向 芬，李 維，劉紅艷，周凌云，丁 玎，曾 振

（湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125）

茶樹(shù)葉綠素測(cè)定方法的比較研究

向 芬，李 維，劉紅艷，周凌云，丁 玎，曾 振

（湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125）

為了探討適合茶樹(shù)大量樣本葉綠素含量測(cè)定的方法，本試驗(yàn)綜合植物葉綠素的測(cè)定方法，以丙酮研磨法為對(duì)照，使用浸提法設(shè)置6種提取液（95%乙醇、80%丙酮、丙酮∶乙醇=2∶1、丙酮∶乙醇=1∶2、丙酮∶乙醇=1∶1、丙酮∶乙醇∶水=4.5∶4.5∶1）進(jìn)行浸提效果試驗(yàn)，并對(duì)提取液進(jìn)行光穩(wěn)定試驗(yàn)。結(jié)果表明：以丙酮∶乙醇=1∶2的提取效果好，光穩(wěn)定性也較好；丙酮∶乙醇=2∶1、丙酮∶乙醇=1∶1的次之；單一溶劑以95%乙醇浸提效果較好。表明測(cè)定茶樹(shù)大量樣本的葉綠素宜選用丙酮∶乙醇為1∶2的混合液法，該方法操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性好；考慮環(huán)保因素，則以95%乙醇溶劑浸提法較好。

茶樹(shù)；葉綠素；提?。粶y(cè)定方法

葉綠素是綠色植物進(jìn)行光合作用的基礎(chǔ)物質(zhì)，是植物葉片的主要光合色素，其含量的多少與光合能效的高低有著重要關(guān)系，是研究茶樹(shù)氮素營(yíng)養(yǎng)等生理變化的重要指標(biāo)[1,2]。目前，測(cè)定葉綠素含量主要有分光光度計(jì)法和SPAD葉綠素測(cè)定儀法。由于SPAD葉綠素儀測(cè)定的是相對(duì)含量，在日常試驗(yàn)中以分光光度計(jì)法測(cè)定葉綠素的絕對(duì)含量應(yīng)用最廣泛。

植物葉綠素的測(cè)定因所用的溶劑不同又有多種測(cè)定方法，國(guó)際上廣泛采用Arnon法[3]。但該方法由于要先加入石英砂研磨，研磨后又需過(guò)濾、除渣，工作量大，步驟多，不適宜田間大量樣品的提取和測(cè)定[4]。張憲政提出了丙酮乙醇混合液法浸提葉綠素，驗(yàn)證了利用混合液進(jìn)行葉綠素浸提的可行性[5]。何麗斯等[6]研究發(fā)現(xiàn)以丙酮∶無(wú)水乙醇∶蒸餾水=4.5∶4.5∶1的混合液浸提杜鵑葉綠素效果較好。徐芬芬[7]等研究認(rèn)為，丙酮與乙醇體積比1∶1的混合液浸提小白菜葉綠素效果最好 ；而麻明友[8]、任紅等[9]研究結(jié)果顯示，丙酮與乙醇體積比2∶1的混合液分別浸提獼猴桃、菜心葉綠素效果較好。

前人對(duì)植物葉綠素的測(cè)定方法因植物種類(lèi)不同結(jié)果各異。而茶樹(shù)葉綠素含量的測(cè)定，徐華等[10]通過(guò)研究證明丙酮∶無(wú)水乙醇∶蒸餾水=4.5∶4.5∶1混合液法提取葉綠素效果又快又好；隨后肖潤(rùn)林等[11]、唐茜等[12]引用徐華等的方法測(cè)定茶樹(shù)葉綠素含量，唐曉波等[13]采用丙酮分光光度法測(cè)定不同季節(jié)茶葉中葉綠素含量，趙先明等對(duì)幾種混合液的浸提方法進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)丙酮∶乙醇∶水= 3∶6∶1的效果較好，較丙酮研磨法及其它幾種丙酮、乙醇混合液的提取方法有極顯著的差異。本試驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上，以丙酮研磨法作為對(duì)照，綜合植物上常使用的葉綠素測(cè)定方法，對(duì)研磨法和浸提法進(jìn)行了比較，為田間大批量樣本葉綠素含量的測(cè)定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試茶樹(shù)為湖南本地品種碧香早，丙酮、95%乙醇等試劑均為分析純，試驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采取直接浸提法，設(shè)6種處理，以丙酮研磨法為對(duì)照（表1）。

表1 不同測(cè)定方法設(shè)置Table 1 Different determination methods

1.2 測(cè)定方法

1.2.1 浸提效果試驗(yàn)

所選葉片為茶樹(shù)倒三葉，低溫保存。準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5 g試材于試管中，剪取葉片成2 mm×1 cm碎條，在室溫下立即用丙酮研磨法和直接浸提法提取葉綠素，每個(gè)處理3次重復(fù)。浸提在黑暗中進(jìn)行，每管加入浸提液10 mL，并定時(shí)搖動(dòng)，待葉片變白，約14 h后定容至25 mL，測(cè)定吸光度。研磨法參照任紅等的方法[9]。室溫下以相應(yīng)試劑為參比，分別在645 nm和663 nm處測(cè)定吸光度，由Arnon公式計(jì)算葉綠素a與葉綠素b的含量。

1.2.2 光穩(wěn)定性試驗(yàn)

樣品測(cè)定后室溫曝光放置5 h，測(cè)定提取液中葉綠素的含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

式中：A663nm、A645nm分別為663 nm、645 nm波長(zhǎng)下的吸光度，V為提取液的體積，W為葉片的鮮重。

利用Excel 2003軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，利用DPS14.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同浸提液對(duì)茶樹(shù)葉綠素提取效果的影響

由表2可見(jiàn)，不同浸提液的提取效果存在差異，與對(duì)照比，處理C、D、E提取方法的效果較好，其中處理D較對(duì)照好，但效果與對(duì)照差異不顯著；其次為A提取方法，B、F提取效果較對(duì)照差，差異極顯著。

2.2 不同浸提液對(duì)茶葉葉綠素光穩(wěn)定性的影響

由表3可知，采用不同提取溶劑提取的茶葉葉綠素，在室溫下放置5 h后，葉綠素含量以D提取方法的效果較對(duì)照好，C、E提取方法次之，B、F提取效果較對(duì)照差；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，各種提取方法均以葉綠素a降解較葉綠素b快，C、D、E提取方法的葉綠素a降解較對(duì)照慢。

表2 不同浸提液方法葉綠素含量比較Table 2 Comparison of chlorophyll content with different extraction methods

表3 不同浸提液提取葉綠素含量變化Table 3 Changes of chlorophyll content with different extracts after exposure to 5h

3 討論

選擇穩(wěn)定、高效的葉綠素提取方法有利于得到準(zhǔn)確、可靠的數(shù)據(jù)。通常進(jìn)行葉綠素測(cè)定需要進(jìn)行不同處理以及實(shí)驗(yàn)重復(fù)的取樣，樣本量大，采用研磨法較費(fèi)時(shí)間，且茶葉中的多酚物質(zhì)在細(xì)胞破碎、葉綠體破壞后形成許多的降解產(chǎn)物，易造成提取液不穩(wěn)定，長(zhǎng)時(shí)間放置影響更大，因此大量樣本的葉綠素測(cè)定采用浸提法較方便，有研究者還發(fā)現(xiàn)影響葉綠素提取效率的關(guān)鍵是葉綠素a 的穩(wěn)定性[4]。前人對(duì)植物葉綠素測(cè)定因植物種類(lèi)不同結(jié)果各異，但均發(fā)現(xiàn)丙酮、乙醇混合溶劑浸提效果較好。本試驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)丙酮、乙醇混合溶劑提取茶葉葉綠素效果以及光穩(wěn)定性均較好，其中以丙酮 ∶ 乙醇為1∶2的效果較研磨法好，丙酮 ∶ 乙醇為2∶1、丙酮∶乙醇為1∶1的次之，三者與研磨法差異不顯著，這可能是由于丙酮 ∶ 乙醇為1∶2混合液中的葉綠素a含量降解較對(duì)照慢，光穩(wěn)定好，且由于不需要進(jìn)行研磨，只需把葉片剪成小條，對(duì)細(xì)胞破壞少，形成的降解產(chǎn)物較研磨法少，因此其提取效果及穩(wěn)定性都較研磨法好。茶葉茶多酚氧化形成的產(chǎn)物可溶于丙酮和水，干擾比色測(cè)定，丙酮 ∶ 乙醇為1∶2的混合浸提液由于不加水，且丙酮比例低，干擾較小，所以其提取效果較其它幾種丙酮、乙醇及丙酮、乙醇、水的混合液好。單一溶劑以95%乙醇浸提效果較好。

綜上所述，茶樹(shù)大量樣本的葉綠素含量檢測(cè)宜選用丙酮 ∶ 乙醇為1∶2的混合液進(jìn)行提取。由于丙酮為有毒有機(jī)溶劑，考慮環(huán)保的因素則以95%的乙醇單一溶劑的浸提效果較好。此外，光是影響茶樹(shù)葉綠素穩(wěn)定性的重要因素，所以在茶樹(shù)葉綠素浸提、測(cè)定及保存時(shí)，要盡量選擇避光處理。

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Comparisonon Methods of Chlorophyll Extraction in Camellia sinensis

XIANG Fen，LI Wei，LIU Hong-yan，ZHOU Ling-yun，DING Ding，ZENG Zhen
（Tea Research Institure of Hunan Academy of Academy of Agricultural Sciences, Changsha 410125, China）

In order to find the method for determination of chlorophyll in the leaves of Camellia sinensis, we synthesized the method of chlorophyll determination in others crop, using acetone grinding method as the control, the leaching method was set up 6 treatments as 95% ethanol, 80% acetone，acetone: ethanol=2:1, acetone: ethanol=1:2, acetone: ethanol=1:1, acetone: ethanol: water=4.5:4.5:1, and we tested extraction effect and light stability in the leaves of Camellia sinensis. The results showed that the leaching method including the mixture liquid of the acetone and ethanol with the volume rate of 1:2 could get the best extraction effect and light stability on the chlorophyll in Camellia sinensis, then was acetone: ethanol=2:1 and acetone: ethanol=1:1, the single 95% ethanol also got a good extraction effect. In summary, the method of acetone:ethanol =1:2 is suitable for a large number of samples of the chlorophyll content determination in tea plant, the method is easy to operate and high stability, considering environmental factors, 95% ethanol extraction method is better.

Camellia sinensis, Chlorophyll, Extraction, Determination method

S571.1

A

1009-525X（2016）04-37-40

2016-11-28

2016-12-21

湖南省自然科學(xué)基金（2016JJ4052）

向芬（1983-），女，湖南邵陽(yáng)人，助理研究員，主要從事茶樹(shù)栽培學(xué)與生理生化方面的研究。