葉妮，尹暉，王亦琳，孫雷，王鶴佳

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

動物性食品中泰妙菌素殘留標志物檢測UPLC-MS/MS法研究

葉妮，尹暉，王亦琳，孫雷*，王鶴佳

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

建立了豬和雞的肌肉、肝臟以及雞皮+脂組織中泰妙菌素殘留標志物(8-α-Hydroxymutilin)殘留檢測的UPLC-MS/MS方法。樣品經(jīng)酸化丙酮提取，氫氧化鈉水解，正己烷除脂，二氯甲烷反萃取后，用C18色譜柱分離，以0.1%甲酸乙腈溶液和0.1%甲酸水溶液為流動相進行梯度洗脫，基質(zhì)添加標準溶液外標法定量。結(jié)果表明：8-α-Hydroxymutilin在20～500 μg/kg豬肌肉、雞肌肉和雞皮+脂基質(zhì)添加標準溶液濃度范圍、100～2000 μg/kg豬肝基質(zhì)添加標準溶液濃度范圍、200～4000 μg/kg雞肝基質(zhì)添加標準溶液濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關系，相關系數(shù)R2均大于0.990；方法定量限：豬肌肉、雞肌肉、雞皮+脂為25 μg/kg，豬肝臟為100 μg/kg，雞肝臟為250 μg/kg。豬肌肉、雞肌肉、雞皮+脂在25～200 μg/kg添加濃度范圍內(nèi)、雞肝臟在250～2000 μg/kg添加濃度范圍內(nèi)、豬肝臟在100～1000 μg/kg添加濃度范圍內(nèi)，8-α-Hydroxymutilin的回收率范圍均為60%～120%，批內(nèi)、批間相對標準偏差均小于20%，滿足國內(nèi)外獸藥殘留相關法規(guī)規(guī)定。

動物性食品；泰妙菌素殘留標志物；殘留；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

泰妙菌素是一種截短側(cè)耳素類動物專用抗生素，主要用于防治畜禽呼吸系統(tǒng)疾病和促生長，是廣泛應用的獸醫(yī)專用抗生素之一。該藥在動物體內(nèi)吸收迅速，體內(nèi)分布廣泛，抗菌活性強，對支原體、細菌及螺旋體，如豬肺炎支原體、豬滑液支原體、雞敗血支原體、鏈球菌、金黃色葡萄球菌、放線桿菌及豬痢疾短螺旋體等都具有良好的抗菌活性[1]。低劑量的泰妙菌素可以促進動物生長，提高飼料利用率，因此作為獸藥和飼料添加劑被廣泛應用[2]。但是，泰妙菌素殘留可能對人類健康造成嚴重的潛在危害。泰妙菌素在動物體內(nèi)代謝成8-α-Hydroxymutilin以及各種酯代謝物[3]。據(jù)報道，動物組織內(nèi)8-α-Hydroxymutilin殘留量與泰妙菌素總量有關聯(lián)[4]，因此，通過測定動物體內(nèi)8-α-Hydroxymutilin殘留量即可推導計算泰妙菌素的總量。目前我國與歐盟等國均已批準了泰妙菌素在豬、雞等動物組織中的最大殘留限量(MRL)，在雞蛋中的殘留標志物為原型，在豬肝臟、肌肉和雞肝臟、肌肉及皮+脂中的殘留標志物為可水解為8-α-Hydroxymutilin代謝產(chǎn)物之和。8-α-Hydroxymutilin在豬肝臟中的MRL為500 μg/kg，在豬肉中的MRL為100 μg/kg，在雞肝臟中的MRL為1000 μg/kg，在雞肉和雞的皮+脂中的MRL為100 μg/kg[4]。目前，我國尚未發(fā)布以8-α-Hydroxymutilin為標志物的泰妙菌素殘留檢測方法標準，已發(fā)表的相關文獻，均以泰妙菌素原型為殘留標志物，與獸藥最高殘留限量標準規(guī)定不符。因此，本試驗進行了豬的肌肉、肝臟以及雞的肌肉、肝臟、皮+脂組織中8-α-Hydroxymutilin殘留檢測的UPLC-MS/MS方法研究。

1 材料與方法

1.1 儀器 Acqutiy UPLC-Premier XETM質(zhì)譜聯(lián)用儀，Waters公司；電子天平，Mettler Toledo 公司；高速冷凍離心機，Heraeus公司；氮吹儀，Jnc公司；渦旋混合器、水平振蕩器，IKA 公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，Buchi公司。

1.2 藥品和試劑 8α-羥基-泰妙菌素，純度99.0%，SANDOZ公司生產(chǎn)，禮來公司提供；甲醇、乙腈、甲酸為色譜純，F(xiàn)isher公司；丙酮、正己烷、二氯甲烷、鹽酸、氫氧化鈉均為分析純；所用水為超純水。

1.3 標準溶液配制 精密稱取8-α-Hydroxymutilin標準品約10 mg，于10 mL容量瓶中，用丙酮溶解并定容至刻度，配制成1 mg/mL的8-α-Hydroxymutilin標準儲備液。準確吸取0.1 mL標準儲備液至另一10 mL容量瓶中，用甲醇+0.1%甲酸水溶液(20+80，V/V)溶解并稀釋至刻度，配制成10 μg/mL標準工作液。

1.4 樣品前處理

1.4.1 提取與水解 準確稱取(2±0.02)g試料于50 mL離心管內(nèi)，加入丙酮-0.5 mol/L鹽酸溶液(60∶1，V/V)20 mL，渦旋混勻，中速水平振蕩5 min，8000 r/min離心8 min，取上清液于50 mL雞心瓶中。依次加水5 mL、0.5 moL/L鹽酸1 mL，混勻，45 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸至無沸騰現(xiàn)象，依次加入水1.5 mL、7 moL/L氫氧化鈉溶液0.5 mL，混勻，45 ℃水浴20 min后，取出放置至室溫備用。

1.4.2 除脂與萃取 備用液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管內(nèi)，加正己烷10 mL，渦旋混勻，于4 ℃下5000 r/min離心5 min，棄上層液，依次加入水5 mL、濃鹽酸0.5 mL和二氯甲烷10 mL，渦旋混勻，于4 ℃下5000 r/min離心5 min，取下層液于10 mL離心管中，45 ℃氮氣吹至近干。殘余物中加入甲醇+0.1%甲酸水溶液(20+80，V/V)1.0 mL，充分渦旋溶解后轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，12000 r/min離心5 min，取適量上清液過0.2 μm濾膜，供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.5 儀器條件

1.5.1 色譜條件 色譜柱為BEH C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相A相為0.1%甲酸乙腈溶液，B相為0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫：0.0～5.0 min，10%A線性變化至90%A；5.0～6.5 min，90%A線性變化至10%A；流速為0.3 mL/min；柱溫為30 ℃；進樣量為10 μL。

1.5.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI+)；毛細管電壓為3.2 kV；萃取電壓為3.0 V；透鏡電壓為0.5 V；源溫為100 ℃；脫溶劑溫度為350 ℃；脫溶劑氣速為450 L/h；錐孔反吹氣速為50 L/h。

1.5.3 定性與定量 該方法定性需滿足四個條件：① 空白實驗不出現(xiàn)與陽性對照相同的離子峰；② 特征離子色譜峰信噪比(S/N)都在3∶1以上；③ 試樣色譜峰保留時間應與校正溶液的一致，容許偏差為±5%；④ 檢測到的離子豐度比應與校正溶液的一致，容許偏差達到歐盟2002/657/EC中的規(guī)定。定量時以響應強度最強的離子對作為定量離子，通過基質(zhì)添加標準溶液外標法進行定量。

1.6 定量方法 于空白基質(zhì)中添加適宜濃度藥物進行提取、水解及反萃取后的溶液作為對照溶液進行測定，作為定量依據(jù)。1.7 線性測定方法 精密量取8-α-Hydroxymutilin標準工作液適量，制成較高濃度的空白添加試料，和空白試料一起經(jīng)提取、水解、萃取和吹干后，用甲醇+0.1%甲酸水溶液(20+80，V/V)1.0 mL溶解并過0.2 μm微孔濾膜，制成基質(zhì)添加試樣溶液和空白試樣溶液，用空白試樣溶液將基質(zhì)添加試樣溶液稀釋成含待測藥物濃度，豬肝為100、200、500、1000和2000 ng/mL，雞肝為200、500、1000、2000和4000 ng/mL，豬和雞肌肉以及雞皮+脂為20、50、100、200和500 ng/mL系列濃度的基質(zhì)添加標準溶液，依次上機測定，以特征離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標，基質(zhì)添加標準溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 監(jiān)測離子 8-α-Hydroxymutilin屬于歐盟指令96/23/EC附錄Ⅰ[5]所列的限用物質(zhì)，根據(jù)歐盟2002/657/EC要求，要確證該類物質(zhì)至少需要3個識別點(IP)，因此，我們分別選擇了母離子以及對應的兩個響應較強的子離子作為定性定量依據(jù)，即一母離子1個IP點，對應兩子粒子分別1.5個IP點，共4個IP點，完全滿足檢測方法要求。根據(jù)8-α-Hydroxymutilin一級質(zhì)譜掃描和二級質(zhì)譜掃描，確定了監(jiān)測離子(表1)。

表1 8-α-Hydroxymutilin定性、定量離子對及對應錐孔電壓、碰撞能量參考值

2.2 定量結(jié)果 該方法為針對基質(zhì)復雜的動物性組織，其前處理步驟較多，且增加了特殊的堿水解和液液反萃取步驟，據(jù)相關試驗數(shù)據(jù)表明，水解及液液反萃取步驟會造成約25%的藥物損失，并且提取以及濃縮步驟也會使待測物的絕對回收損失，因此，采用了空白基質(zhì)中添加藥物進行提取、水解及反萃取后的溶液作為對照溶液進行定量，即基質(zhì)添加標準溶液的方式進行定量，可抵消前處理過程中不可避免的損失以及基質(zhì)效應的干擾，獲得了較好的回收率結(jié)果。

2.3 線性結(jié)果 通過各組織的標準曲線、回歸方程及相關系數(shù)R2(表2)可以得出：8-α-Hydroxymutilin在有關濃度范圍內(nèi)(豬和雞肌肉以及雞皮+脂20～500 ng/mL、豬肝100～2000 ng/mL、雞肝200～4000 ng/mL)呈現(xiàn)良好的線性關系，R2均大于0.990。

表2 各組織8-α-Hydroxymutilin基質(zhì)添加標準曲線

2.4 靈敏度和精確度 采用空白組織中添加目標化合物的方法，依據(jù)特征離子質(zhì)量色譜峰信噪比S/N>10為方法定量限，得出8-α-Hydroxymutilin定量限在豬肌肉、雞肌肉、雞皮+脂為25 μg/kg；豬肝臟為100 μg/kg；雞肝臟為250 μg/kg。其中，1000 ng/g空白雞肝添加試樣溶液得到的特征離子質(zhì)量色譜圖見圖1。

圖1 1000 μg/kg空白雞肝添加試樣溶液特征離子質(zhì)量色譜圖

采用標準添加法，在空白豬、雞肌肉、肝臟和雞皮+脂中添加4個不同濃度(定量限、1/2MRL、MRL和2MRL四個濃度)的8-α-Hydroxymutilin進行回收率試驗，各濃度進行5個樣品平行試驗，重復3次，計算批間相對標準偏差。

試驗結(jié)果表明，本方法對豬肌肉、雞肌肉、雞皮+脂在25～200 μg/kg添加濃度范圍內(nèi)、雞肝臟在250～2000 μg/kg添加濃度范圍內(nèi)、豬肝臟在100～1000 μg/kg添加濃度范圍內(nèi)，8α-羥基-泰妙菌素的回收率范圍均為60%～120%。批內(nèi)、批間相對標準偏差均小于20%。其中，雞肝組織中8-α-Hydroxymutilin添加回收率實驗結(jié)果見表3。

3 討論與結(jié)論

本方法與文獻方法主要區(qū)別在于對樣品的前處理過程。由于8-α-Hydroxymutilin為堿性化合物，因此采用酸化丙酮溶液(丙酮∶0.5 moL/mL鹽酸)提取組織內(nèi)的8-α-Hydroxymutilin。由于丙酮的沸點為45 ℃，因此，于此溫度下進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，將提取液中的丙酮和少部分水蒸發(fā)，得到濃縮液。豬的肝臟和肌肉以及雞的肝臟、肌肉和皮膚+脂的殘留標志物是可水解為8-α-Hydroxymutilin的代謝物之和。要將8-α-Hydroxymutilin的各種酯代謝物轉(zhuǎn)化成8-α-Hydroxymutilin，需要進行水解。本方法直接參考國外禮來公司提供的堿水解條件，即加入7 mol/L的氫氧化鈉溶液，45 ℃水浴中放置20 min的條件，將各種8-α-Hydroxymutilin酯水解成8-α-Hydroxymutilin。

由于動物組織內(nèi)均存在油脂，影響儀器響應值和信噪比，因此，選用常規(guī)去脂試劑正己烷，通過渦旋、4 ℃離心去除油脂。8-α-Hydroxymutilin可很好溶于二氯甲烷，且二氯甲烷具有良好揮發(fā)性，因此，選用二氯甲烷作為反萃取溶劑，在酸性條件下從去脂后的溶液中反萃取8-α-Hydroxymutilin，

表3 各組織中8-α-Hydroxymutilin添加回收率實驗結(jié)果(n=5)

于45 ℃氮氣吹至近干。由于復溶液中混有沉淀物和懸浮物，使得復溶液呈乳白色，需通過高速離心使其澄清，因此，根據(jù)復溶體積(1 mL)，選擇將復溶液轉(zhuǎn)移至1.5 mL塑料離心管中，以12000 r/min的速度高速離心，吸取澄清部分過0.2 μm濾膜，上機檢測。

已有文獻部分方法采用HLB萃取柱對樣品進行凈化，經(jīng)實驗表明，活化萃取柱所用磷酸鹽緩沖液的酸性環(huán)境可能會造成待測藥物的破壞和損失。因此，本實驗未采用同類方法。

本方法通過對樣品前處理條件的充分研究，建立了適用于豬、雞的肌肉、肝臟和雞皮+脂等5種動物性食品中8-α-Hydroxymutilin殘留檢測的UPLC-MS/MS方法。方法以8-α-Hydroxymutilin為殘留標志物，因待測藥物為堿性物質(zhì)，故用萃取、旋蒸和反萃取的方法對樣品進行凈化，不同于已有

文獻方法的以泰妙菌素原型為殘留標志物，用有機溶劑提取并經(jīng)萃取柱柱凈化，避免了萃取柱的酸性條件對堿性物質(zhì)的破壞及損耗，具有良好的可操作性和重現(xiàn)性，方法靈敏度和精確度均能滿足獸藥殘留分析方面的要求，為能夠完整的進行動物性食品中泰妙菌素的殘留檢測提供了重要的技術(shù)支持。

[1] 黃賀賢，曾振靈，黃顯會. 截短側(cè)耳素類抗生素-泰妙菌素的研究進展[J]. 中國獸藥雜志, 2010, 44(6): 42-45.

[2] 馬境，王金輝，吳悅泰. 泰妙菌素在獸醫(yī)臨床上的應用[J]. 養(yǎng)殖技術(shù)顧問，2007(7)：92-92.

[3] 耿士偉，朱志謙. 高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法測定雞肉中泰妙菌素殘留的研究[J]. 中國家禽, 2012, 34(11): 28-31.

[4] 農(nóng)業(yè)部公告第235號 動物性食品中獸藥最高殘留限量[S].

[5] 歐盟指令96/23/EC附錄Ⅰ[Z].

(編輯：李文平)

The Research of 8-α-Hydroxymutilin Residues in Animal Derived Food by UPLC-MS/MS

YE Ni, YIN Hui, WANG Yi-lin, SUN Lei*, WANG He-jia

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China)

A UPLC-MS/MS method was established for the determination of 8-α-Hydroxymutilin residue in animal derived food. After extracted by acid acetone and concentrated, the tissues were hydrolyzed by sodium hydrate solution, removed oil byn-hexane. The separation of 8-α-Hydroxymutilin was performed on Waters Acquity UPLC system with the column of BEH C18 and the gradient elution solvent of acetonitrile (0.1% formic acid) and water (0.1% formic acid) at a flow rate of 0.3 mL/min. The method was quantified by blank tissue spiked standard curves. The calibration curves were good linear between the peak areas and the concentrations of 20～500 μg/kg for pig muscle, chicken muscle and skin and fat of chicken，100～2000 μg/kg for pig liver, 200～4000 μg/kg for chicken liver, the correlation coefficientR2>0.990. The limits of detection of 8-α-Hydroxymutilin in pig muscle, chicken muscle and skin and fat of chicken were 25 μg/kg, in pig liver was 100 μg/kg and in chicken liver was 250 μg/kg. The average recoveries from spiked animal tissues at the concentrations of 25～200 μg/kg for pig muscle, chicken muscle and skin and fat of chicken, 250～2000 μg/kg for chicken liver, 100～1000 μg/kg for pig liver, ranged 60%～120%. The intra- and inter-batch variation coefficients were both less than 20%.

animal derived food；8-α-Hydroxymutilin；residue；UPLC-MS/MS

葉妮，助理研究員，從事獸藥殘留相關研究。

2016-08-08

A

1002-1280 (2016) 11-0049-05

S859.84