劉娜 劉志敏 宋東輝，

（1. 天津科技大學(xué)海洋與環(huán)境學(xué)院，天津 300457；2. 天津市海洋資源與化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

在我國(guó)水污染控制中，含酚廢水被列為重點(diǎn)解決的有害廢水之一［1]。其中鄰苯二酚作為一種重要的有機(jī)化學(xué)中間體，大量應(yīng)用于印染業(yè)、石油化工業(yè)、造紙業(yè)、制藥業(yè)及化妝品等行業(yè)［2]，因此與之相關(guān)的也伴隨著各行各業(yè)大量排放含酚廢水。目前含酚廢水的處理方法［3-4]有物理法包括吸附法、萃取法、離子交換法等；化學(xué)法包括濕式空氣氧化法、化學(xué)氧化法、濕式催化氧化法等；生化法包括生物膜法、厭氧法和活性污泥法等，其中生化法因無(wú)二次污染而被廣泛應(yīng)用。

苯甲酸為芳香族化合物代謝過(guò)程中的一種中間產(chǎn)物，苯甲酸及其苯甲酸鈉廣泛應(yīng)用在食品業(yè)、化工業(yè)和染料工業(yè)，導(dǎo)致其成為工業(yè)廢水常見(jiàn)的環(huán)境污染物。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，苯甲酸鈉能夠降低雄性生殖細(xì)胞質(zhì)量，并且有遺傳毒性和致突變毒性［5]。此外，苯甲酸鈉還能破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使蛋白結(jié)構(gòu)變得更加疏松［6]。生活中苯甲酸鈉和鄰苯二酚的污染日益嚴(yán)重，嚴(yán)重影響人們生活健康，而微生物修復(fù)技術(shù)作為一種經(jīng)濟(jì)、高效、無(wú)二次污染的治理技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用在水污染處理中，成為目前最具有潛力的治理方法［7]。

本研究前期分離篩選的石油烴降解菌Acinetobactersp.Tust-DM21可以高效降解原油中芳香烴組分［8]。此外，還發(fā)現(xiàn)其能夠利用其他苯類物質(zhì)如鄰苯二酚、苯甲酸鈉作為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)，為了研究其降解鄰苯二酚、苯甲酸鈉的能力，本試驗(yàn)測(cè)定了其在不同培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)情況和對(duì)這兩種苯類化合物的降解情況，以及鄰苯二酚-1，2雙加氧酶、苯甲酸1，2-雙加氧酶的酶活和鄰苯二酚1，2-雙加氧酶的動(dòng)力學(xué)反應(yīng)常數(shù)，旨為污水處理苯類物化合物提供備選菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

LB培養(yǎng)基：酵母浸粉5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 10.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH調(diào)至7.0-7.2。

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：Na2HPO41.5 g，KH2PO41.5 g，（NH4）2SO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl20.01 g，F(xiàn)eSO4·12H2O 0.02 g，加蒸餾水定容至1 L。

上述培養(yǎng)基在高壓蒸汽滅菌鍋中1×105Pa滅菌20 min。

菌株：石油烴降解菌Acinetobactersp. Tust-DM21由本實(shí)驗(yàn)室前期分離自渤海灣海洋石油勘探船廢油收集區(qū)［8]，存于40%甘油，-80℃冷藏。該菌株已被中國(guó)海洋微生物菌種保藏管理中心（http：//mccc.org.cn/）收藏，菌株編號(hào)MCCC 1K03249，其16S rRNA序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄號(hào)為 KX390866。

1.2 方法

1.2.1 鄰苯二酚、苯甲酸鈉測(cè)定方法的建立［9-10]鄰苯二酚和苯甲酸鈉濃度的測(cè)定采用紫外分光光度法，用蒸餾水分別配置不同底物濃度的溶液，在275 nm和224 nm下分別測(cè)定不同濃度鄰苯二酚及苯甲酸鈉溶液的吸光值，然后以底物濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 菌懸液的制備 活化石油烴降解菌，并培養(yǎng)至生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，然后取1 mL菌液轉(zhuǎn)接到100 mL LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12 h后，5 000 r/min，離心5 min，棄上清，用無(wú)菌蒸餾水重懸菌體，重新離心，反復(fù)3次，最后用等量的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基懸浮，并使OD600維持在1.0左右。

1.2.3 鄰苯二酚、苯甲酸鈉降解率的測(cè)定［9-10]將制備好的菌懸液分別加入以鄰苯二酚或苯甲酸鈉為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液中，以不接菌的培養(yǎng)基為空白對(duì)照，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行，然后30℃，150 r/min震蕩培養(yǎng)，分別在不同的時(shí)間點(diǎn)取樣，8 000 r/min，離心2 min，取上清，在各自波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，根據(jù)吸光度值和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算底物含量，底物的降解率計(jì)算如下：

其中，N0：初始底物濃度，N1：剩余底物濃度。

1.2.4 不同培養(yǎng)條件下石油烴降解菌對(duì)鄰苯二酚、苯甲酸鈉的降解

1.2.4.1 不同接菌量對(duì)石油烴降解菌降解鄰苯二酚、苯甲酸鈉的影響 在鄰苯二酚濃度為600 mg/L，苯甲酸鈉濃度為1 500 mg/L，培養(yǎng)基初始pH為6.5的條件下，各自分別接入1%、3%、5%、7%和9%的菌液，以不接菌液的培養(yǎng)基為空白對(duì)照，每個(gè)樣品做3個(gè)平行，30℃，150 r/min震蕩培養(yǎng)，并按照1.2.3的方法測(cè)定底物濃度。

1.2.4.2 不同底物濃度對(duì)石油烴降解菌降解鄰苯二酚、苯甲酸鈉的影響 在培養(yǎng)基初始pH為6.5，接菌量為5%的條件下，分別配置鄰苯二酚濃度為200、400、600、700和 800 mg/L；接菌量為3%，苯甲酸鈉濃度為1 500、2 500、3 500、4 500和5 500 mg/L的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，以不接菌的培養(yǎng)基為空白對(duì)照，每個(gè)樣品做3個(gè)平行，30℃，150 r/min震蕩培養(yǎng)，并按照1.2.3的方法測(cè)定底物濃度。

1.2.4.3 不同pH值對(duì)石油烴降解菌降解鄰苯二酚、苯甲酸鈉的影響 鄰苯二酚在堿性環(huán)境中容易氧化，當(dāng)pH值在9.0以上時(shí)，菌株對(duì)鄰苯二酚的利用率遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于鄰苯二酚的氧化速率，且在9 h后鄰苯二酚已經(jīng)氧化變黑，試驗(yàn)指標(biāo)難以測(cè)定。所以在鄰苯二酚濃度為600 mg/L，接菌量為5%的條件下，把培養(yǎng)基pH值分別調(diào)為4.0、5.0、6.0、7.0和8.0，以不接菌的培養(yǎng)基為空白對(duì)照，每個(gè)樣品做3個(gè)平行，30℃，150 r/min震蕩培養(yǎng)，并按照1.2.3的方法測(cè)定鄰苯二酚濃度。

該菌從海洋環(huán)境中分離純化出來(lái)，適宜在弱堿性的環(huán)境中生長(zhǎng)。在苯甲酸鈉濃度為1 500 mg/L，接菌量為3%的條件下，把pH值調(diào)為7.0、8.0、9.0、10.0和11.0，以不接菌的培養(yǎng)基為空白對(duì)照，每個(gè)樣品做3個(gè)平行，30℃，150 r/min震蕩培養(yǎng)，并按照1.2.3的方法測(cè)定苯甲酸鈉濃度。

1.2.4.4 不同溫度對(duì)石油烴降解菌降解鄰苯二酚、苯甲酸鈉的影響 在鄰苯二酚濃度為600 mg/L、接菌量為5%；以及苯甲酸鈉濃度為1 500 mg/L、接菌量為3%的條件下，設(shè)置不同溫度值（20、25、30、35和40℃），以不接菌的培養(yǎng)基為空白對(duì)照，每個(gè)樣品做3個(gè)平行，30℃，150 r/min震蕩培養(yǎng)，并按照1.2.3的方法測(cè)定鄰苯二酚濃度和苯甲酸鈉濃度。

1.2.5 鄰苯二酚1，2-雙加氧酶的粗酶特性

1.2.5.1 細(xì)胞粗酶液的制備 將菌懸液接入以鄰苯二酚為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，12 h搖床培養(yǎng)，5 000 r/min離心5 min，棄上清，然后用磷酸鹽緩沖溶液（pH7.0）洗滌菌體3次，經(jīng)超聲波破碎，最后4℃、12 000 r/min離心15 min，上清液用于酶活測(cè)定。酶活力的計(jì)算公式為：U/mg=△A×V/（ε×M），其中△A：260nm下每分鐘光密度變化值，V：酶活測(cè)定體積（L），ε：鄰苯二酚在260 nm下的摩爾消光系數(shù) 1 L/（mmol·cm），M：測(cè)定體系中蛋白質(zhì)量（mg）。

1.2.5.2 溫度、pH對(duì)酶活力的影響 鄰苯二酚1，2-雙加氧酶的活力以單位時(shí)間內(nèi)反應(yīng)產(chǎn)物黏康酸在260 nm處的光吸收值測(cè)定。酶活力測(cè)定總體系為10 mL，內(nèi)含濃度為20 mg/L的鄰苯二酚0.5 mL、粗酶液2.5 mL、磷酸鹽緩沖溶液7 mL。通過(guò)單位時(shí)間內(nèi)吸光度的變化值和體系中的蛋白含量來(lái)計(jì)算酶活力［11]，其中體系中蛋白的含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法［12]。

利用不同緩沖溶液的pH緩沖范圍，在pH值為6.0-10.0范圍內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)，探究粗酶的最適pH。

在15-45℃下，分別測(cè)定粘康酸在260 nm下吸光度值隨時(shí)間的變化，探討粗酶的最適反應(yīng)溫度。

1.2.5.3 粗酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的測(cè)定 在最適溫度和最適pH條件下，固定粗酶液加入量，以不同濃度鄰苯二酚（50-300 μmol/L）為底物，在1.2.5.2的反應(yīng)體系中進(jìn)行，依據(jù)底物濃度和相應(yīng)的酶促反應(yīng)速率作Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖，得到Km和Vmax。

1.2.6 苯甲酸1，2-雙加氧酶酶活測(cè)定［13]將菌懸液接種到以苯甲酸鈉為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，過(guò)夜培養(yǎng)，所獲得的菌體用于酶活的測(cè)定，其中NADH的濃度為30 mmol/L，在1.2.5.2的反應(yīng)體系中進(jìn)行，檢測(cè)波長(zhǎng)為340 nm。

2 結(jié)果

2.1 鄰苯二酚、苯甲酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

用紫外分光光度計(jì)分別在275 nm和224 nm下測(cè)定鄰苯二酚、苯甲酸鈉的吸光度。以鄰苯二酚、苯甲酸鈉濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1。

2.2 不同培養(yǎng)條件對(duì)菌株Tust-DM21降解鄰苯二酚、苯甲酸鈉的影響

2.2.1 不同接種量對(duì)菌株降解鄰苯二酚、苯甲酸鈉的影響 不同接種量對(duì)菌株降解鄰苯二酚和苯甲酸鈉的影響分別如圖2-A、圖2-B所示。從圖2-A中可以看出隨著接種量的增加，石油烴降解菌對(duì)鄰苯二酚的降解速率也逐漸增加，當(dāng)接種量為1%時(shí)，菌株延滯期增長(zhǎng)，而鄰苯二酚隨著延滯期增長(zhǎng)的這段時(shí)間會(huì)發(fā)生部分氧化，導(dǎo)致菌株可能受到其氧化產(chǎn)物的毒害作用，不能正常利用鄰苯二酚。當(dāng)接種量為5%以上時(shí)，菌株在18 h時(shí)對(duì)鄰苯二酚的降解速率都能達(dá)到88%以上，出于節(jié)省接菌量和較高的降解速率，確定5%為菌株降解鄰苯二酚的最佳接菌量。

圖1 （A）鄰苯二酚、（B）苯甲酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線

在含有1 500 mg/L苯甲酸鈉無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，分別以1%、3%、5%、7%和9%的接種量接種，震蕩培養(yǎng)36 h，測(cè)定苯甲酸鈉的降解率，結(jié)果如圖2-B，從圖中可以看出當(dāng)接種量為7%、9%時(shí)，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)菌株對(duì)苯甲酸鈉降解率相差不大。當(dāng)接種量為3%、5%時(shí)，在18 h內(nèi)菌株對(duì)苯甲酸鈉的降解率已達(dá)80%以上，在21 h時(shí)降解率都達(dá)到95%以上。當(dāng)接種量為1%時(shí)，菌株達(dá)到最高降解率所用時(shí)間最長(zhǎng)，出于節(jié)省接菌量和較高的降解速率，選用3%為最佳接菌量。

圖2 接種量對(duì)菌株降解鄰苯二酚（A）、苯甲酸鈉（B）的影響

2.2.2 不同底物濃度對(duì)菌株Tust-DM21降解鄰苯二酚、苯甲酸鈉的影響 在含有不同鄰苯二酚濃度的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入5%的接種量，30℃，150 r/min震蕩培養(yǎng)36 h，鄰苯二酚降解率和菌株生長(zhǎng)分別如圖3-A、3-B。從圖3-A、3-B可以看出底物濃度不超過(guò)700 mg/L時(shí)，菌株對(duì)鄰苯二酚的降解率都達(dá)到90%以上，菌株的OD600也隨著底物濃度的增加而增加，刺激了菌株的生長(zhǎng)。當(dāng)?shù)孜餄舛葹?00 mg/L時(shí)，菌株受到鄰苯二酚的毒害作用，抑制了菌株的生長(zhǎng)，菌株的OD600僅達(dá)到0.160左右，導(dǎo)致其對(duì)鄰苯二酚的降解率急劇下降，僅有30%左右，故700 mg/L為該菌株的最大耐受濃度。當(dāng)鄰苯二酚濃度為600 mg/L時(shí)，菌株的生物量較大，在36 h內(nèi)能夠更直觀的反應(yīng)菌株在鄰苯二酚中的生長(zhǎng)變化情況，相比于700 mg/L，菌株在600 mg/L鄰苯二酚中降解效果更好，所以選用底物濃度為600 mg/L的鄰苯二酚進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)的研究。

以3%的接種量接種到含有不同苯甲酸鈉濃度的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)36 h后測(cè)定培養(yǎng)基中苯甲酸鈉的含量，計(jì)算其降解率，菌株生長(zhǎng)和對(duì)苯甲酸鈉的降解率如圖3-C。從圖3-C中可以看出，當(dāng)苯甲酸鈉的濃度小于2 500 mg/L時(shí)，菌株對(duì)苯甲酸鈉有較高的降解率，達(dá)95%以上。隨著苯甲酸鈉濃度的增加，菌株受到其毒害作用，其生長(zhǎng)受到抑制。當(dāng)苯甲酸鈉濃度為4 500 mg/L時(shí)，菌株對(duì)苯甲酸鈉的降解率僅有10%，所以菌株對(duì)苯甲酸鈉的最大耐受濃度為4 500 mg/L。

圖3 不同底物濃度對(duì)菌株降解鄰苯二酚、苯甲酸鈉的影響

2.2.3 不同pH值對(duì)菌株降解鄰苯二酚、苯甲酸鈉的影響 以5%的接種量接種到不同初始pH值的無(wú)機(jī)鹽液體基中，培養(yǎng)36 h，確定菌株降解鄰苯二酚的最適pH，結(jié)果如圖4-A所示，在偏酸環(huán)境中該菌株的生長(zhǎng)受到抑制，導(dǎo)致其在pH值為4.0、5.0 中不能更好的利用鄰苯二酚。在pH值為6.0時(shí)菌株對(duì)鄰苯二酚的降解達(dá)到最高為94.8%，確定最佳pH值為6.0，此外菌株在pH值為6.0-8.0范圍內(nèi)都有較好的降解范圍。

菌株Tust-DM21是從海洋中分離純化出來(lái)的，適宜在弱堿性的環(huán)境中生長(zhǎng)，用NaOH或HCl調(diào)整培養(yǎng)基的初始pH值為6.0-11.0，菌株對(duì)苯甲酸鈉的降解率如圖4-B。在pH值7.0-11.0范圍內(nèi)，菌株對(duì)苯甲酸鈉都有較高的降解率達(dá)80%以上，在pH值為8.0時(shí)降解率達(dá)到最高為97.6%，確定最佳pH值為8.0。

2.2.4 不同溫度對(duì)菌株降解鄰苯二酚、苯甲酸鈉的影響 不同溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)及鄰苯二酚、苯甲酸鈉降解的影響分別如圖5-A、5-B所示。菌株在25-35℃時(shí)對(duì)鄰苯二酚、苯甲酸鈉的降解率較高，達(dá)到80%以上，當(dāng)溫度達(dá)到40℃時(shí)，菌株不能正常生長(zhǎng)，說(shuō)明該菌適宜在中性溫度中生長(zhǎng)。菌株對(duì)鄰苯二酚、苯甲酸鈉的最佳降解溫度為35℃，其降解率分別高達(dá)92.7%、95.9%。

2.3 鄰苯二酚1, 2-雙加氧酶的粗酶特性

2.3.1 pH值、溫度對(duì)酶活力的影響 pH值是影響酶活力的重要因素之一，pH過(guò)高或過(guò)低會(huì)破壞蛋白酶的穩(wěn)定性，使酶受到不可逆的破壞。在不同pH值的緩沖溶液中測(cè)定鄰苯二酚1，2-雙加氧酶的活力，結(jié)果如圖6-A所示，隨著pH值增加，鄰苯二酚1，2-雙加氧酶的酶活也隨之增高，在pH值為8.0時(shí)，Tust-DM21粗酶液的酶活達(dá)到最高為3.56 U。當(dāng)pH值繼續(xù)增加時(shí)，鄰苯二酚1，2-雙加氧酶的活性隨之降低，降低到1.16 U，所以在pH值5.0-10.0范圍內(nèi)，粗酶液的最佳pH值為8.0。

圖4 pH對(duì)菌株生長(zhǎng)和菌株降解鄰苯二酚、苯甲酸鈉的影響

圖5 溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)和菌株降解鄰苯二酚、苯甲酸鈉的影響

溫度是影響酶活力的另一個(gè)重要因素，溫度過(guò)高蛋白酶易變性從而導(dǎo)致酶失活，溫度較低時(shí)酶活性不高。分別在不同溫度下測(cè)定粗酶液的酶活力，結(jié)果如圖6-B所示，在15-35℃范圍內(nèi)，隨著溫度升高，鄰苯二酚1，2-雙加氧酶的活力也逐漸增加，在35℃時(shí)達(dá)到最大為3.93 U，當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)，粗酶液的酶活力逐漸降低到0.39 U，所以鄰苯二酚1，2-雙加氧酶在35℃時(shí)酶活力最高。

圖6 pH值（A）、溫度（B）對(duì)酶活的影響

2.3.2 粗酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的測(cè)定 固定酶的加入量，分別測(cè)定不同鄰苯二酚濃度（50-300 μmol/L）的降解速率，依據(jù)底物濃度和相應(yīng)的酶促反應(yīng)速率作Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖，如圖7所示，得到該酶作用于鄰苯二酚的米氏常數(shù)為25.68 μmol/L，最大反應(yīng)速度為0.13 mol/（L·min）。米氏常數(shù)的大小反映酶和底物的親和程度，值越小說(shuō)明酶和底物的親和力越好。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的米氏常數(shù)為25.68 μmol/L，說(shuō)明該酶與底物有較好的親和力。

圖7 鄰苯二酚1，2-雙加氧酶酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

2.3.3 苯甲酸1，2-雙加氧酶酶活測(cè)定 苯甲酸鈉1，2-雙加氧酶酶活測(cè)定如圖8，隨著反應(yīng)時(shí)間的加長(zhǎng)，粗酶液在340 nm下的吸收值不斷減小，在15 min內(nèi)NADH吸光度的變化值為0.42，說(shuō)明反應(yīng)體系中的NADH不斷被苯甲酸1，2-雙加氧酶氧化。

圖8 苯甲酸鈉1，2-雙加氧酶酶活測(cè)定

3 討論

鄰苯二酚作為一種常見(jiàn)環(huán)境激素化合物，具有易富集、難降解的特點(diǎn)，且毒性比苯酚大，同時(shí)其毒性能夠通過(guò)食物鏈進(jìn)行傳遞和放大，對(duì)水生生物如水蚤、鮭魚(yú)等產(chǎn)生毒害作用，破壞海洋生態(tài)環(huán)境。雷忻等［14]研究發(fā)現(xiàn)，鄰苯二酚在48 h內(nèi)對(duì)模式生物泥鰍的半致死濃度為96.74 mg/L，并且當(dāng)鄰苯二酚在泥鰍體內(nèi)聚集濃度越大，其毒性也會(huì)隨之增強(qiáng)。環(huán)境中鄰苯二酚的污染日益嚴(yán)重，而微生物修復(fù)作為一種經(jīng)濟(jì)有效的去除有機(jī)污染物的手段，成為目前最具有潛力的治理方式［15]。如張?jiān)撇ǖ龋?6]分離到一株石油烴降解菌JZ3-21，該菌株在接種量為1%時(shí)，30 d內(nèi)對(duì)1 000 mg/L的鄰苯二酚降解率達(dá)80.9%，其接種量小、底物濃度大，使菌株生長(zhǎng)延滯期延長(zhǎng)，在第5-10天時(shí)菌株生長(zhǎng)才進(jìn)入對(duì)數(shù)期，在第15天時(shí)菌株對(duì)鄰苯二酚的降解率僅有50%左右。而本研究所用菌株Tust-DM21在底物濃度為700 mg/L，接種量為3%時(shí)，菌株的延滯期很短僅有12 h左右，12 h后菌株進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在24 h時(shí)進(jìn)入穩(wěn)定期，同時(shí)降解率也達(dá)到最高為90%。說(shuō)明菌株Tust-DM21具有高效性，能夠在較短時(shí)間內(nèi)降解鄰苯二酚，并且降解率高達(dá)94.8%。Bastos等［17]分離到的酵母菌可降解濃度為1 500 mg/L苯酚。胡忠等［18]從海洋分離出的苯酚降解菌能耐受濃度為1 500 mg/L的苯酚，在3 d內(nèi)降解率高達(dá)95%以上。程珂珂等［9]分離純化出一株鄰苯二酚降解菌，并且能耐受濃度為600 mg/L的鄰苯二酚，當(dāng)鄰苯二酚濃度為400 mg/L時(shí)，菌株在3 d內(nèi)對(duì)鄰苯二酚的降解率僅有45%左右。本菌株最大能夠耐受700 mg/L的鄰苯二酚，當(dāng)濃度在700 mg/L以下時(shí)，菌株在2 d內(nèi)對(duì)鄰苯二酚的降解率高達(dá)90%以上，與已經(jīng)報(bào)道的菌株相比，該菌對(duì)鄰苯二酚耐受濃度為700 mg/L，菌株對(duì)鄰苯二酚適應(yīng)性較差，這可能是由于該菌株是從渤海灣海洋石油勘探船廢油收集區(qū)分離純化出來(lái)，并非專門的酚類物質(zhì)降解菌，因此耐受性較差。此外，石油中成分復(fù)雜含有烷烴、芳香烴及多環(huán)芳烴等物質(zhì)，菌株對(duì)這些物質(zhì)的難易降解程度為烷烴＞芳香烴＞多環(huán)芳烴，因此菌株會(huì)優(yōu)先利用烷烴物質(zhì)來(lái)進(jìn)行自身的生長(zhǎng)代謝，在進(jìn)一步利用難降解的芳香烴，這也可能導(dǎo)致菌株對(duì)鄰苯二酚的適應(yīng)性較差。但本菌株除了具有高效降解石油的能力，如對(duì)烷烴的降解率高達(dá)98%，對(duì)環(huán)烴和芳香烴的降解率高達(dá)88%［8]，也能高效降解鄰苯二酚和苯甲酸鈉，其降解底物范圍廣才是本菌株的主要特性。

苯甲酸鈉廣泛應(yīng)用于化工、食品和醫(yī)藥工業(yè)等領(lǐng)域，是一種常見(jiàn)的環(huán)境污染物。對(duì)一般微生物的最小抑菌濃度范圍為0.05%-0.1%，其毒性作用主要表現(xiàn)在：損害神經(jīng)系統(tǒng)；可致機(jī)體癌變（如苯甲酸鈉可以使染色體發(fā)生斷裂從而使機(jī)體癌變）；破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)等。目前已經(jīng)報(bào)道多種細(xì)菌能夠降解苯甲酸，如鹽單胞菌屬、假單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬、紅假單胞菌屬和無(wú)色桿菌屬［19-23]等。蔡寶立等［24]分離出的不動(dòng)桿菌BJ1菌株能降解1 000 mg/L苯甲酸鈉，降解率達(dá)98%以上。方艷芬等［25]篩選的菌株LS01能夠耐受濃度為6 000 mg/L的苯甲酸鈉，當(dāng)濃度不超過(guò)3 000 mg/L 時(shí)，降解率能達(dá)到80%以上。苗艷芳等［26]分離篩選出來(lái)的菌株BJS3對(duì)苯甲酸的最大耐受濃度為6 000 mg/L，在苯甲酸濃度為3 000 mg/L時(shí)，菌株對(duì)苯甲酸的降解率僅有65%左右；當(dāng)其濃度小于2 000 mg/L時(shí)，降解率高達(dá)80%以上。本實(shí)驗(yàn)室保存的菌株Tust-DM21已鑒定為不動(dòng)桿菌屬［27]，其對(duì)苯甲酸鈉的耐受濃度為4 500 mg/L，但當(dāng)其濃度小于2 500 mg/L時(shí)，該菌株對(duì)苯甲酸鈉的降解率優(yōu)于蔡寶立、苗艷芳等分離純化出來(lái)的菌株，其降解率高達(dá)95%以上。菌株Tust-DM21對(duì)鄰苯二酚、苯甲酸鈉的降解特性研究表明，其對(duì)鄰苯二酚、苯甲酸鈉的最高降解率可達(dá)90%以上，其中鄰苯二酚的降解率最高達(dá)94.8%，苯甲酸鈉的降解率最高達(dá)97.6%。因此降解菌譜廣，降解能力高是該菌的主要特點(diǎn)。雖然菌株對(duì)鄰苯二酚、苯甲酸鈉的耐受濃度相對(duì)較低，但其對(duì)底物的適應(yīng)范圍很廣，因此可以嘗試將該菌株與其他菌株混合，利用微生物之間的相互促進(jìn)關(guān)系進(jìn)行環(huán)境修復(fù)，以達(dá)到高效降解污染物的目的，彌補(bǔ)該菌株對(duì)鄰苯二酚、苯甲酸鈉耐受性差的缺點(diǎn)。該菌株可處理含酚、苯甲酸鈉廢水和被石油污染海洋，具有良好的應(yīng)用前景。

正交試驗(yàn)因其能夠快速找到最優(yōu)的試驗(yàn)方案，而備受科研工作者的青睞。本試驗(yàn)在做完單因素分析后，發(fā)現(xiàn)菌株在各個(gè)因素的最佳條件下其降解率在36 h內(nèi)最高能分別達(dá)到94.8%、97.6%，具有較高的降解效果，因此通過(guò)正交試驗(yàn)探尋菌株降解鄰苯二酚、苯甲酸鈉的最優(yōu)條件以及降解率增加的空間已不大，出于成本考慮并未進(jìn)行正交試驗(yàn)。

本試驗(yàn)所用的菌株Tust-DM21已完成基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)含有鄰苯二酚1，2-雙加氧酶和苯甲酸1，2-雙加氧酶［27]，有較高的酶活。其中鄰苯二酚代謝途徑可能是先通過(guò)鄰苯二酚1，2-雙加氧酶鄰位途徑開(kāi)環(huán)形成乙酰輔酶A和琥珀酰輔酶A［28]，再進(jìn)入TCA循環(huán)。而苯甲酸鈉在其苯甲酸1，2-雙加氧酶的作用下先生成中間產(chǎn)物龍膽酸（2，5-Dihydroxy benzoic acid，DHB），然后在DHB脫氫酶的作用下在生成鄰苯二酚［29-30]，然后經(jīng)鄰位開(kāi)環(huán)形成乙酰輔酶A和琥珀酰輔酶A進(jìn)入TCA循環(huán)中。C12O在苯甲酸鈉和鄰苯二酚這兩個(gè)降解途徑中都發(fā)揮了重要作用，因此本研究只需測(cè)定C12O的米氏常數(shù)，Km的測(cè)定多以純酶為主［31]，但也有相關(guān)文獻(xiàn)用粗酶液測(cè)定Km，如艾芳芳等［32]測(cè)定粗酶液中C13O的Km為10.93 μmol/L。本研究測(cè)定菌株Tust-DM21的C12O為胞內(nèi)酶，其米氏常數(shù)為25.68 μmol/L，說(shuō)明酶和底物的親和性較好，酶促反應(yīng)容易進(jìn)行。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)室分離純化出來(lái)的菌株Tust-DM21能夠高效的降解鄰苯二酚和苯甲酸鈉，可以耐受700 mg/L的鄰苯二酚和4 500 mg/L的苯甲酸鈉。菌株降解鄰苯二酚的最佳條件為：接種量5%、pH6.0、溫度35℃，在24 h內(nèi)對(duì)600 mg/L鄰苯二酚降解率達(dá)92%以上。菌株降解苯甲酸鈉的最佳條件為接種量3%、pH8.0、溫度35℃，在24 h內(nèi)對(duì)1 500 mg/L苯甲酸鈉的降解率達(dá)95%以上。通過(guò)測(cè)定鄰苯二酚1，2-雙加氧酶酶活，確定該酶的最適pH為8.0，最適溫度為35℃，其動(dòng)力學(xué)參數(shù)為Km=25.68 μmol/L，Vmax=0.131 mol/（L·min）。