張彎彎，賈永芳，梁婷婷，張瑞華，杜啟艷，常重杰(河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007)

4種農(nóng)藥對黃河鯉胚胎和仔魚的急性毒性研究

張彎彎，賈永芳，梁婷婷，張瑞華，杜啟艷，常重杰*
(河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007)

為了檢測乙羧氟草醚、五氟磺草胺、高效氯氟氰菊酯和吡蟲啉4種常見農(nóng)藥對水生生物的毒性，以黃河鯉胚胎和仔魚為材料，研究4種農(nóng)藥的急性毒性效應(yīng)。在鯉魚胚盤隆起期、原腸胚中期、神經(jīng)胚期、尾芽期分別進(jìn)行藥物處理(未施用農(nóng)藥處理為對照)，研究 4種農(nóng)藥對黃河鯉胚胎孵化率和畸形率的影響。結(jié)果表明，乙羧氟草醚、五氟磺草胺、高效氯氟氰菊酯和吡蟲啉處理組胚胎最低孵化率分別為44.77%、50.68%、43.50%、51.26%，極顯著低于對照組；最高畸形率依次為43.75%、51.10%、61.91%、52.07%，極顯著高于對照組；黃河鯉胚胎對農(nóng)藥的最敏感時(shí)期集中于原腸胚中期和神經(jīng)胚期。在仔魚的急性毒性試驗(yàn)中，乙羧氟草醚、五氟磺草胺、高效氯氟氰菊酯、吡蟲啉對黃河鯉仔魚的96 h半致死質(zhì)量濃度(LC50)分別為0.118 9 mg/L、0.743 2 mg/L、1.126 5 μg/L、12.940 8 mg/L。可見，4種農(nóng)藥對黃河鯉胚胎和仔魚具有劇毒或高毒性效應(yīng)，應(yīng)適量施用。

農(nóng)藥； 黃河鯉； 胚胎； 仔魚； 急性毒性

我國是農(nóng)藥生產(chǎn)和使用大國，農(nóng)藥在提高作物產(chǎn)量，防治病蟲害等方面起著不可低估的作用[1-2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國年均農(nóng)藥使用量為50萬t左右，單位面積化學(xué)農(nóng)藥的平均用量比世界發(fā)達(dá)國家高2.5～5.0倍。農(nóng)藥作為一種有毒的化學(xué)藥劑，長期大量使用所帶來的生態(tài)環(huán)境問題已經(jīng)引起了人們的廣泛關(guān)注和重視[3]。在施用過程中，僅有1%左右的農(nóng)藥作用于靶生物，其余的或殘留于土壤，或通過間接途徑進(jìn)入水環(huán)境，從而影響土壤生物和水生生物[4-6]。未被靶植物吸收的除草劑通過各種方式擴(kuò)散，對環(huán)境中其他生物造成危害，并通過食物鏈威脅到人類的健康[7-8]。近年來，許多專家學(xué)者著重就除草劑和殺蟲劑等農(nóng)藥的分布情況、藥效試驗(yàn)、動植物殘留等開展了較為系統(tǒng)的研究[9-10]，然而有關(guān)乙羧氟草醚、五氟磺草胺、高效氯氟氰菊酯和吡蟲啉對鯉魚的毒性研究尚未見報(bào)道。

鯉魚是世界上重要的養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類，具有品種性狀穩(wěn)定、生長速度快、成活率高等優(yōu)點(diǎn)，作為主導(dǎo)的鯉科魚類之一，鯉魚在全球100多個(gè)國家養(yǎng)殖，其產(chǎn)量占全球每年淡水養(yǎng)殖產(chǎn)量的10%[11]。黃河鯉(Cyprinuscarpio)產(chǎn)于黃河水域，是我國北方的主要淡水養(yǎng)殖品種[12]，也是河南省的特色鯉魚。水環(huán)境與魚類的生長和繁殖有著極為密切的關(guān)系，特別是對魚類胚胎發(fā)育的影響更為明顯。鑒于此，檢測了乙羧氟草醚、五氟磺草胺、高效氯氟氰菊酯和吡蟲啉4種常見農(nóng)藥對黃河鯉胚胎和仔魚的毒性，以期為水環(huán)境污染的生物監(jiān)測、制定合理的農(nóng)藥使用標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

黃河鯉取自河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院水產(chǎn)養(yǎng)殖場。挑選體質(zhì)健康、無傷、無病、發(fā)育成熟的3齡黃河鯉，經(jīng)過人工授精得到胚胎。胚胎孵化后3 d為試驗(yàn)用仔魚，從中挑選健康活潑和體表無損的個(gè)體，體長0.8～1 cm, 體質(zhì)量0.3～0.5 g，試驗(yàn)用水為充分曝氣的自來水，試驗(yàn)期間水溫20～25 ℃，pH值 6.5～7.5。

4種農(nóng)藥分別為2種除草劑：乙羧氟草醚(fluoroglycofen)購自淄博新農(nóng)基農(nóng)藥化工有限公司，五氟磺草胺(penoxsulam)由美國陶農(nóng)科公司開發(fā)；2種殺蟲劑：高效氯氟氰菊酯(lambda-cyhalothrin)為第3代新型菊酯類殺蟲劑[13]，吡蟲啉(imidacloprid)，化學(xué)名稱為1-(6-氯吡啶-3-吡啶基甲基)-N-硝基亞咪唑烷-2-基胺，中文別名滅蟲精、蚜虱凈等[14]，均購自新鄉(xiāng)市東海農(nóng)資市場。

1.2 方法

1.2.1 4種農(nóng)藥對黃河鯉胚胎的急性毒性試驗(yàn) 對4種農(nóng)藥分別進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，得出黃河鯉從受精到仔魚全部存活和使其全部死亡的最高質(zhì)量濃度和最低質(zhì)量濃度。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)設(shè)定試驗(yàn)質(zhì)量濃度,乙羧氟草醚：0(對照，A)、0.025 0(B)、0.050 0(C)、0.100 0(D)、0.200 0(E)、0.400 0(F) mg/L，五氟磺草胺：0(對照，A)、0.312 5(B)、0.625 0(C)、1.250 0(D)、2.500 0(E)、5.000 0(F) mg/L；高效氯氟氰菊酯：0(對照，A)、0.312 5(B)、0.625 0(C)、1.250 0(D)、2.500 0(E)、5.000 0(F) μg/L；吡蟲啉：0(對照，A)、1.562 5(B)、3.125 0(C)、6.250 0(D)、12.500 0(E)、25.000 0(F) mg/L。每種農(nóng)藥設(shè)6個(gè)質(zhì)量濃度梯度，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)3個(gè)平行。每組隨機(jī)投放胚胎，每隔24 h分別更換一次相同體積、相同質(zhì)量濃度的農(nóng)藥稀釋液。選取4個(gè)發(fā)育時(shí)期開始處理，分別為胚盤隆起期、原腸胚中期、神經(jīng)胚期、尾芽期，測定黃河鯉的孵化率和畸形率。

1.2.2 4種農(nóng)藥對黃河鯉仔魚的急性毒性試驗(yàn) 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)，應(yīng)用與胚胎急性毒性相同的藥物質(zhì)量濃度處理黃河鯉仔魚，每組均隨機(jī)投放鯉魚仔魚30尾，設(shè)定每隔24 h分別更換一次相同體積、相同質(zhì)量濃度的農(nóng)藥稀釋液，暴露后連續(xù)觀察，記錄96 h鯉魚仔魚的死亡率和中毒癥狀，試驗(yàn)共重復(fù)3次。

采用改進(jìn)寇氏法[15-16]，計(jì)算出半數(shù)致死質(zhì)量濃度(LC50)。LC50的計(jì)算公式為:

logLC50=Xm-i(Σp-0.5)。

式中，Xm為試驗(yàn)組最大劑量的對數(shù)，i為相鄰組質(zhì)量濃度對數(shù)之差，p為各組的死亡率，Σp為各組死亡率的總和。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有的試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用Excel進(jìn)行處理，采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種農(nóng)藥對黃河鯉胚胎的急性毒性

2.1.1 4種農(nóng)藥對黃河鯉胚胎孵化的影響 從表1可以看出，4種農(nóng)藥在黃河鯉胚胎所有發(fā)育時(shí)期處理時(shí)，隨染毒劑量的增加胚胎孵化率均呈現(xiàn)逐步降低的趨勢。

在神經(jīng)胚期，0.400 0 mg/L乙羧氟草醚濃度組的鯉魚胚胎孵化率最低(44.77%)，與對照組(88.48%)相比差異極顯著；五氟磺草胺染毒時(shí)，在原腸胚期和尾芽期，最低質(zhì)量濃度組(0.312 5 mg/L)胚胎孵化率與對照組相比差異不明顯，5.000 0 mg/L質(zhì)量濃度組在神經(jīng)胚期染毒時(shí)孵化率最低(50.68%)，與對照組(91.69%)相比差異極顯著；高效氯氟氰菊酯染毒時(shí)，最低孵化率(43.50%)出現(xiàn)在5.000 0 μg/L質(zhì)量濃度組原腸胚期；吡蟲啉最高質(zhì)量濃度(25 mg/L)處理組在原腸胚期胚胎孵化率最低(51.26%)，與對照組(91.07%)相比極顯著下降。綜上，黃河鯉胚胎對農(nóng)藥的最敏感時(shí)期集中于原腸胚中期和神經(jīng)胚期。

表1 4種農(nóng)藥對黃河鯉胚胎孵化率的影響 %

注：*、** 分別表示與對照組相比差異顯著(P<0.05)、極顯著(P<0.01)，下同。

2.1.2 4種農(nóng)藥對黃河鯉胚胎畸形的影響 4種農(nóng)藥處理后，黃河鯉胚胎畸形形態(tài)有7種類型：心包囊腫、脊椎彎曲、尾部彎曲、脊椎彎曲伴有心包囊腫、斷尾、斷尾伴有心包囊腫、軀體萎縮伴有心包囊腫(圖1)。從表2可以看出，乙羧氟草醚、五氟磺草胺、高效氯氟氰菊酯和吡蟲啉最低質(zhì)量濃度處理組的胚胎畸形率分別為16.72%、15.57%、14.56%、12.29%，與對照組相比差異不明顯；最高質(zhì)量濃度組胚胎畸形率分別為43.75%、51.10%、61.91%、52.07%，極顯著高于對照組。隨著藥物質(zhì)量濃度的增加，4種農(nóng)藥對黃河鯉胚胎的致畸作用均呈增強(qiáng)趨勢。

a.形態(tài)正常; b.心包囊腫; c.尾部彎曲; d.脊椎彎曲伴有心包囊腫; e.脊椎彎曲; f.斷尾伴有心包囊腫; g.斷尾; h.軀體萎縮伴有心包囊腫圖1 試驗(yàn)組黃河鯉胚胎的畸變形態(tài)

2.2 4種農(nóng)藥對黃河鯉仔魚的急性毒性

黃河鯉仔魚在4種農(nóng)藥的不同質(zhì)量濃度處理下表現(xiàn)出中毒癥狀，處理10～30 min后仔魚個(gè)體急速游動，4周分散，不停地把頭伸出水面；隨著處理時(shí)間延長，仔魚脊椎彎曲、原地打轉(zhuǎn)游動、甚至肚皮翻轉(zhuǎn)；死亡時(shí)，仔魚眼睛外凸，身體彎曲抽搐。各處理組不同質(zhì)量濃度造成的鯉魚仔魚死亡率見表3，其中，乙羧氟草醚、五氟磺草胺、高效氯氟氰菊酯和吡蟲啉組鯉魚最高死亡率分別達(dá)到75%、100%、90%、65%，較對照組死亡率依次上升75、95、90、65個(gè)百分點(diǎn)，且在96 h內(nèi)，隨著染毒劑量的增高，仔魚死亡率隨之呈明顯上升趨勢。

表3 4種農(nóng)藥對黃河鯉仔魚96 h死亡率的影響

3 結(jié)論與討論

魚類胚胎和仔魚時(shí)期對水環(huán)境毒物較為敏感，對胚胎和仔魚展開低毒毒物的毒性效應(yīng)研究在水環(huán)境生物監(jiān)測中具有重要意義[17-19]。目前，有關(guān)斑馬魚、金魚、草魚的胚胎毒性研究已有不少報(bào)道[20-21]。相比于成體，以胚胎和仔魚為試驗(yàn)材料具有成本更低廉的優(yōu)點(diǎn)。因此，胚胎和仔魚的急性毒性試驗(yàn)也是研究毒物對魚類毒性效應(yīng)的有效方法[22]。

黃河鯉胚胎的急性毒性試驗(yàn)以胚胎孵化率和畸形率為指標(biāo)，分析2種水稻除草劑和2種殺蟲劑對黃河鯉胚胎的毒性效應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，在各個(gè)發(fā)育時(shí)期中，隨著處理時(shí)間的延長和處理劑量的增大，胚胎的孵化率呈下降趨勢，畸形率呈逐漸升高趨勢。農(nóng)藥對于鯉魚胚胎的形態(tài)建成具有嚴(yán)重的畸變影響。夏勇等[23]在丁草胺對斑馬魚胚胎發(fā)育毒性影響研究中發(fā)現(xiàn)，斑馬魚胚胎具有脊椎彎曲、心包囊腫、骨骼畸形3種畸變形態(tài)，本研究中觀察到7種明顯畸形形態(tài)，其中大部分畸形均有彎背的癥狀，與Zhu 等[24]的研究結(jié)果類似。可見，4種農(nóng)藥強(qiáng)烈抑制黃河鯉胚胎孵化率并且對其形態(tài)發(fā)育有致畸作用。

鯉魚胚胎對4種農(nóng)藥反應(yīng)呈現(xiàn)的最敏感時(shí)期存在著較大的差異，乙羧氟草醚和五氟磺草胺各質(zhì)量濃度組在神經(jīng)胚期對胚胎孵化率影響最大，高效氯氟氰菊酯和吡蟲啉則在原腸胚中期對胚胎孵化率影響最大。這種差異可能是由于鯉魚胚胎對于毒物的吸收和代謝途徑不同所導(dǎo)致的。雖然黃河鯉胚胎對4種農(nóng)藥最敏感的時(shí)期不同，但其最敏感時(shí)期集中于原腸胚中期和神經(jīng)胚期，與吳小華[25]分析8-羥基喹啉、油煙清潔劑對2種泥鰍的毒性研究結(jié)果相似。表明，原腸胚中期和神經(jīng)胚時(shí)期的鯉魚胚胎發(fā)育更容易受到外界的干擾，此時(shí)鯉魚胚胎各個(gè)胚層開始分化，器官原基開始形成，物質(zhì)代謝加速，可能更易受到環(huán)境的影響。

農(nóng)藥通常參照藥理學(xué)中LC50大小來劃分有毒物質(zhì)對魚類毒性強(qiáng)弱的標(biāo)準(zhǔn)(劇毒：<1 mg/L；高毒：1～100 mg/L；中毒：100～1 000 mg/L；低毒：1 000～10 000 mg/L；微毒：>10 000 mg/L[26])，依據(jù)4種農(nóng)藥對于黃河鯉仔魚急性毒性96 h的LC50，乙羧氟草醚、五氟磺草胺、高效氯氟氰菊酯LC50均小于1 mg/L，屬于劇毒，吡蟲啉屬于高毒。本研究中4種農(nóng)藥毒性大小為高效氯氟氰菊酯>乙羧氟草醚>五氟磺草胺>吡蟲啉。因此，在魚類的繁殖季節(jié)，要對農(nóng)藥的用量進(jìn)行嚴(yán)格的把控，避免不合理用藥給鯉魚及其他魚類的胚胎和仔魚帶來危害。

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Acute Toxicity of Four Pesticides on Embryo and Larvae of Yellow River Carp(Cyprinuscarpio)

ZHANG Wanwan,JIA Yongfang,LIANG Tingting,ZHANG Ruihua,DU Qiyan,CHANG Zhongjie*
(College of Life Science,Henan Normal University,Xinxiang 453007,China)

In this study,four pesticides fluoroglycofen,penoxsulam,lambda-cyhalothrin,imidacloprid were investigated for their acute embryo and larvae toxicity on Yellow River carps.After exposure to four pesticides from blastodisc forming, gastrula,neurulation and tail bud stage respectively(the control group without pesticide),the hatching rate and teratogeny rates were recorded.The results showed that the least embryo hatching rate of fluoroglycofen,penoxsulam,lambda-cyhalothrin,imidacloprid treatment groups (44.77%,50.68%,43.50%,51.26%) were significant lower than that of control;the highest teratogeny rate (43.75%,51.10%,61.91%,52.07%) were significant higher than that of control,the most sensitive toxicity effect caused by pesticides occured at gastrula and neurula stage.Through acute larvae toxicity experiments,the LC50(96 h) of fluoroglycofen,penoxsulam,lambda-cyhalothrin,imidacloprid in Yellow River carp larvae were 0.118 9 mg/L,0.743 3 mg/L,1.122 6 μg/L,12.940 8 mg/L respectively.In summary,four kinds of pesticides all showed highly toxic to Yellow River carp and should be used reasonably.

pesticide； Yellow River carp； embryo； larvae； toxicity

2016-03-26

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31200923，U1204329)；河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)項(xiàng)目(142300410164)；河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目(142102310045)；河南省教育廳自然科學(xué)研究項(xiàng)目(14A180031)

張彎彎(1992-)，女，河南洛陽人，在讀碩士研究生，研究方向：分子遺傳學(xué)。E-mail：m15565233893@163.com

*通訊作者：常重杰(1965-)，男，河南禹州人，教授，主要從事分子細(xì)胞遺傳學(xué)研究。E-mail：changzhongjie@tom.com

S948

A

1004-3268(2016)09-0135-05