葉淑靜孫斯琪李 琳方 燕楊 琰儲(chǔ)利勝

補(bǔ)陽還五湯含藥血清對(duì)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的影響

葉淑靜1孫斯琪2李 琳3方 燕3楊 琰3儲(chǔ)利勝3

目的觀察不同濃度補(bǔ)陽還五湯（BYHWD）含藥血清對(duì)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HBMECs）增殖和遷移影響。方法補(bǔ)陽還五湯灌胃SD大鼠后腹主動(dòng)脈取血，制備含藥血清；體外培養(yǎng)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HBMECs），隨機(jī)分為空白組（正常大鼠血清）及補(bǔ)陽還五湯含藥血清組，血清濃度分為5%、10%和20%3個(gè)濃度，共6組；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)HBMECs增殖；細(xì)胞劃痕法檢測(cè)HBMECs遷移的相對(duì)距離。結(jié)果與空白組比較，5%、10%和20%含藥血清均顯著促進(jìn)HBMECs增殖，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.71±0.03比0.65±0.03、0.84±0.05比0.75±0.03、0.71±0.05比0.67± 0.05，孕＜0.05）；與10%含藥血清組比較，5%含藥血清組和20%含藥血清組細(xì)胞增殖顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.71±0.03、0.71±0.05比0.84±0.05，孕＜0.05）。與空白組比較，各含藥血清組細(xì)胞遷移的相對(duì)距離均顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.58±0.03比0.50±0.01、0.63±0.03比0.45±0.05、0.53± 0.05比0.45±0.04，孕＜0.05）；與10%含藥血清組比較，5%含藥血清組和20%含藥血清組細(xì)胞遷移的相對(duì)距離顯著減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.58±0.03、0.53±0.05比0.63±0.03，孕＜0.05）。結(jié)論補(bǔ)陽還五湯含藥血清可促進(jìn)HBMECs增殖和遷移，10%含藥血清作用最佳。

人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞；血清；補(bǔ)陽還五湯；增殖；遷移

補(bǔ)陽還五湯具有益氣、活血、通絡(luò)的功效，是中醫(yī)治療腦缺血及其后遺癥的代表方劑。我們實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽還五湯促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)功能恢復(fù)，機(jī)制與其誘導(dǎo)血管生成、神經(jīng)發(fā)生和增加突觸可塑性等有關(guān)[1-2]。本研究進(jìn)一步在體外采用中藥含藥血清方法[3-4]，觀察補(bǔ)陽還五湯含藥血清對(duì)HBMECs增殖和遷移的影響，并確定補(bǔ)陽還五湯含藥血清孵育最佳濃度，為后續(xù)進(jìn)一步明確補(bǔ)陽還五湯促血管生成機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD雄性大鼠，3～4月齡，體質(zhì)量180～200g，上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK（滬）2013-0016。飼養(yǎng)在浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK（浙）2013-0184，室溫（22±1）℃，相對(duì)濕度40%～60%，12h明暗循環(huán)，自由飲食進(jìn)水。

1.2 主要試劑及儀器 人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HBMECs）（美國ATCC公司）；RPMI-1640培養(yǎng)基（杭州吉諾生物技術(shù)有限公司）；優(yōu)級(jí)胎牛血清（美國Gibco公司）；含0.02%EDTA的0.05%胰酶（杭州吉諾生物技術(shù)有限公司）；二甲基亞砜（DMSO）、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（美國Sigma公司）。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（日本三洋公司）；倒置相差顯微鏡（寧波永新光學(xué)技術(shù)有限公司）；低速離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek公司）。

1.3 藥 物 補(bǔ)陽還五湯出自《醫(yī)林改錯(cuò)》，組成:黃芪120g，當(dāng)歸6g，川芎、赤芍各4.5g，地龍、紅花、桃仁各3g。藥材購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)門診并經(jīng)鑒定，以上各組藥物加水浸泡2h，水煎2次，每次40min/次，合并后濃縮為含生藥2g/mL藥液。

2 方法

2.1 含藥血清制備 將10只雄性SD大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組和補(bǔ)陽還五湯組，每組5只。補(bǔ)陽還五湯組灌胃13.3mL/（kg·d）的補(bǔ)陽還五湯液，空白對(duì)照組灌胃等量生理鹽水，連續(xù)3天，每天2次，末次給藥1h后腹主動(dòng)脈取血，靜置30min，4000rpm/min離心15min，分離血清，56℃滅活30min，0.22μm濾膜除菌,無菌分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)HBMECs，待細(xì)胞生長至80%左右融合時(shí)，傳代用于實(shí)驗(yàn)。HBMECs分為空白血清組（5%、10%、20%）、補(bǔ)陽還五湯含藥血清組（5%、10%、20%），共6組，各組均采用RPMI-1640培養(yǎng)基。

2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 消化后收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度1×104個(gè)/mL，空白血清對(duì)照組（5%、10%、20%）、補(bǔ)陽還五湯含藥血清組（5%、10%、20%），每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔。每孔100μL細(xì)胞懸液接種至96孔板，培養(yǎng)24h后，棄上清，每孔加入MTT溶液100μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄培養(yǎng)上清液，每孔加入DMSO 150μL，室溫置搖床震蕩10min，于酶標(biāo)儀上490nm檢測(cè)吸光度測(cè)樣品OD值。

2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 消化后細(xì)胞，按1×105個(gè)/孔接種至6孔板，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，棄培養(yǎng)基，用20μL槍頭在每個(gè)孔內(nèi)垂直劃3條直線，用PBS沖洗3次，加入補(bǔ)陽還五湯含藥血清（5%、10%、20%）、空白血清對(duì)照（5%、10%、20%）培養(yǎng)基1mL培養(yǎng)24h后，倒置相差顯微鏡下觀察拍攝。每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。用Image pro plus 6測(cè)量劃痕的寬度。計(jì)算公式:細(xì)胞侵襲的相對(duì)距離=（劃痕初始寬度-劃痕后24h寬度）/劃痕初始寬度。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)以（±s ）表示。采用單因素方差分析（ANOVA）并SNK進(jìn)行組間比較，孕＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 HBMECs形態(tài)特征 HBMECs為貼壁細(xì)胞，小三角形，呈鋪石路樣,細(xì)胞生長較快，數(shù)量較多，見圖1（封三）。

3.2 補(bǔ)陽還五湯含藥血清對(duì)HBMECs增殖的影響

作用24h，與相同濃度空白組比較，5%、10%和20%含藥血清均顯著促進(jìn)HBMECs增殖（孕＜0.05）；與10%含藥血清組比較，5%含藥血清組和20%含藥血清組細(xì)胞增殖顯著減少（孕＜0.05），見表1。

表1 不同濃度補(bǔ)陽還五湯含藥血清對(duì)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響（OD值，±s）

表1 不同濃度補(bǔ)陽還五湯含藥血清對(duì)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響（OD值，±s）

注:與相同濃度空白組比較，*孕＜0.05；與10%BYHWD含藥血清組比較，△孕＜0.05；BYHWD:補(bǔ)陽還五湯

組別5%空白組5%BYHWD組10%空白組10%BYHWD組20%空白組20%BYHWD組孔數(shù)6 6 6 6 6 6 24h 0.65±0.03 0.71±0.03*△0.75±0.03 0.84±0.05* 0.67±0.05 0.71±0.05*△

3.3 不同濃度補(bǔ)陽還五湯含藥血清對(duì)HBMECs遷移的影響 作用24h，與相同濃度空白組比較，5%、10%和20%含藥血清組細(xì)胞遷移的相對(duì)距離均顯著增加（孕＜0.05）；與10%含藥血清組比較，5%含藥血清組和20%含藥血清組細(xì)胞遷移的相對(duì)距離顯著減?。ㄔ校?.05），見表2、見圖2（封三）。

表2 不同濃度補(bǔ)陽還五湯含藥血清對(duì)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響（±s）

表2 不同濃度補(bǔ)陽還五湯含藥血清對(duì)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響（±s）

注:與相同濃度空白組比較，*孕＜0.05；與10%BYHWD含藥血清組比較，△孕＜0.05；BYHWD:補(bǔ)陽還五湯

組別5%空白組5%BYHWD組10%空白組10 BYHWD組20%空白組20%BYHWD組孔數(shù)4 4 4 4 4 4細(xì)胞遷移相對(duì)距離0.50±0.01 0.58±0.03*△0.45±0.05 0.63±0.03* 0.45±0.04 0.53±0.05*△

4 討 論

缺血性腦卒中具有發(fā)病率、致死率、致殘率高的特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅人類生命健康。目前除了超早期溶栓治療以外，尚缺乏其他有效的治療方法。腦缺血后血管新生已成為臨床腦卒中治療的一種策略。

血管內(nèi)皮細(xì)胞是單層單核細(xì)胞層，具有屏蔽功能、信息傳遞、參與血管形成及血管活動(dòng)等[5-6]，能夠分泌一些血管活性物質(zhì)，調(diào)節(jié)血管張力防止血栓形成，抑制平滑肌細(xì)胞增殖等作用[7]，當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞受損后會(huì)分泌多種活性物質(zhì)，與其他相關(guān)物質(zhì)平衡被打破從而導(dǎo)致心腦血管系統(tǒng)功能障礙，如致死率極高的冠心病和腦卒中的發(fā)生[8]。已有研究[9-10]報(bào)道，在缺氧條件下，血管內(nèi)皮生長因子大量表達(dá)，促進(jìn)血管生成，增加缺氧組織的供血。因此，血管內(nèi)皮細(xì)胞在促血管新生中起著重要的作用。

補(bǔ)陽還五湯是中藥復(fù)方，是中醫(yī)治療腦缺血及其后遺癥的代表方劑[11]。本研究前期發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽還五湯促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)功能恢復(fù)，機(jī)制與其誘導(dǎo)血管生成有關(guān)[12]。本研究結(jié)果顯示，10%補(bǔ)陽還五湯含藥血清對(duì)HBMECs作用最佳，能顯著促進(jìn)HBMECs增殖和遷移，提示補(bǔ)陽還五湯含藥血清可能是通過直接促進(jìn)HBMECs增殖，促進(jìn)HBMECs遷移，從而促進(jìn)血管新生，這可能是補(bǔ)陽還五湯含藥血清治療腦卒中的一個(gè)重要途徑，為更進(jìn)一步探討補(bǔ)陽還五湯含藥血清的作用機(jī)制提供依據(jù)。

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（收稿:2016-05-02 修回:2016-06-10）

Effect of Buyang Huanwu Decoction on Proliferation and Migration of Human Brain Microvascular En-dothelial Cells

YE Shujing1,Sun Siqi2,LI Lin3,FANG Yan3,YANG Yan3,CHU Lisheng3. 1 TCM 孕harmacy,Hangzhou First Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310006),China;2 College of 孕harmaceutical Science,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053),China;3 College of Basic Medical Science,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053),China

ObjectiveTo investigate the effect of Buyang huanwu decoction（BYHWD）with different concentrations on the proliferation and migration of human brain microvascular endothelial cells（HBMECs）.MethodsThe abdominal aortic blood from SD rats treated with BYHWD was drawn to prepare drug-containing sera.HBMECs were cultured in vitro and randomly divided into blank groups（normal rat serum at 5%,10%and 20%concentrations,respectively）and BYHWD drug-containing serum groups（at 5%,10%and 20%concentrations,respectively）.The proliferation of HBMECs was determined by MTT,and the influence of migration was detected by cell scratch method.ResultsCompared with blank groups,drug-containing serum at 5%,10%and 20%concentrations significantly promoted cell proliferation（0.71 0.03 vs 0.65 0.03,0.84 0.05 vs 0.75 0.03,0.71 0.05 vs 0.67 0.05,all孕＜0.05）;compared with drug-containing group at 10%concentration,the proliferation of HBMECs was reduced with a significant difference in drug-containing group at 5%and 20%concentrations（0.71 0.03,0.71 0.05 vs 0.84 0.05,孕＜0.05）.The relative distance of HBMEC migration was longer in BYHWD groups than those in blank groups（5%：0.58 0.03 vs 0.50 0.01, 10%：0.63 0.03 vs 0.45 0.05,20%：0.53 0.05 vs 0.45 0.04;all孕＜0.05）.A significant reduction in relative distance of HBMEC migration was found in drug-containing groups at 5%and 20%concentrations compared to at 10%concentration（0.58 0.03,0.53 0.05 vs 0.63 0.03,孕＜0.05）.ConclusionBYHWD can promote the proliferation and migration of HBMECs and the effect is maximal when the concentration of the drug-containing sera is 10%.

human brain microvascular endothelial cells;sera;buyanghuanwu decoction;proliferation;migration

浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.Y207771）；浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助項(xiàng)目（No.YCIT2016-2）

1浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬杭州第一醫(yī)院中藥房（杭州 310006）；2浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院（杭州 310053）；3浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（杭州 310053）

儲(chǔ)利勝，Tel:（0571）86633149；E-mail:chulisheng@21cn.com