劉素娜，姚 武，暴 磊，李 娟，張紅義，侯建勇，王 迪，陳慧婷，郝長(zhǎng)付

（鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，河南 鄭州 450001）

采用ChIP-chip技術(shù)分析大鼠肺成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化前后全基因組蛋白H3K4三甲基化水平的改變

劉素娜，姚 武，暴 磊，李 娟，張紅義，侯建勇，王 迪，陳慧婷，郝長(zhǎng)付

（鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，河南 鄭州 450001）

目的研究經(jīng)二氧化硅（SiO2）染毒的肺成纖維細(xì)胞（LF）轉(zhuǎn)分化前后全基因組蛋白H3賴(lài)氨酸4（H3K4）三甲基化（met3）水平的改變。方法原代培養(yǎng)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞（AM）和LF，采用transwell共培養(yǎng)，建立共培養(yǎng)模型，用100 mg·L-1游離SiO2粉塵染毒AM 24 h，收集LF細(xì)胞，免疫組織化學(xué)法對(duì)轉(zhuǎn)分化后的LF進(jìn)行表型鑒定。采用染色質(zhì)免疫共沉淀聯(lián)合芯片技術(shù)（ChIP-chip）對(duì)LF全基因組蛋白H3K4met3進(jìn)行高通量篩選，采用染色質(zhì)免疫共沉淀-實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)技術(shù)（ChIP-qPCR）驗(yàn)證芯片結(jié)果，采用定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶聯(lián)反應(yīng)技術(shù)（qRT-PCR）檢測(cè)H3K4出現(xiàn)顯著差異的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果通過(guò)對(duì)經(jīng)SiO2染毒前后LF全基因組蛋白H3K4met3水平的對(duì)比，共篩選出1815個(gè)基因存在H3K4顯著性差異（Cy3/ Cy5比值>2.0或<0.5，NimbleScan V2.5軟件），其中518個(gè)基因出現(xiàn)H3K4met3程度增高，1297個(gè)基因H3K4met3程度降低。隨機(jī)挑選2個(gè)差異表達(dá)基因nfib和kpna3，以ChIP-qPCR和qRT-PCR方法驗(yàn)證，取得與CpG島芯片一致的結(jié)果。結(jié)論經(jīng)SiO2染毒的LF轉(zhuǎn)分化前后全基因組蛋白H3K4met3水平存在顯著改變。ChIP-chip技術(shù)有利于進(jìn)一步揭示矽肺纖維化發(fā)生的分子機(jī)制，有助于發(fā)現(xiàn)新的蛋白標(biāo)志物和基因干預(yù)靶點(diǎn)。

成纖維細(xì)胞；二氧化硅；肺泡巨噬細(xì)胞；染色質(zhì)免疫共沉淀；組蛋白H3賴(lài)氨酸4；甲基化

目前，塵肺病仍是中國(guó)最嚴(yán)重的職業(yè)病，而矽肺是塵肺病中危害最嚴(yán)重的一種。長(zhǎng)期吸入游離二氧化硅（SiO2）粉塵，導(dǎo)致肺成纖維細(xì)胞（lung fi?broblast，LF）轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞（myofibro?blast，MF）是矽肺發(fā)病重要的細(xì)胞基礎(chǔ)［1］。細(xì)胞轉(zhuǎn)分化是指分化完全的細(xì)胞在某些因素的刺激下，丟失其原有的表型特點(diǎn)而轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌?lèi)型細(xì)胞，是一種特定的生理或病理過(guò)程［2］。

LF在正常靜息狀態(tài)下不具有過(guò)度增殖和分泌能力，發(fā)生活化、功能改變是細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的結(jié)果［3］。MF的一個(gè)關(guān)鍵的生物學(xué)標(biāo)志是α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）的表達(dá)［4］。在肺纖維化發(fā)生時(shí)，Ⅰ型膠原（collagenⅠ，ColⅠ）和ColⅢ蛋白的含量增加，成為反映細(xì)胞外基質(zhì)蛋白成分變化的主要指標(biāo)［5］。因此，α-SMA，ColⅠ和ColⅢ的表達(dá)增多是LF轉(zhuǎn)化為MF，發(fā)生纖維化的標(biāo)志。LF在肺泡巨噬細(xì)胞（alveolar macrophage，AM）分泌的多種細(xì)胞因子，尤其是成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化因子β1的誘導(dǎo)下轉(zhuǎn)分化為MF，其α-SMA及膠原蛋白的表達(dá)上調(diào)，且凋亡受到抑制，這一過(guò)程已得到研究者的共識(shí)［6-7］。以往對(duì)這一過(guò)程的研究，主要從遺傳學(xué)角度進(jìn)行，如張海英等［3］從遺傳學(xué)角度探討了LF轉(zhuǎn)分化的基因表達(dá)變化，證實(shí)了游離SiO2刺激LF過(guò)程中，大量基因和蛋白改變，但以往傳統(tǒng)遺傳學(xué)研究尚不能解釋其確切機(jī)制。隨著表觀遺傳學(xué)研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)表觀遺傳學(xué)改變可能早于傳統(tǒng)遺傳學(xué)，且由于其改變的可逆性越來(lái)越受到關(guān)注。Sanders等［8］應(yīng)用組蛋白修飾抑制劑，考察了大鼠LF的組蛋白修飾機(jī)制，并考察了Thy-1細(xì)胞表面抗原啟動(dòng)子區(qū)高甲基化在肺纖維化中的調(diào)控機(jī)制［9］，發(fā)現(xiàn)表觀遺傳學(xué)機(jī)制在其中起到關(guān)鍵的調(diào)控作用，應(yīng)用抑制劑干預(yù)可改變表觀遺傳學(xué)的調(diào)控效果。研究提示，表觀遺傳學(xué)調(diào)控在LF轉(zhuǎn)分化中可能發(fā)揮著重要作用，但相關(guān)報(bào)道仍較缺乏，因此有必要進(jìn)一步研究LF轉(zhuǎn)分化過(guò)程中的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。

組蛋白的共價(jià)修飾是表觀遺傳機(jī)制的重要內(nèi)容。許多研究提示組蛋白修飾可改變?nèi)旧w結(jié)構(gòu)、調(diào)控組蛋白與DNA及組蛋白與組蛋白間的相互作用，從而調(diào)控基因表達(dá)［10-11］。組蛋白修飾包括乙酰化、甲基化、磷酸化和ADP核糖基化等，這些類(lèi)似于組蛋白的編碼子，調(diào)控染色體的功能［12］。在組蛋白共價(jià)修飾過(guò)程中研究較多的是賴(lài)氨酸甲基化，其修飾的位點(diǎn)有多個(gè)，如組蛋白H3賴(lài)氨酸4（his?tone H3 lysine 4，H3K4）、H3K9、H3K20和H3K27等。本研究采用染色質(zhì)免疫共沉淀-實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)（chromatin co-immunoprecipitation linked to microarrays，ChIP-chip）技術(shù)檢測(cè)了染毒組和正常組的LF全基因組蛋白H3K4三甲基化（trimethylation，met3）水平，通過(guò)比較兩組細(xì)胞內(nèi)相同基因位點(diǎn)組蛋白H3K4met3水平的差異，進(jìn)行基因篩選，采用ChIP-chip和定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶聯(lián)反應(yīng)技術(shù)（quantitational real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）驗(yàn)證芯片結(jié)果，為進(jìn)一步揭示矽肺纖維化發(fā)生的分子機(jī)制，以及發(fā)現(xiàn)新的蛋白標(biāo)志物和基因干預(yù)靶點(diǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)成年雄性Spraque-Dawley（SD）大鼠10只，體質(zhì)量160 ～200g，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)為SCXK（豫）2010-0002。大鼠在溫度21 ～25°C、濕度50% ～70%的屏障系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)，所飼養(yǎng)飲用水、飼料及墊料均經(jīng)消毒滅菌處理。

1.2試劑和主要儀器

游離SiO2粉塵標(biāo)準(zhǔn)品（粒徑為1 ～5 μm）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；胎牛血清，購(gòu)自杭州四季青公司；DMEM培養(yǎng)液購(gòu)自中國(guó)Solarbio公司；Trizol試劑購(gòu)于上海英俊生物技術(shù)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和RT-PCR試劑盒均購(gòu)于大連寶生物生物技術(shù)有限公司；PCR引物由上海生工公司合成；抗α-SMA，ColⅠ和ColⅢ抗體均購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司；兔抗小鼠辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；抗α-SMA，ColⅠ和ColⅢ抗體ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司；抗組蛋白H3K4met3抗體標(biāo)記磁珠購(gòu)于美國(guó)Santa公司；DNA純化試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；NimbleGen啟動(dòng)子芯片和Cy3/Cy5 DNA雙標(biāo)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Roche公司。GenePix 4000B芯片掃描儀（美國(guó)Axon公司）；ABI 7100 Real time PCR儀（美國(guó)ABI應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek儀器有限公司）。

1.3LF的分離和純化

選用成熟SPF級(jí)雄性SD大鼠，脫頸椎活殺后在75%乙醇中浸泡5 min，無(wú)菌環(huán)境下解剖取出大鼠肺臟，用胰蛋白酶消化法消化適量肺組織，分離LF細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，用0.4%錐蟲(chóng)藍(lán)（臺(tái)盼藍(lán)）染色并計(jì)數(shù)活細(xì)胞含量。補(bǔ)加新鮮的含10%血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將傳至4 ～8代的LF細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4大鼠AM的提取和純化

肺泡灌洗法提取大鼠AM。進(jìn)行氣管插管術(shù)后，用注射器向插管內(nèi)注入PBS溶液5 mL，輕輕按摩胸腔，使細(xì)胞充分混入。反復(fù)抽推注射器5次，5 min后抽出肺內(nèi)液體，將其離心（250×g，4℃）10 min，收集下層細(xì)胞，用PBS溶液洗1次，用DMEM培養(yǎng)基懸起細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度約5×108L-1。將細(xì)胞懸液置入培養(yǎng)瓶，37℃培養(yǎng)2 h后，吸棄上清，再加入新鮮的DMEM培養(yǎng)基，即得純化的AM，調(diào)整細(xì)胞濃度將其立即轉(zhuǎn)入上室transwell中（下室LF已生長(zhǎng)至80% ～90%），培養(yǎng)24 h后進(jìn)行SiO2剌激處理。

1.5CCK8法檢測(cè)AM存活

調(diào)整AM細(xì)胞濃度至1×109L-1，接種到96孔板中，每孔100 μL。培養(yǎng)2 h后吸棄培養(yǎng)液，更換新鮮的含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h后，實(shí)驗(yàn)組分別加SiO220，40，60，80，100，120和140 mg·L-1，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照孔，每個(gè)濃度均設(shè)6個(gè)復(fù)孔，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入CCK8溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。振蕩混勻后，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在492 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔的吸光度（absorbance，A）值，按以下公式計(jì)算細(xì)胞的存活率。細(xì)胞存活率（%）=實(shí)驗(yàn)組平均A值/正常對(duì)照組平均A值×100%。

1.6矽肺纖維化體外細(xì)胞模型的建立

transwell（孔徑0.4 μm）只允許細(xì)胞因子通過(guò)，細(xì)胞和SiO2均不能通過(guò)，利用transwell建立大鼠LF和AM體外共培養(yǎng)模型來(lái)模擬體內(nèi)矽肺環(huán)境，研究SiO2作用下AM對(duì)LF轉(zhuǎn)分化的影響。取4 ～8代的LF，調(diào)整細(xì)胞濃度至約2×108L-1，接種于6孔板內(nèi)。細(xì)胞生長(zhǎng)至80% ～90%融合狀態(tài)時(shí)，在transwell內(nèi)接種約3×105個(gè)AM，懸掛于6孔板的孔內(nèi)。分2組：空白組，在transwell內(nèi)加入無(wú)游離SiO2的培養(yǎng)基每孔2 mL；處理組在transwell內(nèi)加入100 mg·L-1游離SiO2粉塵懸液每孔2 mL，將此兩組細(xì)胞置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.7免疫組織化學(xué)法鑒定LF的轉(zhuǎn)分化

免疫組學(xué)法檢測(cè)共培養(yǎng)模型中的LF內(nèi)LF轉(zhuǎn)分化標(biāo)志物：α-SMA，ColⅠ和ColⅢ蛋白的表達(dá)。細(xì)胞棕染為檢測(cè)蛋白陽(yáng)性表達(dá)。利用Nikon NISElements AR4.0軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行光密度分析。實(shí)驗(yàn)步驟按免疫組化檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.8ELISA法檢測(cè)細(xì)胞共培養(yǎng)上清液中 α-SMA，ColⅠ和ColⅢ蛋白的表達(dá)

LF向MF轉(zhuǎn)分化的過(guò)程中，細(xì)胞中α-SMA，ColⅠ和ColⅢ蛋白表達(dá)增高，同時(shí)一部分α-SMA，ColⅠ和ColⅢ蛋白分泌到培養(yǎng)上清中。收集transwell所建立的大鼠LF和AM共培養(yǎng)模型的上清液，采用雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測(cè)上清液中α-SMA，ColⅠ和ColⅢ蛋白對(duì)LF轉(zhuǎn)分化進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。ELISA試劑盒室溫放置平衡20 min待用，96孔反應(yīng)板中每孔分別加入100 μL標(biāo)本（樣品或標(biāo)準(zhǔn)品），37℃孵育90 min，吸出液體，洗板3次；加50 μL的HRP標(biāo)記二抗，37℃孵育60 min，吸出液體，洗板3次；加入50 μL的顯色液，37℃孵育15 min，每孔加入50 μL的終止液。全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)下的A值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各樣品目的蛋白的濃度。每個(gè)樣品平行測(cè)定6次。

1.9ChIP-chip法測(cè)定 LF全基因組蛋白H3K4met3水平

ChIP-chip步驟基本參照以前文獻(xiàn)中的描述進(jìn)行［13］，并作了一些修改，即在37℃，1%甲醛處理LF 10 min，使組蛋白和DNA發(fā)生交聯(lián)，隨后甘氨酸0.125 mol·L-1在37℃下處理5 min終止交聯(lián)反應(yīng)。PBS溶液清洗細(xì)胞后，用300 μL溶解緩沖液（0.1%SDS，0.5%TritonX-100，Tris-HCl 20 mmol·L-1pH 8.1，NaCl 150 mmol·L-1，蛋白酶抑制劑）重懸細(xì)胞，并在冰上孵育30 min，超聲處理細(xì)胞懸液，用稀釋緩沖液（1%SDS，NaHCO30.1 mol·L-1）進(jìn)行溶解，同時(shí)設(shè)置內(nèi)參組（不經(jīng)免疫共沉淀的DNA片段）和陰性對(duì)照組（不經(jīng)Cy3和Cy5熒光基團(tuán)標(biāo)記的DNA片段），各組溶解液分別加入抗組蛋白H3K4met3抗體，置于4℃孵育過(guò)夜，加入50 μL磁珠（蛋白質(zhì)A/G）于4°C過(guò)夜，磁珠經(jīng)洗滌后加熱65℃過(guò)夜解交聯(lián)。用酚氯仿抽提DNA，進(jìn)行DNA擴(kuò)增，用DNA純化試劑盒對(duì)擴(kuò)增的DNA進(jìn)行純化。分別用Cy3和Cy5熒光基團(tuán)標(biāo)記ChIP DNA（經(jīng)免疫共沉淀的DNA片段）和input DNA，得到用于芯片雜交的熒光探針；將其與含有大鼠15 398個(gè)探針的CpG島芯片進(jìn)行雜交，使用GenePix 4000B芯片掃描儀（Axon Instruments，F(xiàn)oster City，CA）進(jìn)行掃描。用NimbleScan v2.5軟件讀取芯片原始信號(hào)值，過(guò)濾背景噪聲，提取基因表達(dá)的熒光信號(hào)強(qiáng)度值，并計(jì)算所有基因的Cy3/ Cy5比值，用Log2比值（log2 Cy5/Cy3）將芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理，剔除兩組差異中的假陽(yáng)性基因，最后兩組細(xì)胞之間Cy3/Cy5的差異：①Cy3/Cy5值>2.0或<0.5的顯著差異基因確定為H3K4met3差異候選基因，Cy3/Cy5>2的基因表達(dá)水平升高，Cy3/Cy5<0.5的基因表達(dá)水平降低；②t檢驗(yàn)法分析兩組結(jié)果，篩選出的H3K4met3差異候選基因，利用Signalmap軟件將在對(duì)應(yīng)的H3K4met3靶點(diǎn)圖譜中不存在的基因舍棄。

1.10ChIP-qPCR法和qRT-PCR法對(duì)CpG島芯片所測(cè)定為H3K4met3基因的驗(yàn)證

ChIP操作步驟與1.9項(xiàng)下ChIP-chip免疫共沉淀DNA操作相同。用Trizol試劑分別提取兩組細(xì)胞總RNA，將提取的總RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明將細(xì)胞總mRNA逆轉(zhuǎn)成cDNA。采用PCR儀對(duì)ChIP DNA、內(nèi)參組、陰性對(duì)照組和逆轉(zhuǎn)錄細(xì)胞cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。任意挑選兩個(gè)經(jīng)CpG島芯片測(cè)定為H3K4met3的基因，擴(kuò)增引物序列用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)，引物序列見(jiàn)表1。測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線，確保擴(kuò)增的準(zhǔn)確性和專(zhuān)一性，用Ct值表示樣品中模板的相對(duì)含量，采用2-△△Ct法進(jìn)行分析。實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增條件為：預(yù)變性95℃4 min，變性94℃15 s，退火60℃20 s，延伸72℃20 s，40個(gè)循環(huán)。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)均用x±s表示。應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1SiO2對(duì)大鼠AM存活的影響

SiO2對(duì)大鼠AM的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，且呈濃度依賴(lài)性（r=0.996）（圖1）。SiO220，40和60 mg·L-1染毒AM 24 h，細(xì)胞存活率與正常對(duì)照組（0 mg·L-1）無(wú)明顯差異；80，100，120和140 mg·L-1組細(xì)胞存活率均低于正常對(duì)照組（P<0.05）。SiO2100 mg·L-1引起>30%的AM死亡，此濃度既確保了對(duì)AM的細(xì)胞毒性，又保證了共培養(yǎng)體系中AM的存活率?；谝陨蠈?shí)驗(yàn)結(jié)果，確定SiO2100 mg·L-1為以下實(shí)驗(yàn)染毒濃度。

Tab.1 PCR primers and annealing temperatures used for mRNA analysis ofnfib，kpna3andGAPDH

Fig.1 Effect of free SiO2on viability of alveolar macrophages（AM）.The cell viability was examined by CCK8 assay when the rat AM were incubated with SiO2for 24 h.x±s，n=6.*P<0.05，compared with normal control（SiO20 mg·L-1）group.

2.2SiO2對(duì)LF中 α-SMA，ColⅠ和ColⅢ蛋白的表達(dá)量的影響

免疫組化檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，與正常對(duì)照組細(xì)胞相比，SiO2100 mg·L-1組LF細(xì)胞中α-SMA，ColⅠ和ColⅢ的蛋白水平增高（P<0.05）。

Fig.2 Effect of free SiO2on expression of collagenⅠ（ColⅠ），ColⅢand α-smooth muscle actin（ α-SMA）in lungfibroblasts（LF）by immunohistochemistry（×100）.The staining intensity of ColⅠ，ColⅢ and α-SMA was quantified by densitometric analysis.LF were cocultured with AM treated by SiO2100 mg·L-1for 24 h.x±s，n=6.*P<0.05，compared with normal control（SiO20 mg·L-1）group.

2.3SiO2對(duì)LF和AM細(xì)胞共培養(yǎng)上清中 α-SMA，ColⅠ和ColⅢ蛋白的表達(dá)水平的影響

ELISA檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2，與正常對(duì)照組相比，SiO2100 mg·L-1組細(xì)胞共培養(yǎng)上清中α-SMA，ColⅠ和ColⅢ的蛋白表達(dá)水平升高（P<0.01）。

Tab.2 Effect of free SiO2on protein expression levels of ColⅠ，ColⅢand α-SMA in co-culture supernatant by ELISA

2.4CpG島芯片數(shù)據(jù)分析

超聲波處理細(xì)胞后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳判斷超聲效果，確定基因組DNA片段在200 ～1000 bp范圍內(nèi)。正常對(duì)照組與SiO2100 mg·L-1染毒組之間對(duì)全基因組蛋白H3K4差異進(jìn)行分析，共篩選出1815個(gè)基因存在H3K4顯著性差異（Cy3/Cy5比值>2.0或<0.5，NimbleScan V2.5軟件），其中518個(gè)基因H3K4met3水平增高，1297個(gè)基因H3K4met3水平降低。部分H3K4met3改變基因見(jiàn)表3。

2.5ChIP-qPCR和Q-PCR驗(yàn)證結(jié)果

為證實(shí)CpG島芯片結(jié)果準(zhǔn)確性，隨機(jī)挑選CpG島芯片測(cè)定的H3K4met3陽(yáng)性基因nfib和kpna3，分別運(yùn)用ChIP-qPCR和QRT-PCR對(duì)免疫沉淀的cDNA和細(xì)胞mRNA進(jìn)行基因分析。ChIP-qPCR和QRT-PCR結(jié)果與芯片分析結(jié)果相一致（圖3）。

2.6差異基因分析

運(yùn)用Cytoscape軟件對(duì)差異基因進(jìn)行了聚類(lèi)和相互作用分析，最終確定52個(gè)基因?yàn)橄乱徊街攸c(diǎn)研究對(duì)象，其中H3K4met3上調(diào)基因22個(gè)，H3K4met3下調(diào)基因30個(gè)（圖4）。鑒定出的52個(gè)差異基因涉及細(xì)胞周期調(diào)控基因、離子通道蛋白、核轉(zhuǎn)錄蛋白、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、組蛋白和鋅指蛋白。這些基因可能在LF轉(zhuǎn)分化的過(guò)程中起關(guān)鍵作用。

Tab.3 Enrichment of H3K4 trimethylation（H3K4met3）genes identified in ChIP-chip with LF co-cultured with AM treated by SiO2100 mg·L-1for 24 h

Fig.3 Trimethylation positive genenfibandkpnasdetected by CpG island microarrays were verified via ChIP-qPCR（B）and qRT-PCR（C）.A：H3K4met3 level ofnfibandkpna3in ChIP-chip by Signalmap.B：expressions ofnfibandkpna3cDNA were measured by ChIP-qPCR.C：expressions ofnfibandkpna3mRNA were measured by qRT-PCR.LF were cocul?tured with AM treated by SiO2100 mg·L-1for 24 h.

Fig.4 ChIP-chip analysis of multiple histone marks at promoters of repressed genes.See Fig.3 for cell treatment. A：expression profile of dynamically changed H3K4met3 genes over a period of 24 h after SiO2100 mg·L-1stimulation by using Cyto?scape software.52 genes，the expression of which changed significantly relative to the normal control group，are shown.Red，green and black denote increased，decreased and no change in gene expression.B：part network of interactions of the transcription factor target genes.Molecules are represented as nodes，and the biological relationship between two nodes is represented as a line.Red repre?sents regulatory genes of H3K4met3 genes and yellow represents H3K4met3 genes.

3 討論

本研究結(jié)果顯示，SiO2對(duì)大鼠AM的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用且呈濃度依賴(lài)性。SiO2100 mg·L-1染毒AM 24 h，引起>30%AM死亡，此濃度既確保了對(duì)AM的細(xì)胞毒性，又保證了共培養(yǎng)體系中AM存活率，基于以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定SiO2100 mg·L-1為共培養(yǎng)模型的AM染毒濃度。在本實(shí)驗(yàn)建立的細(xì)胞共培養(yǎng)模型中，SiO2100 mg·L-1處理組LF的α-SMA、ColⅠ和ColⅢ的表達(dá)量明顯高于正常對(duì)照組，且隨游離SiO2濃度增高，LF的α-SMA、ColⅠ和ColⅢ的表達(dá)量也逐漸增多。處理組α-SMA、ColⅠ和ColⅢ的表達(dá)明顯升高，說(shuō)明在SiO2100 mg·L-1作用24 h后LF已轉(zhuǎn)化為MF。

組蛋白共價(jià)修飾調(diào)控染色質(zhì)重塑與轉(zhuǎn)錄的發(fā)生［14］。組蛋白甲基化是表觀遺傳的一種主要修飾形式，組蛋白甲基化修飾具有類(lèi)似密碼作用，能調(diào)控基因的表達(dá)［15-16］。研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白H3K4甲基化可激活基因轉(zhuǎn)錄［17］，并且這種組蛋白修飾主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄起始部位附近。染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)是一種在體內(nèi)研究DNA和蛋白質(zhì)相互作用的方法。近年來(lái)此技術(shù)經(jīng)過(guò)不斷的發(fā)展和完善，可與DNA芯片和分子克隆技術(shù)相結(jié)合，衍生出染色質(zhì)ChIP-chip等技術(shù)，用于在基因組水平上對(duì)特定反式作用因子的順式作用元件進(jìn)行高通量篩選。本研究鑒定出的H3K4met3的顯著差異基因涉及細(xì)胞周期調(diào)控基因、離子通道蛋白、核轉(zhuǎn)錄蛋白、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、組蛋白、鋅指蛋白等。并應(yīng)用ChIP-qPCR和qRT-PCR對(duì)芯片結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證，最終證實(shí)該法所得數(shù)據(jù)的正確性。

本研究共篩選出1815個(gè)基因存在h3k4顯著性差異。通過(guò)對(duì)ChIP-cDNA和細(xì)胞mRNA進(jìn)行熒光定量分析發(fā)現(xiàn)，nfib和kpna3基因的組蛋白H3K4met3水平與其cDNA和mRNA的表達(dá)直接相關(guān)且具有一致性，又一次驗(yàn)證了之前研究證實(shí)的H3K4met3是基因激活的標(biāo)志。通過(guò)基因的聚類(lèi)和相互作用進(jìn)一步對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析和比較，最終共確定52個(gè)H3K4met3顯著變化基因，其中H3K4met3上調(diào)基因22個(gè)，下調(diào)基因30個(gè)。免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SiO2染毒促進(jìn)了LF向MF的轉(zhuǎn)化，說(shuō)明H3K4met3陽(yáng)性基因可能在LF轉(zhuǎn)分化的過(guò)程中起關(guān)鍵作用。下一步將驗(yàn)證在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人群中對(duì)篩選芯片檢測(cè)的陽(yáng)性基因中的關(guān)鍵基因。

綜上所述，本研究檢測(cè)分析了在LF轉(zhuǎn)分化過(guò)程中相關(guān)基因的組蛋白H3K4met3水平，提示組蛋白H3K4met3修飾可加快LF向MF的轉(zhuǎn)化進(jìn)程，它們可能參與肺組織纖維化的發(fā)生。所以，相關(guān)基因的組蛋白H3K4met3可為治療矽肺提供一個(gè)新的研究方向，并成為新的干預(yù)靶點(diǎn)。

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Genome-wide analysis of histone H3 lysine 4 trimethylation by ChIP-chip in rat lung fibroblast transdifferentiation

LIU Su-na，YAO Wu，BAO Lei，LI Juan，ZHANG Hong-yi，HOU Jian-yong，WANG Di，CHEN Hui-ting，HAO Chang-fu
（College of Public Health，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001，China）

OBJECTIVE To analyze trimethylation of genome-wide histone H3 lysine 4（H3K4met3）induced by silicon dioxide（SiO2）through chromatin immunoprecipitation linked to microarrays（ChIP-chip）in lung fibroblast（LF）of rats.METHODS A primary co-culture model of rat alveolar macrophages（AM）and LFin vitro.AM were exposed to 100 mg·L-1free SiO2for 24 h，before LF were collected and the phenotype of LF was determined after transdifferentiation by immunohistochemistry.ChIP-chip was used to profile the variations of trimethylation in H3K4 of lung fibroblasts in CpG island regions.ChIP-qPCR was used to validate the microarray results.The mRNA expression ofnfibandkpna3was analyzed by qRT-PCR.RESULTS Totally 1815（518 increased and 1297 decreased）genes of H3K4met3 displayed significant differences in SiO2100 mg·L-1group compared with control group（Cy3/ Cy5 value>2.0 or<0.5，NimbleScan V2.5 software）.The results of ChIP-qPCR were quite consistent with those of microarray.CONCLUSION There are significant differences in methylation of genomewide H3K4 between SiO2100 mg·L-1group and control group.These novel candidate genes may become potential biomarkers or new interfered targets.

fibroblast；silicon dioxide；alveolar macrophages；chromatin co-immunoprecipitation；histone H3 lysine 4；methylation

HAO Chang-fu，E-mail：haochangfu@126.com，Tel：（0371）67781241

R965.2

A

1000-3002-（2016）07-0728-08

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.07.004

Foundation item：The project supported by National Natural Science Foundation of China（81102109）；and National Natural Science Foundation of China（81472954）

2015-12-15接受日期：2016-06-12）

（本文編輯：沈海南）

國(guó)家自然科學(xué)基金（81102109）；國(guó)家自然科學(xué)基金（81472954）

劉素娜，女，博士研究生，主要從事職業(yè)性肺病的研究，E-mail：liusuna2009@126.com

郝長(zhǎng)付，E-mail：haochangfu@126.com，Tel：（0371）67781241