何國(guó)菊，曹 宇(貴陽(yáng)學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院/生物控制與資源利用貴州省高校特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng)550005)

復(fù)合菌混合發(fā)酵馬鈴薯薯渣與莖葉的工藝研究

何國(guó)菊，曹 宇
(貴陽(yáng)學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院/生物控制與資源利用貴州省高校特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng)550005)

為資源化利用馬鈴薯薯渣與莖葉，將兩者混合后，用黑曲霉、植物乳桿菌和啤酒酵母菌制成的復(fù)合菌劑進(jìn)行接種，通過(guò)單因素試驗(yàn)研究莖葉中水分含量、營(yíng)養(yǎng)成分及菌劑的添加、接種量三因素對(duì)薯渣與莖葉混合物發(fā)酵效果的影響，并在優(yōu)化發(fā)酵工藝條件下測(cè)定了發(fā)酵前后產(chǎn)物的重要成分含量。結(jié)果表明：優(yōu)化發(fā)酵工藝為當(dāng)莖葉水分為50%時(shí)，在1 000 g按實(shí)際比例混合的薯渣與莖葉混合物中添加(NH4)2SO460 g、過(guò)磷酸鈣95 g，復(fù)合菌劑接種量為5%，厭氧發(fā)酵20 d。與發(fā)酵前相比，優(yōu)化發(fā)酵產(chǎn)物真蛋白含量提高328.26%，蛋白質(zhì)可消化率提高172.79%，硫銨素、煙酸、葉酸、乳酸、鈣、磷含量分別提高6 251.72%、755.32%、767.52%、1 812.50%、111.11%、411.11%；發(fā)酵后產(chǎn)品粗纖維含量降低55.53%，尿素和龍葵素殘留量均在安全值范圍內(nèi)。因此，接種復(fù)合菌劑發(fā)酵薯渣與莖葉的混合物，不僅可改善飼料的品質(zhì)，還可提高飼料的安全性。

復(fù)合菌； 混合； 發(fā)酵； 馬鈴薯薯渣； 馬鈴薯莖葉

每生產(chǎn)1 t馬鈴薯淀粉將產(chǎn)生5 t左右薯渣，對(duì)馬鈴薯薯渣最經(jīng)濟(jì)的利用方式是直接作為禽畜飼料。但鮮薯渣蛋白質(zhì)含量低，直接食用不能滿足家畜營(yíng)養(yǎng)需求，且薯渣含水量高達(dá)80%左右，呈現(xiàn)出典型的膠體特性，若烘干制成干飼料則成本過(guò)高，導(dǎo)致其成為廢棄物并造成環(huán)境污染[1-2]。資源化利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)成為馬鈴薯薯渣處理的關(guān)鍵。馬鈴薯鮮渣中粗蛋白含量為1%，粗脂肪含量為0.16%，粗纖維和果膠含量均為9.4%，糖類含量約為1%[3]，是良好的微生物基質(zhì)。因此，前人利用馬鈴薯薯渣進(jìn)行液態(tài)或固態(tài)發(fā)酵制備飼料[4-5]，但液態(tài)發(fā)酵多為耗氧發(fā)酵，能源成耗高；薯渣干制成本高,以鮮薯渣進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，須添加米糠、麥麩等吸收劑吸收水分，又需增加額外成本。我國(guó)馬鈴薯莖葉資源年產(chǎn)量達(dá)1.2億～1.8億t[6]，馬鈴薯莖葉干物質(zhì)中，粗蛋白含量占16.2%、粗纖維含量占20.8%、粗脂肪含量占1.8%[7]，具有較好飼用價(jià)值。但馬鈴薯莖葉龍葵素含量高、適口性差，不宜直接飼喂，大部分被農(nóng)戶丟棄。目前,對(duì)馬鈴薯莖葉的利用主要是作為青貯飼料使用[8]，但因其莖葉中糖含量較低(0.3%～0.8%)，不利于乳酸菌繁殖，單獨(dú)發(fā)酵腐爛比較嚴(yán)重[9-10]?？紤]到馬鈴薯薯渣和莖葉一定程度上營(yíng)養(yǎng)互補(bǔ)，且預(yù)處理后的馬鈴薯莖葉還可降低薯渣黏度、吸收薯渣多余水分，因此，本研究將馬鈴薯薯渣和預(yù)處理后的馬鈴薯莖葉按實(shí)際所得比例混合，采用多菌協(xié)生混合發(fā)酵[3]，以黑曲霉菌(Aspergillusniger)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)與啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的復(fù)合菌劑接種進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白質(zhì)飼料，變廢為寶，為薯渣和莖葉的綜合利用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料來(lái)源和培養(yǎng)基主成分的制備

馬鈴薯莖葉和塊莖均來(lái)自于貴陽(yáng)農(nóng)戶種植的同一品種馬鈴薯。其中，莖葉在收薯前的3～5 d收割，晾曬一定時(shí)間后，切細(xì)至2 cm備用，完成馬鈴薯莖葉預(yù)處理；將得到的馬鈴薯塊莖在實(shí)驗(yàn)室中模擬工廠生產(chǎn)淀粉的工藝自制馬鈴薯薯渣。薯渣與鮮莖葉的質(zhì)量比為4∶5，將薯渣與預(yù)處理后莖葉按實(shí)際所得比例混合，作為培養(yǎng)基使用。

1.2 菌劑的制備

黑曲霉菌、植物乳桿菌、啤酒酵母均為本實(shí)驗(yàn)室保存菌種。

菌種活化與擴(kuò)大培養(yǎng)：黑曲霉菌于麥芽汁液體培養(yǎng)基中28 ℃活化培養(yǎng)72 h，然后取10 mL于馬鈴薯培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、水1 000 mL，pH值自然)上培養(yǎng)72 h，備用；植物乳桿菌于液體種子培養(yǎng)基 (蛋白胨1%、牛肉膏1%、葡萄糖4%、乙酸鈉0.5%、酵母膏0.5%、檸檬酸二銨0.2%、磷酸氫二鉀0.2%、硫酸鎂0.02%[11])中36 ℃培養(yǎng)12 h，然后取10 mL于馬鈴薯培養(yǎng)基上培養(yǎng)12 h，備用; 啤酒酵母于基礎(chǔ)培養(yǎng)基(葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母浸粉10 g/L)中28 ℃培養(yǎng)24 h，然后取20 mL分裝于裝有麥芽汁培養(yǎng)基的三角瓶中，無(wú)菌條件下每瓶接入活化后酵母菌2滿環(huán)，28 ℃,160 r/min搖床培養(yǎng)24 h。

復(fù)合菌劑的制備：根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，復(fù)合菌劑為擴(kuò)大培養(yǎng)后的黑曲霉菌、啤酒酵母與植物乳桿菌按2∶2∶1體積比混合而成。

1.3 發(fā)酵工藝的優(yōu)化

將薯渣與莖葉的混合物加入帶蓋塑料桶(規(guī)格為5 L)中，添加氮源、過(guò)磷酸鈣、菌劑，拌勻，桶面上蓋1層塑料膜密封。室溫(約10～20 ℃)條件下厭氧發(fā)酵 20 d。

1.3.1 莖葉水分對(duì)發(fā)酵效果的影響 取同質(zhì)量新鮮馬鈴薯莖葉7份,分別晾曬0、8、16、24、32、40、48 h后得到含水量86%、70%、62%、50%、44%、37%、30%的馬鈴薯莖葉，切細(xì)，按實(shí)際比例加入同來(lái)源薯渣，混勻后各取出1 000 g，分別加入(NH4)2SO460 g、過(guò)磷酸鈣95 g，根據(jù)薯渣與莖葉的混合質(zhì)量按接種量5%添加復(fù)合菌劑，發(fā)酵20 d。然后測(cè)定各份產(chǎn)物中真蛋白含量，評(píng)價(jià)發(fā)酵產(chǎn)物感官特征。

1.3.2 添加營(yíng)養(yǎng)成分及菌劑對(duì)發(fā)酵效果的影響 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果,試驗(yàn)設(shè)置6個(gè)處理，處理1：對(duì)照，將1 000 g薯渣與莖葉的混合物置入桶中，不加任何物料，發(fā)酵20 d； 處理2：不發(fā)酵處理，在1 000 g薯渣與莖葉的混合物中加入尿素60 g、過(guò)磷酸鈣95 g，根據(jù)薯渣與莖葉的混合質(zhì)量按接種量5%添加復(fù)合菌劑(下同)，拌勻，直接取樣測(cè)定；處理3：在1 000 g薯渣與莖葉的混合物中加入尿素60 g、過(guò)磷酸鈣95 g，菌劑接種量為5%，拌勻，發(fā)酵20 d；處理4：在1 000 g薯渣與莖葉的混合物中加入尿素60 g，菌劑接種量5%，拌勻，發(fā)酵20 d；處理5：在1 000 g薯渣與莖葉的混合物中加入(NH4)2SO460 g、過(guò)磷酸鈣95 g，菌劑接種量5%，拌勻，發(fā)酵20 d；處理6：在1 000 g薯渣與莖葉的混合物中加入NaNO360 g、過(guò)磷酸鈣95 g，菌劑接種量為5%，拌勻，發(fā)酵20 d。測(cè)定以上6種處理產(chǎn)物的真蛋白含量。

1.3.3 復(fù)合菌接種量對(duì)發(fā)酵效果的影響 將薯渣與含水量50%左右的馬鈴薯莖葉按實(shí)際比例混合加入塑料桶中，按其質(zhì)量的6%添加 (NH4)2SO4、9.5%添加過(guò)磷酸鈣，根據(jù)薯渣與莖葉的混合質(zhì)量分別接種1%、3%、5%、7%、9%的復(fù)合菌劑，拌勻裝入桶中，室溫厭氧發(fā)酵 20 d，分別測(cè)定5種接種量處理發(fā)酵產(chǎn)物的真蛋白含量。

1.4 優(yōu)化后發(fā)酵工藝的效果

根據(jù)1.3篩選得到的優(yōu)化工藝，將預(yù)處理后水分為50%的馬鈴薯莖葉與馬鈴薯薯渣按質(zhì)量比1∶1.1混合，取2份該比例的混合物。第一份直接取樣，用作對(duì)照；在另一份混合物中添加(NH4)2SO460 g、過(guò)磷酸鈣95 g，按接種量5%添加復(fù)合菌劑，置入桶中密封處理，厭氧發(fā)酵20 d。分別測(cè)定發(fā)酵前、后薯渣與莖葉混合物中硫胺素、煙酸、葉酸、真蛋白、鈣、磷、尿素、龍葵素等的含量及蛋白質(zhì)可消化率。

1.5 測(cè)定項(xiàng)目及方法

水分含量測(cè)定采用減壓干燥法(GB/T 14769—93)；真蛋白含量測(cè)定采用硫酸銅沉淀—?jiǎng)P氏定氮法[12]；蛋白質(zhì)可消化率參照文獻(xiàn)[13]制樣并用甲醛法檢測(cè)消化前后樣品中氮含量并計(jì)算；硫銨素含量測(cè)定采用GB/T 5009.84—2003；葉酸含量測(cè)定采用GB/T 5009.211—2008；煙酸含量測(cè)定采用GB/T 5009.89—2003；粗纖維含量測(cè)定采用酸堿處理法(GB 5009.10—85);磷含量測(cè)定采用鉬藍(lán)比色法(GB/T 12393—1990);鈣含量測(cè)定采用乙二胺四乙酸二鈉絡(luò)合滴定法(GB/T 6436—2002)；尿素含量測(cè)定采用二甲氨基苯甲醛比色法[14]；酸度測(cè)定采用GB/T 5517—2010；乳酸含量測(cè)定參照NY 82.12—1988;龍葵素含量測(cè)定采用乙醇-乙酸法雙溶劑提取—HPLC法[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯莖葉含水量對(duì)發(fā)酵效果的影響

由表1可知，隨著莖葉含水量的減少，發(fā)酵產(chǎn)物真蛋白含量先增加后降低。當(dāng)莖葉含水量為50%時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物真蛋白含量最高,有酒香味和淡淡的酸香味，無(wú)腐敗和惡臭氣味，拿到手里感到松散、質(zhì)地柔軟、濕潤(rùn)。環(huán)境中水分直接影響微生物生長(zhǎng)，水分含量為50%的莖葉與薯渣混合后，培養(yǎng)基含水量在67%左右，適合微生物對(duì)水分的要求(65%～70%)[4]。在薯渣中加入預(yù)處理后含一定水分的馬鈴薯莖葉，而不是添加干制后的馬鈴薯莖葉，不僅可以節(jié)約干制莖葉的成本，還可降低莖葉干制過(guò)程中引起的霉菌滋生和營(yíng)養(yǎng)成分損失[16]。因此，選擇水分含量50%的馬鈴薯莖葉與薯渣混合后作為培養(yǎng)基使用。

表1 馬鈴薯莖葉含水量對(duì)發(fā)酵效果的影響

注：以干物質(zhì)計(jì)算真蛋白含量，下同。

2.2 添加營(yíng)養(yǎng)成分及菌劑對(duì)發(fā)酵效果的影響

據(jù)表2可見(jiàn)，處理3、4、5、6發(fā)酵產(chǎn)物真蛋白含量明顯高于處理1、2，說(shuō)明培養(yǎng)基中加入營(yíng)養(yǎng)成分和接入菌劑有助于提高發(fā)酵產(chǎn)物蛋白質(zhì)含量。處理3真蛋白含量比處理4高20.8%，表明添加過(guò)磷酸鈣有助于發(fā)酵。比較尿素、(NH4)2SO4和NaNO3(處理3、5、6)3種氮源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物蛋白質(zhì)含量的影響發(fā)現(xiàn)，(NH4)2SO4的效果最好，NaNO3的效果最差。處理5發(fā)酵產(chǎn)物真蛋白含量比處理2高3.8倍以上，說(shuō)明添加菌劑進(jìn)行發(fā)酵大幅度提高了蛋白質(zhì)含量。因此，1 000 g薯渣與莖葉的混合物中添加(NH4)2SO460 g、過(guò)磷酸鈣95 g，按接種量5%添加復(fù)合菌劑，置入桶中密封處理，厭氧發(fā)酵20 d，發(fā)酵效果最好。

表2 添加營(yíng)養(yǎng)成分及菌劑對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物真蛋白含量的影響

2.3 復(fù)合菌劑接種量對(duì)發(fā)酵效果的影響

由表3知，隨著復(fù)合菌劑接種量的增加，發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白含量先增加后趨于穩(wěn)定，當(dāng)復(fù)合菌劑添加量為5%、7%、9%時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白含量分別為19.3%、19.5%、19.4%，說(shuō)明復(fù)合菌劑添加量為5%時(shí)即可滿足發(fā)酵對(duì)菌劑量的要求。故菌劑接種量確定為5%。復(fù)合菌中的3種微生物均為微生物飼料生物安全通用技術(shù)準(zhǔn)則附錄中所規(guī)定使用的生產(chǎn)菌種。試驗(yàn)中采用乳酸菌和酵母，不僅可提高飼料中的蛋白質(zhì)含量，因發(fā)酵產(chǎn)物有乳酸和乙醇，還能改善飼料風(fēng)味，提高牲畜的食欲；加入黑曲酶，利用培養(yǎng)基中殘余的氧氣，有利于培養(yǎng)基中的纖維素分解成糖類物質(zhì)，補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)源，還可促進(jìn)乳酸菌和酵母對(duì)培養(yǎng)基的后續(xù)發(fā)酵。

表3 復(fù)合菌劑接種量對(duì)發(fā)酵效果的影響

2.4 優(yōu)化工藝發(fā)酵前后重要指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果

由表4 可知，薯渣與莖葉混合物發(fā)酵后真蛋白含量較發(fā)酵前提高328.26%，蛋白質(zhì)可消化率提高172.79%。蛋白質(zhì)降解為肽、短肽和氨基酸后，才能被動(dòng)物吸收利用，采用蛋白質(zhì)可消化率評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值最準(zhǔn)確。因此，發(fā)酵后真蛋白數(shù)量和品質(zhì)都大幅度提高。

發(fā)酵前，薯渣與莖葉混合物中硫胺素、煙酸和葉酸3種維生素含量較少，發(fā)酵后三者含量分別提高了6 251.72%、755.32%、767.52%，這3種維生素對(duì)動(dòng)物均有重要生理功能。說(shuō)明接入復(fù)合菌劑發(fā)酵，有利于提高飼料維生素含量。

厭氧發(fā)酵產(chǎn)品質(zhì)量可用乳酸含量和pH值評(píng)價(jià)，優(yōu)質(zhì)青貯飼料pH值一般小于4.20，同時(shí)乳酸含量高[17]。高含量乳酸引起的低pH值可降低有害微生物數(shù)量，從而提高發(fā)酵品質(zhì)。由表4可知，發(fā)酵前薯渣與莖葉混合物中乳酸含量為0.08%，發(fā)酵后為1.53%，乳酸含量提高了1 812.50%；發(fā)酵前pH值為6.14，發(fā)酵后pH值為3.87，低于4.20，說(shuō)明發(fā)酵效果較好。

復(fù)合菌劑處理薯渣與莖葉混合物發(fā)酵后粗纖維含量(17.3%)比處理前(38.9%)降低55.53%，這是復(fù)合微生物共同協(xié)作的結(jié)果，微生物讓纖維結(jié)構(gòu)更為松散和暴露，有利于纖維素復(fù)合酶酶解纖維素。鈣、磷是動(dòng)物骨骼和牙齒的組成元素，發(fā)酵產(chǎn)物中鈣、磷含量較發(fā)酵前分別增加了111.11%、411.11%。

飼料中尿素含量安全值為不超過(guò)1%[14]，安全值下尿素對(duì)牲畜發(fā)育無(wú)害，發(fā)酵產(chǎn)物可作為粗飼料使用[18]。由表4可知，薯渣與莖葉混合物發(fā)酵前尿素添加量為6.0%，發(fā)酵后尿素含量降低為0.8%，尿素含量大幅度降低說(shuō)明其在發(fā)酵時(shí)作為氮源被微生物消耗。發(fā)酵后尿素殘留量(0.8%)低于1%，表明發(fā)酵產(chǎn)物可作為畜禽飼料使用。馬鈴薯植株和塊莖中都含有龍葵素，人、畜超量攝入龍葵素后會(huì)引起急性中毒,嚴(yán)重時(shí)危及生命。薯渣與莖葉混合物發(fā)酵前龍葵素含量為0.19%，發(fā)酵后降低了84.21%，僅為0.03%。這可能是龍葵素在堿性條件下穩(wěn)定存在，酸性條件下分子結(jié)構(gòu)中糖苷鍵發(fā)生水解[19]，發(fā)酵后低pH值使龍葵素水解而含量降低。發(fā)酵后龍葵素含量(0.03%)也低于龍葵素含量安全值(100 mg/kg)[20]。

表4 發(fā)酵前后薯渣與莖葉混合物中重要指標(biāo)的變化

3 結(jié)論與討論

本研究表明，在1 000 g薯渣與莖葉(含水量50%)按實(shí)際比例混合的混合物中，添加(NH4)2SO460 g、過(guò)磷酸鈣95 g，復(fù)合菌劑(以黑曲霉、植物乳桿菌和啤酒酵母3種菌種制成)接種量為5%，厭氧發(fā)酵20 d，與發(fā)酵前相比，發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白含量提高328.26%，蛋白質(zhì)可消化率提高172.79%；硫胺素、煙酸、葉酸、乳酸、鈣、磷含量分別提高了6 251.72%、755.32%、767.52%、1 812.50%、111.11%、411.11%；粗纖維含量降低55.53%、尿素和龍葵素殘留量均在安全范圍內(nèi)。因此，通過(guò)復(fù)合菌劑發(fā)酵薯渣與莖葉的混合物，不僅可提高飼料的品質(zhì)和安全性，還可以擴(kuò)大飼料資源。

本研究采用生料固態(tài)發(fā)酵薯渣與莖葉的混合物,與液態(tài)發(fā)酵相比，具有簡(jiǎn)易、低投資、低能耗等優(yōu)點(diǎn)，可把發(fā)酵底物、菌體及其代謝產(chǎn)物全部利用，既可保留活性成分又不產(chǎn)生廢液污染。薯渣與莖葉的混合物中添加復(fù)合菌劑后發(fā)酵，真蛋白含量提高328.26%，原因是微生物大量繁殖，單細(xì)胞蛋白含量的提高引起發(fā)酵產(chǎn)物蛋白質(zhì)含量增加。單細(xì)胞蛋白營(yíng)養(yǎng)豐富，含有18～20種氨基酸，富含多種維生素。本研究采用復(fù)合菌劑對(duì)薯渣與莖葉的混合物進(jìn)行接種，植物乳桿菌和酵母菌均為益生菌，能夠改善畜禽的腸道環(huán)境，提高畜禽免疫力。在復(fù)合菌劑作用下，產(chǎn)生乙醇、乳酸和醋酸，這些發(fā)酵產(chǎn)物的積累，既可保持飼料不腐敗，又能改善其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和適口性。

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Study on Fermentation Technique of Potato Residue and Its Stem andLeaves by Compound Bacteria

HE Guoju,CAO Yu
(College of Biology and Engineering of Environment,Guiyang Univcrsity/Key Laboratory of Pest Control & Resource Utilization,Guiyang 550005,China)

For resource utilization of potato residue and its stem and leaves,the compound bacteria,which consisted ofAspergillusniger,LactobacillusplantarumandSaccharomycescerevisiae,was added into the mixture of above waste.The effects of content of water in stem leaves,the addition of nutritional components and bacteria,and inoculation amount of compound bacteria on the fermentation were studied through single factor experiment.Under the optimum fermentation process condition,the important compositions of mixture were determinate before and after fermentation.The results showed that the optimum process parameters were as follows: the content of water in stem leaves was 50%;95 g superphosphate and 60 g (NH4)2SO4were added into the 1 000 g mixture of residue and stem leaves which were mixed according to the practical ratio;the compound bacteria were added according to 5% inoculation amount;the fermentation was implemented in anaerobic environment for 20 days.Compared with that before fermentation,the pure protein content improved by 328.26%,the protein digestion improved by 172.79%,and the content of thiamine,nicotinic acid,folic acid,lactic acid,Ca and P increased by 6 251.72%,755.32%,767.52%,1 812.50%,111.11%,411.11% respectively in the product after fermentation;and the crude fiber content reduced by 55.53%,the contents of urea and solanine were both within the safety value after fermentation.As a conclusion,the fermentation of mixture of potato residue and its stem leaves by compound bacteria not only improved the feed quality,but also increased the feed safety.

compound bacteria; mixture; fermentation; potato residue; potato stem and leaves

2016-02-25

貴陽(yáng)市創(chuàng)新人才計(jì)劃青年科技人才培養(yǎng)補(bǔ)助項(xiàng)目(筑科合同[2012HK]號(hào));貴州省聯(lián)合基金項(xiàng)目(黔科合J字LKG[2013]19號(hào)，黔科合J字LKG[2013]03號(hào))

何國(guó)菊(1978-)，女，四川華鎣人，副教授，博士，主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)方面的研究。E-mail:643159250@qq.com

S963.5；S532

A

1004-3268(2016)09-0158-05