濃度的穿心蓮內(nèi)酯及與紅霉素聯(lián)用影響表皮葡萄球菌生物膜形成的初步研究[J].中國微生態(tài)學雜志,2013,25(7):766-769.

[18]張紅星.穿心蓮葉含量對藥材質(zhì)量影響的研究[J].中國現(xiàn)代藥物應用,2015 9(5):265-266.

(編輯：陳希)

HPLC Determination of Baicalin, Andrographolide and Dehyandrographolide in Mahuang Yuxingcao Powder

QIU Tian-bao

(HenanInstituteofVeterinaryDrugandFeedControl,Zhengzhou450008,China)

A HPLC method had been established to determine the contents of baicalin, andrographolide and dehyandrographolide in Mahuang Yuxingcao powder. The baicalin was analyzed on an XBrigeTMC18 column (4.6 mm×250 mm，5 μm) using ultrapure methanol -0.2% phosphoric acid solution as the mobile phase. The flow rate was 1.0 mL/min. The column temperature was 30 ℃.The andrographolide and dehyandrographolide were analyzed on an XBrigeTMC18 column (4.6 mm×250 mm，5 μm) using methanol -ultrapure water(50∶50) as the mobile phase. The flow rate was 1.0 mL/min. The column temperature was 30℃. The detection wavelengths of Baicalin was set at 276 nm. The calibration curve was linear in the ranges of 0.0798～0.7975 μg (R=1.0000) for baicalin. The recovery of baicalin was 94.3% withRSDof 0.8%. Andrographolide and dehyandrographolide were detected at 225 and 254 nm. The calibration curves were linear in the ranges of 0.0109～0.2175 μg (R=1.0000) and 0.0105～0.2105 μg (0.9999) for andrographolide and dehyandrographolide. The average recoveries were 92.9% for andrographolide (RSD=0.7%, n=6) and 92.4% for dehyandrographolide (RSD=0.3%, n=6), respectively. This method is rapid, simple and accurate，which can be used for the determination of baicalin, andrographolide and dehyandrographolide in Mahuang Yuxingcao powder.

Mahuang Yuxingcao powder；baicalin；andrographolide；dehyandrographolide；determination；HPLC

邱天寶，碩士，從事中藥新藥及質(zhì)量標準方面研究。E-mail:qtb2006@126.com

2016-08-02

A

1002-1280 (2016) 11-0034-06

S853.76