呂艷芳,張思涵,蔡路昀,勵建榮,楊銘鐸

(1.哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院,黑龍江哈爾濱 150076; 2.渤海大學食品科學與工程學院,遼寧錦州 121013)

?

南美白對蝦酚氧化酶催化不同底物的生化特性研究

呂艷芳1,2,張思涵2,蔡路昀2,勵建榮2,楊銘鐸1,*

(1.哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院,黑龍江哈爾濱 150076; 2.渤海大學食品科學與工程學院,遼寧錦州 121013)

為揭示南美白對蝦酚氧化酶(phenoloxidase,PO)催化不同底物時的生化特性,本文以L-多巴、甲基多巴、鄰苯二酚為底物,分別測定南美白對蝦酚氧化酶催化這三種底物時的最適溫度、最適pH,酶促動力學常數Km、Vmax值、活化能。結果表明,南美白對蝦PO酶催化三種底物的最適溫度分別為45、40、30 ℃,最適pH分別為6.8、7.2、8.0,酶促動力學常數Km分別為2.5003、5.8661、1.8429 mmol/L,Vmax分別為0.0624、0.1008、0.1692 ΔA/min,活化能Ea分別為15.2158、18.1981、10.4696 kJ/mol;鄰苯二酚與PO酶的結合能力較強,但其結合受外界溫度的影響較大;而PO酶與L-多巴和甲基多巴的結合受外界溫度影響較小。由此可得,底物結構越簡單,越容易與PO酶活性中心結合;底物與酶的結合能力越強,酶活化底物時所需的活化能越小;在PO酶研究中,如果影響因素有溫度這一條件時,不應該選擇鄰苯二酚作為底物。

南美白對蝦,酚氧化酶,酶促反應,動力學,活化能

生物酶是生物體活細胞產生的、具有催化作用的有機物,大部分為蛋白質,也有極少部分為RNA,具有高效性、專一性、降低底物反應活化能等特性。一種酶只能專一地催化特定的一種或一類物質,同一種酶作用不同的底物,其催化能力有很大差別,研究任何一種酶,選擇合適的底物是研究的基礎。蝦類非常容易發(fā)生黑變,主要是由于蝦體內含有酚氧化酶(phenoloxidase,PO),近年來對其生化性質和酶活性抑制方法的研究比較多,但在研究中選用的底物不一樣,Qian等[1]在研究南美白對蝦氣調包裝后,腐敗微生物與蝦黑變關系時,測定PO酶活性時,使用的底物是鄰苯二酚;Nirmal等[2]在研究兒茶素和阿魏酸抑制南美白對蝦PO酶動力學時,使用的底物是L-多巴;Manheem等[3],Huang等[4]在研究加熱對南美白對蝦PO酶活性影響時,使用的底物是L-多巴。PO酶催化不同底物的生化特性區(qū)別,目前研究的比較少,本研究在前人的研究基礎上,對南美白對蝦(Penaeusvannamei)PO酶進行分離純化,然后研究其作用雙酚底物(L-DOPA、甲基多巴、鄰苯二酚)的生化特性,為對蝦酚氧化酶的研究提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南美白對蝦 遼寧錦州水產市場,購買時為活蝦,平均質量為每個蝦15±2 g,將蝦保持鮮活狀態(tài)運到實驗室,用冰猝死,自來水沖洗,將其頭胸部剪下,貯藏于-80 ℃超低溫冰箱備用。

鄰苯二酚BR級 北京中生瑞泰科技有限公司;甲基多巴(L-3-(3,4-二羥基苯基)-2-甲基-L-丙氨酸)、L-多巴(L-β-(3,4-二羥基苯)-丙氨酸);L-DOPA)BR級,十二烷基聚乙二醇醚(Brij-35)Sigma-Aldrich 北京中生瑞泰科技有限公司;DEAE Sepharose Fast Flow GE Healthcare 北京德美中貿國際貿易有限公司;SDS-PAGE電泳試劑 Sigma北京中生瑞泰科技有限公司;其他試劑均為分析純 上海國藥集團化學試劑有限公司。

UV-2550紫外-可見分光光度計 日本島津公司;蛋白電泳儀、GS-800圖像掃描儀 美國Bio-Rad;Milli-Q超純水裝置 美國Millipore公司;DK8D型電熱恒溫水槽 上海一恒科技有限公司;Biofuge stratos臺式冷凍高速離心機 美國Thermo Scientific公司;AF-10制冰機 美國Scotsman公司;蛋白質層析系統(tǒng) 上海青浦滬西儀器廠;智能編程層析柜CX-1型 上海嘉鵬科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 南美白對蝦 PO酶分離純化 將冷凍于-80 ℃超低溫冰箱的南美白對蝦頭胸部的甲殼部及肌肉去掉,然后使用液氮研磨,稱取100 g粉末加入到400 mL、0.067 mol/L、pH為7.2的預冷磷酸緩沖液中(含有0.1% Brij-35),混合后置于4 ℃下,浸提2 h,期間不斷攪拌,然后用尼龍網布(300目)過濾,濾液使用高速冷凍離心機在4 ℃下10000 r/min離心20 min,棄沉淀,上清液使用尼龍網布(500目)將飄浮的蝦青素過濾掉,收集上清液,獲得的上清液即為粗酶液。

前期將粗酶液使用硫酸銨分段鹽析,結果發(fā)現50%硫酸銨鹽析出的蛋白質具有很高的酶活,以此作為鹽析沉淀PO酶的實驗依據。將飽和硫酸銨溶液緩慢加入粗酶液中,使硫酸銨濃度依次達到30%、40%和50%,每級沉淀都在4 ℃下靜置2 h,4 ℃下10000 r/min 離心20 min,將30%、40%硫酸銨沉淀的蛋白質棄去,收集50%硫酸銨沉淀的酶蛋白,溶于適量的磷酸緩沖液。將上述酶液于4 ℃下進行透析,在pH為7.2、0.067 mol/L磷酸緩沖液中透析16 h,期間更換兩次透析液,聚乙二醇濃縮后離心,收集上清。取12 mL透析、濃縮后的PO酶液上樣于DEAE Sepharose Fast Flow弱陰離子交換柱(1.6 cm×25 cm),分別用含0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mol/L NaCl,pH為7.2、0.02 mol/L的磷酸緩沖液進行洗脫,每個梯度洗脫70 mL,流速1 mL/min,每5 mL收集1管,檢測各管的酶活性和蛋白含量,合并酶活性較高的峰,使用10 ku超濾離心管濃縮,然后保存于-80 ℃超低溫冰箱中備用。

1.2.2 SDS-PAGE電泳 酚氧化酶的純度檢測采用SDS-PAGE電泳檢測[5]。濃縮膠和分離膠質量分數分別為4%和12%。電泳后,蛋白質用考馬斯亮藍R-250染色液進行染色。

1.2.3 蛋白質含量測定 蛋白質含量的測定采用Bradford 法進行[6]。蛋白質與考馬斯亮藍G-250 染料相結合,形成的復合物在595 nm處形成最大吸收峰,吸光度A595 nm與蛋白質濃度成正比。以牛血清蛋白(BSA)標準品作為標準蛋白,繪制標準曲線。根據標準曲線計算樣品中蛋白質的濃度。

1.2.4 PO酶分別催化三種底物生成的產物最大吸收波長的測定 反應體系含有1.8 mL、0.067 mol/L的磷酸緩沖液(pH為各底物的最適pH),0.4 mL酶液,1.8 mL、20 mmol/L底物(L-DOPA、鄰苯二酚、甲基多巴)混合后,置于各底物的最適溫度下水浴5 min,取出立即放入冰中終止反應,用紫外分光光度計在300～700 nm波長范圍內每隔2 nm進行掃描,確定PO酶催化各底物的產物最大吸收波長(λmax)。

1.2.5 酶活測定 通過測定反應體系中醌類物質形成的初始速度來計算酶的活性,使用紫外分光光度計在產物最大吸收波長處測定反應初期產物生成量的變化[7]。將1.8 mL的底物和1.8 mL的磷酸緩沖液(pH為各底物的最適pH)混合,置于各底物的最適溫度下水浴2 min,然后加入預先在最適溫度下預熱2 min的PO酶0.4 mL,立即將混合液置于比色皿中,選擇紫外可見分光光度計動力學模塊,在產物的最大吸收波長(λmax)下測定反應液的吸光度,每隔5 s記錄1次吸光值,測定6 min,選取反應體系吸光值A直線上升區(qū)間數據計算酶活,此階段屬于酶促反應的初速度階段。

一個酶活力單位(U)定義為,單位體積酶液(mL)在單位時間(min)內使酶促反應體系吸光值增加0.001,定義為1個酶活力單位[8-9],用U(或U/mL)表示,見公式(1)。

式(1)

其中,ΔA為吸光值變化量,t為反應時間(min),D為反應體系總體積(mL)/參加反應的酶液(mL)。

本實驗中相對酶活性表示為被測酶活性與該檢測組中最大酶活之間的比值,見公式(2)。

式(2)

酶促反應速率以單位時間內(min)的吸光值(A)的增加量表示,見公式(3)。

式(3)

1.2.6 PO酶分別催化三種底物的最適溫度的測定 用0.067 mol/L、pH6.8的磷酸緩沖液配置0.02 mol/L的L-DOPA,0.02 mol/L的鄰苯二酚,0.015 mol/L的甲基多巴三種底物。L-DOPA在pH6.8、甲基多巴在pH7.2、鄰苯二酚在pH8.0條件下,測定25～70 ℃(每隔5 ℃)下,PO酶催化三種底物的最適溫度,操作步驟參考1.2.5,以相對酶活性表示酶的活性[10]。

1.2.7 PO酶分別催化三種底物的最適pH的測定 配制0.05 mol/L的不同緩沖液:醋酸-醋酸鈉緩沖液提供pH為4.4～5.6的反應環(huán)境;磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液提供pH為6～8.4的反應環(huán)境;甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液提供pH為8.8～9.2的反應環(huán)境。用不同pH的緩沖液分別配制0.02 mol/L的L-DOPA、0.02 mol/L的鄰苯二酚,0.015 mol/L的甲基多巴作為反應底物。L-DOPA在45 ℃、甲基多巴在40 ℃、鄰苯二酚在30 ℃條件下,測定不同pH(4.4～9.2)條件下PO酶的活性,操作步驟參考1.2.5,以相對酶活性表示酶的活性[10]。

1.2.8 PO酶分別催化三種底物的酶促動力學常數Km、Vmax值測定 反應溫度為45 ℃、pH為6.8條件下,測定當L-DOPA在反應體系中不同濃度(2.5、5、7.5、10、12.5、15 mmol/L)下,反應體系的反應速率;反應溫度為40 ℃、pH為7.2條件下,測定當甲基多巴在反應體系中不同濃度(10、20、30、40、50、60 mmol/L)下,反應體系的反應速率;反應溫度為30 ℃、pH為8.0條件下,測定當鄰苯二酚在反應體系中不同濃度(10、20、30、40、50、60 mmol/L)下,反應體系的反應速率。然后采用Lineweaver-Burk作圖法計算出PO酶催化每種底物的Km、Vmax值。

1.2.9 溫度對酶促反應動力學參數的影響 L-DOPA在pH6.8、甲基多巴在pH7.2、鄰苯二酚在pH8.0條件下,反應溫度選30、40、50 ℃,測定反應體系中L-DOPA不同濃度(2.5、5、7.5、10、12.5、15 mmol/L)、甲基多巴不同濃度(5、10、15、20、25、30 mmol/L)、鄰苯二酚不同濃度(5、10、15、20、25、30 mmol/L)下,PO酶的催化速率,然后采用Lineweaver-Burk作圖法計算出Km、Vmax值。

1.2.10 PO酶分別催化三種底物活化能計算 酶催化底物的實質是降低底物參加反應時的活化能,反應溫度不同,酶促反應速度也不同。溫度對酶促反應的影響可以利用Arrhenius公式來進行分析:

K=K0e(-Ea/RT)

式(4)

公式兩邊取對數變?yōu)?/p>

式(5)

式(6)

其中,K為平衡常數;K0為指數系數,Ea為活化能;R為氣體常數。

由于反應速度V與反應速度常數K成正比,從公式(5)可知LnK與1/T成反比,以LnK為縱坐標,I/T為橫坐標做圖,由回歸方程直線斜率公式(6)求出PO酶活化不同底物表觀活化能Ea[11-12]。

2 結果與分析

2.1 南美白對蝦酚氧化酶純化結果

經50%硫酸銨沉淀收集的PO酶透析除鹽,然后用DEAE Sepharose Fast Flow弱陰離子交換柱進一步純化,選用含NaCl的磷酸緩沖液進行洗脫,洗脫曲線如圖1A所示。從圖1A可以看出,當采用不含NaCl的平衡緩沖液進行洗脫時,出現一個蛋白峰,但其酶活很低,說明此峰為穿透峰,蛋白質大部分為雜蛋白,PO酶蛋白基本都牢固地吸附在柱子上;采用含0.1～0.6 mol/L 的NaCl磷酸緩沖液進行梯度洗脫,含0.3 mol/L和0.4 mol/L NaCl的磷酸緩沖液洗脫時PO酶活性較高,但含0.3 mol/L NaCl的磷酸緩沖液洗脫的酶雜蛋白含量較高,所以收集含0.4 mol/L NaCl的磷酸緩沖液洗脫的收集管,濃縮后貯藏于-80 ℃冰箱中備用。

圖1 南美白對蝦PO酶純化結果 Fig.1 Purification and profile of PO from Litopenaeus vannamei注:(A)PO酶經DEAE Sepharose Fast Flow弱陰離子交換柱純化(B)SDS-PAGE檢測不同步驟對PO酶純化效果。M:蛋白MAK;泳道1:粗酶液;泳道2:50%硫酸銨沉淀;泳道3:DEAE Sepharose Fast Flow純化結果。

采用SDS-PAGE凝膠電泳檢測純化后的酶液,考馬斯亮藍R-250進行蛋白染色,結果見圖1B,粗酶液(泳道1)、經50%硫酸銨沉淀(泳道2)、經DEAE Sepharose Fast Flow弱陰離子交換柱后(泳道3),可以看出雜蛋白逐漸減少,泳道3共有5個較明顯的亞基帶,分子量約為66.2 ku和40 ku的蛋白亞基較強。PO酶經過這兩步純化后,酶的比活力為517.24 U/mg(946.55 U/mL),是粗酶液純度的8.55倍,結果見表1,可以滿足研究酶與底物作用特點實驗的需求。

表1 南美白對蝦PO酶提取過程比活力及純化倍數變化
Table 1 Fold change of specific activity ofLitopenaeusvannameiPO enzyme extraction and purification

純化步驟總酶活(U)體積(mL)蛋白濃度(mg/mL)總蛋白(mg)比活力(U/mg)回收率(%)純化倍數粗酶28328832400117146846048100150%(NH4)2SO41148937566101667056171344056283DEAESepharoseFastFlow3975507421837686517241403855

2.2 PO酶分別催化三種底物生成的產物最大吸收波長、最適溫度、最適pH

本研究中對PO酶催化L-DOPA、甲基多巴、鄰苯二酚形成的產物最大吸收波長進行了測定;因提取酶的緩沖溶液、底物的性質、同工酶的形式、實驗中緩沖液的類型都有可能影響到酶催化底物的最適溫度與最適pH[8,13],所以研究中對南美白對蝦PO酶在本實驗條件下催化三種底物的最適溫度、最適pH也進行了測定,具體結果見表2。

表2 PO酶催化三種底物生成的產物最大吸收波長、最適溫度、最適pH
Table 2 The maximum absorption wavelength, optimum temperature and optimum pH of PO enzymatic products with different substrates

底物產物最大吸收波長(nm)最適溫度(℃)最適pHL-DOPA4704568甲基多巴4534072鄰苯二酚5253080

2.3 PO酶分別催化三種底物的酶促動力學常數Km、Vmax值

表3 PO酶催化三種底物的Lineweaver-Burk方程及動力學參數
Table 3 Lineweaver-Burk equation and kinetic parameters of PO catalyzed substrates

底物Lineweaver-BurkR2Km(mmol/L)Vmax(ΔA/min)L-DOPA1/V=400889/[S]+160338098372500300624甲基多巴1/V=581748/[S]+99171098435866101008鄰苯二酚1/V=108932/[S]+59109099281842901692

Km是酶與底物結合的特征性物理常數,與反應條件有關。在特定的反應條件下,Km值的大小只與酶的性質有關,與酶的濃度無關,同一酶催化不同的底物有不同的Km值,酶與底物的結合能力與1/Km成正比。南美白對蝦PO酶催化L-DOPA、甲基多巴、鄰苯二酚酶促反應的Lineweaver-Burk雙倒數作圖結果見圖2,根據回歸方程計算得到PO酶催化三種底物的動力學參數Km值和Vmax值,具體結果見表3。從結果中可知PO酶與三種底物的結合能力從大到小依次為鄰苯二酚、L-DOPA、甲基多巴。研究發(fā)現酚氧化酶的活性中心除了有與底物羥基結合的位點,還有兩個和芳香基團結合的位點,這個結構是酶與底物結合的專一性的基礎[14]。本研究選擇的三個雙酚底物的結構,從簡單到復雜依次是鄰苯二酚、L-多巴,甲基多巴,所以由此可以推測,底物結構越簡單,越容易與酶活性中心結合。

圖2 PO酶催化三種底物的Lineweaver-Burk圖 Fig.2 Lineweaver-Burk plot of PO

2.4 PO酶分別催化三種底物的活化能

圖3 不同溫度下PO酶催化三種底物的Lineweaver-Burk圖Fig.3 Effect of temperature on PO enzymatic activity with different catalytic substrates

2.4.1 溫度對酶促反應動力學參數的影響 在不同溫度下南美白對蝦PO酶催化三種底物的酶促反應Lineweaver-Burk雙倒數作圖結果見圖3,根據回歸方程計算得到不同溫度下PO酶催化同一底物的動力學參數,結果見表4。從結果中可以看出,隨著反應溫度的增加,PO酶催化同一底物的反應體系的Vmax都增加,說明在酶不發(fā)生變性的溫度范圍內,隨著外界溫度的增加,單位時間內被活化的底物分子的量在增加。從Km值的變化可以看出,在這個溫度范圍內,隨著外界溫度的增加,PO酶與L-DOPA的結合能力在增加,而PO酶與甲基多巴和鄰苯二酚的結合能力在降低。同時根據Vmax/Km比值的變化,也可以得出,PO酶與鄰苯二酚的結合受外界溫度的影響最大,隨著反應溫度的增加,Vmax/Km比值逐漸降低,酶與鄰苯二酚的結合能力降低明顯,說明PO酶催化鄰苯二酚的生化反應穩(wěn)定的溫度范圍較小。PO酶催化L-DOPA、甲基多巴的Vmax/Km比值隨反應溫度的變化不大,說明酶與底物的結合能力受溫度的影響較小。如果在PO酶活性研究中,影響因素有溫度這一條件時,不應該選擇鄰苯二酚作為底物。

表4 不同溫度下PO酶催化三種底物的Lineweaver-Burk方程及動力學參數
Table 4 Lineweaver-Burk parameters of PO with different catalyzed substrates at different temperatures

底物名稱溫度(℃)Vmax(ΔA/min)Km(mmol/L)Vmax/KmLineweaver-BurkR2L-DOPA3040500056700674008244164527892357260013600242002311/V=734848/[S]+1764571/V=414042/[S]+1484461/V=433684/[S]+121393099150992209825甲基多巴3040500054600714008535316265014783860010300110001091/V=973898/[S]+1831931/V=911160/[S]+1401481/V=919223/[S]+117269099070987709887鄰苯二酚3040500186002087024061902335310562410097800591004281/V=102271/[S]+537621/V=169169/[S]+479091/V=233725/[S]+41558099630983409889

2.4.2 PO酶催化三種底物的活化能 化學反應中,反應物分子從基態(tài)轉變?yōu)槿菀装l(fā)生化學反應的活躍狀態(tài)所需要的最小能量稱為活化能。由Arrhenius(阿倫尼烏斯)公式推導出來的活化能,又稱阿倫尼烏斯活化能或表觀活化能。根據溫度對酶促反應動力學參數的影響結果(表4),以LnK(即各溫度下的LnVmax)為縱坐標,I/T為橫坐標做圖,結果為圖4,由回歸方程直線斜率求出PO酶活化不同底物的表觀活化能Ea,結果見表5。由結果可知,PO酶催化L-DOPA,甲基多巴,鄰苯二酚生成醌類物質過程中,PO酶與底物形成中間產物,底物被活化,所需的表觀活化能分別是15.2158、18.1981、10.4696 kJ/mol。這個結果與2.3結果中PO酶與三種底物的結合能力統(tǒng)一分析可以得出,底物與酶的結合能力越強,酶活化底物時所需的表觀活化能越小。

圖4 PO酶催化三種底物的l/T-Ln(Vmax)圖Fig.4 l/T - Ln(Vmax)graph of PO with different catalytic substrates

表5 PO酶催化三種底物的表觀活化能(Ea)
Table 5 Activation energy of PO with different catalytic substrates

底物溫度(℃)Ln(Vmax)回歸方程lnK=lnK0-EaRTR2表觀活化能(kJ/mol)L-DOPA304050-28705-26976-24964Ln(Vmax)=-18301418/T+3160109923152158甲基多巴304050-29080-26401-24619Ln(Vmax)=-21888476/T+4324609812181981鄰苯二酚304050-16820-15667-14245Ln(Vmax)=-12592795/T+2466309876104696

3 結論

研究中采用50%硫酸銨鹽析、DEAE Sepharose Fast Flow弱陰離子交換柱層析對南美白對蝦PO酶進行分離,經過這兩步純化后,酶的比活力為517.24 U/mg(946.55 U/mL),是粗酶液純度的8.55倍。PO酶與三種雙酚底物的結合能力從大到小依次是鄰苯二酚、L-DOPA、甲基多巴;催化三種底物的活化能從小到大依次是鄰苯二酚、L-DOPA、甲基多巴。PO酶與鄰苯二酚的結合能力較強,同時活化鄰苯二酚的活化能最小,這可能是因為鄰苯二酚結構比L-DOPA和甲基多巴簡單,更容易與酶的活性中心結合有關,但PO酶與鄰苯二酚的結合受外界溫度的影響較大,隨著反應溫度的增加,酶與鄰苯二酚的結合能力降低比較快,所以,在研究蝦類PO酶活性時,如果影響因素有溫度這一條件時,那么不應該選擇鄰苯二酚作為底物。

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Biochemical characteristics of phenol oxidase in Penaeus vannamei on different substrates

LV Yan-fang1,2,ZHANG Si-han2,CAI Lu-yun2,LI Jian-rong2,YANG Ming-duo1,*

(1.College of Food Engineering,Harbin University of Commerce,Harbin 150076,China; 2.College of Food Science and Technology,Bohai University,Jinzhou 121013,China)

To reveal the changes of biochemical characteristics(phenoloxidase,PO)ofPenaeusvannameiin catalyze with different substrates. In this paper,L-dopa,methyldopa,catechol were taken as substrates,the optimum temperature of PO were measured by enzymatic oxidation with the three substrates,the pH optimum,enzyme kinetics constants Km,Vmaxthe value of activation energy were determined. The results showed that when PO enzyme catalyzed L-dopa,methyldopa and catechol,the optimum temperature were 45,40,30 ℃,the optimum pH was 6.8,7.2,8.0,the enzymatic kinetic constants were 2.5003,5.8661,1.8429 Kmmmol/L and Vmaxwere 0.0624,0.1008,0.1692 ΔA/min,activation energy Ea were 15.2158,18.1981,10.4696 kJ/mol,respectively. Catechol binding with PO was stronger,but the combination was greatly influenced by the outside temperature,while the effects of temperature on PO combination with L-dopa and methyldopa were less. So it can be speculated that the simpler the substrate structure was the easier the combination with the active center of the PO;the stronger the enzyme substrate binding ability was the less activation energy was desired. In PO enzyme studies,if the temperature was included in factors,catechol should not be chosen as a substrate.

Penaeusvannamei;phenoloxidase;enzymatic reactions;kinetics;activation energy

2016-05-12

呂艷芳(1977-)，女，在讀博士，講師，研究方向：水產品貯藏加工，E-mail:lvyanfang2003@126.com。

*通訊作者:楊銘鐸(1956-)，男，博士，教授，研究方向：烹飪科學與傳統(tǒng)食品工業(yè)化技術，E-mail:yangmingduo5663@163.com。

遼寧省科技攻關項目(2015103020)。

TS254.1

A

1002-0306(2016)23-0139-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.23.018