郭 明，樊 君，陳 淵，陳茂青，徐 凱，邊平鳳

（浙江農(nóng)林大學(xué)1.理學(xué)院，2.林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江臨安 311300；3.德清奧麗芙生物科技有限公司，浙江德清 323200；4.浙江大學(xué)化學(xué)系，浙江杭州 310027）

新型黃芩苷金屬離子配合物對Kv1.4和Cav3.2離子通道的影響

郭 明1，樊 君1，陳 淵2，陳茂青3，徐 凱3，邊平鳳4

（浙江農(nóng)林大學(xué)1.理學(xué)院，2.林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江臨安 311300；3.德清奧麗芙生物科技有限公司，浙江德清 323200；4.浙江大學(xué)化學(xué)系，浙江杭州 310027）

目的 探討新型黃芩苷（BC）金屬離子鈷、銅和鎳（Co2+，Cu2+和Ni2+）配合物（BMC）對Kv1.4和Cav3.2離子通道的影響。方法 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染法獲得分別裝載各種離子通道（hERG，Kv1.2，Kv1.3，Kv1.4，Kv1.5，Kv1.6，Kv1.7，Kv1.8，Kir1.1，Kir2.1，KCNQ和Cav3.2）的HEK293細(xì)胞或者CHO細(xì)胞，應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測BC及BMC（BC-Co，BC-Cu和BC-Ni）對各離子通道的影響。全細(xì)胞膜片鉗法檢測不同濃度BC-Co和BC-Cu對穩(wěn)態(tài)表達(dá)Kv1.4和Cav3.2離子通道的細(xì)胞上離子通道電流變化的影響。結(jié)果 獲得了穩(wěn)定表達(dá)各離子通道的CHO細(xì)胞或HEK293細(xì)胞模型。BMC對各離子通道均有一定影響，尤其對Kv1.4和Cav3.2的影響最為明顯。BC-Co，BC-Cu和BC-Ni（10 μmol·L-1）對Kv1.4的抑制率分別為91%，76%和-10%，對Cav3.2的抑制率分別為43%，57%和-14%，表現(xiàn)為金屬離子的類效關(guān)系。BC-Co對Kv1.4和Cav3.2的IC50分別為1.69和0.81 μmol·L-1；BC-Cu對Kv1.4和Cav3.2的IC50分別為1.66和0.58 μmol·L-1。結(jié)論 BC-Cu和BC-Co對Kv1.4和Cav3.2離子通道有濃度依賴性地明顯影響。

黃芩苷；黃芩苷金屬配合物；離子通道；全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)

黃芩苷（baicalin，BC）是傳統(tǒng)中藥黃芩的主要成分，屬于黃酮類化合物，它在清除自由基、抗氧化、抑菌、調(diào)節(jié)免疫、減輕組織缺血再灌注損傷等方面顯示出顯著功效［1-2］。BC分子結(jié)構(gòu)中因含有羥基或羰基等基團(tuán)而與金屬離子有較強(qiáng)的螯合作用，其母核的4位羰基上的氧原子具有很強(qiáng)的配位能力，同時(shí)BC的空間結(jié)構(gòu)也有利于金屬配合物的合成［3］。目前已有關(guān)于黃芩苷金屬配合物（baicalin metal complexes，BMC）的報(bào)道。本課題組也進(jìn)行了BMC的研究［4］，顯示BC與金屬離子配合后，生物利用度提高，藥理活性會(huì)有不同程度的提升。目前，黃酮類藥物對離子通道的影響及作用機(jī)制已有文獻(xiàn)報(bào)道。如Kelemen等［5］研究發(fā)現(xiàn)，綠茶中的黃酮類化合物兒茶素沒食子酸鹽能抑制hERG（human ether-a-go-go related gene）鉀離子通道。Akhlaghi等［6］分析了類黃酮預(yù)防心肌缺血再灌注損傷機(jī)制與離子通道相關(guān)性。Pyle等［7］發(fā)現(xiàn)槲皮素能激活囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白等。BMC在細(xì)胞藥理及蛋白相互作用方面也有研究，但離子通道方面還未見涉及。因此，探討B(tài)C和BMC對離子通道的作用及影響很有必要，可從不同角度了解其藥理作用機(jī)制。本研究從生理作用及種類最廣泛的鉀離子通道和影響藥物作用發(fā)揮較突出的鈣離子通道角度出發(fā)，研究本實(shí)驗(yàn)室制備的3種新型BMC對離子通道的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

BC，純度98%，上海金穗生物科技有限公司產(chǎn)品；BMC，本實(shí)驗(yàn)室合成［4］，BC-Ni，BC-Co及BC-Cu的純度分別為97.4%，98.3%和95.6%；HEK293細(xì)胞和CHO細(xì)胞，北京中國細(xì)胞系資源庫；胎牛血清，美國Gibco公司；LIPofectamineTM2000，美國Invitrogen公司；野生型hERG，Kv1.4，Cav3.2，Kv1.2，Kv1.3，Kv1.5，Kv1.6，Kv1.7，Kv1.8，Kir1.1，Kir2.1和KCNQ基因，獲贈(zèng)于德清奧麗芙生物科技有限公司；HEPES，EGTA和Mg-ATP，美國Sigma公司；高糖DMEM培養(yǎng)基，美國Hyclone公司。HF90型二氧化碳培養(yǎng)箱，中國力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；Thermo Scientific二級生物安全柜，美國賽飛世爾科技公司；CKX31型倒置顯微鏡，日本Olympus公司；Patch clamp-505B膜片鉗儀，美國MD公司；Digidata 1322A數(shù)模轉(zhuǎn)換器、MP-225微操控儀器，美谷分子儀器（上海）有限公司；PC-10微電極拉制儀，日本Narishige公司。

1.2 含各離子通道HEK293或CHO細(xì)胞模型

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人Kv1.2~Kv1.8，hERG或KCNQ的CHO細(xì)胞和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人Kir1.1，Kir2.1或Cav3.2的HEK293細(xì)胞，接種于含10%胎牛血清、青霉素100 kU·L-1、鏈霉素0.1g·L-1和G418 100 mg·L-1的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24~48 h。實(shí)驗(yàn)前1 d，將這些細(xì)胞重新分布在蓋玻片上，用含青霉素100 kU·L-1、鏈霉素0.1 g·L-1和G418 100 mg·L-1的培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3 電生理實(shí)驗(yàn)

利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，通過初篩考察BC及BMC對轉(zhuǎn)染細(xì)胞選定離子通道的影響。對于有顯著影響的離子通道，再進(jìn)一步考察電生理參數(shù)，分析BMC對其的影響方式及可能的作用機(jī)制。

溶液配制：BC及BMC的保存濃度為9 mmol·L-1，溶于二甲亞砜（DMSO）。測試當(dāng)天再用細(xì)胞外液配制成所需濃度（DMSO終濃度始終為0.3%）。hERG離子通道細(xì)胞內(nèi)液〔mmol·L-1：天冬氨酸鉀137，EPES 10，Mg-ATP 4，MgCl24，EGTA 10，pH 7.3（KOH滴定）〕；細(xì)胞外液〔mmol·L-1：NaCl 136，KCl 8，CaCl22，MgCl22，葡萄糖10；HEPES 20，pH 7.3（NaOH滴定）〕。Kv1.4離子通道細(xì)胞內(nèi)液〔mmol·L-1：天冬氨酸鉀鹽130，MgCl25，EGTA 5，HEPES 10，Tris-ATP 4，pH 7.2（KOH滴定）〕。細(xì)胞外液〔mmol·L-1：NaCl 137，KCl 4，CaCl21.8，MgCl21，HEPES 10，葡萄糖10，pH 7.4（NaOH滴定）〕。其余鉀離子通道的細(xì)胞內(nèi)外液與Kv1.4的相同。Cav3.2離子通道細(xì)胞內(nèi)液〔mmol·L-1：CsCl 130，MgCl25，EGTA 5，HEPES 10，Tris-ATP4，pH7.2（KOH滴定）〕。細(xì)胞外液〔mmol·L-1：NaCl 137，KCl 4，CaCl21.8，MgCl21，HEPES 10，葡萄糖10，pH 7.4（NaOH滴定）〕。細(xì)胞內(nèi)液分批少量儲(chǔ)存于-80℃冰箱，實(shí)驗(yàn)當(dāng)天融化。特別說明除外，所有實(shí)驗(yàn)在室溫25℃進(jìn)行。

電生理測試過程：將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至灌流槽中，用細(xì)胞外液進(jìn)行灌流。電極用PC-10微電極拉制儀拉制。全細(xì)胞膜片鉗記錄，噪聲用采樣頻率的20%進(jìn)行過濾。每個(gè)細(xì)胞都以自身為對照，BC和BMC均利用自身重力的灌流系統(tǒng)進(jìn)行灌流。每個(gè)濃度至少測試2組細(xì)胞。在電流穩(wěn)定（或5 min）后，再比較給予BC或BMC前后的電流變化。Kv1.4電流：將細(xì)胞鉗制在-80 mV，持續(xù)500 ms去極化至-20 mV。Cav3.2電流：將細(xì)胞鉗制在-120 mV，持續(xù)50 ms去極化至-30 mV。每個(gè)程序每20 s重復(fù)1次。待電流穩(wěn)定后灌流BC或BMC，以穩(wěn)定后的電流計(jì)算抑制率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Clampex軟件包對離子通道記錄進(jìn)行數(shù)據(jù)和圖形轉(zhuǎn)換，Clmpfit 10.2軟件用于數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)換和處理，Origin 8.5用于作圖和曲線擬合。通過電流抑制率判斷藥物對離子通道的影響，抑制率的計(jì)算公式如下：抑制率（%）=（1-In/I0）×100%。In為給藥后峰電流，I0為給藥前峰電流。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以x±s表示，應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和方差分析。根據(jù)Hill方程計(jì)算藥物的50%最大抑制濃度（IC50）。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的檢測

用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞表達(dá)的通道電流，可以檢測到各離子通道的特征通道電流（圖1）。

Fig.1 Characteristic current of Kv1.4（A）and Cav3.2（B）detected by whole-cell patch-clamp technique.

2.2 BC和BMC對離子通道影響的初篩結(jié)果

由于細(xì)胞間的生物差異，電流的基礎(chǔ)變化等原因，雖然對膜片鉗的條件進(jìn)行了嚴(yán)格控制，但<10%的差異被認(rèn)為對離子通道無明顯影響。采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)獲得的初篩數(shù)據(jù)處理后列于表1，從中可見，BC本身對離子通道的作用均<8%，即藥理作用與離子通道可能無關(guān)。但其金屬配合物對不同離子通道有較大的影響，如BC-Co對Kv1.4和Cav3.2的抑制率分別為91%和43%；BC-Cu對Kv1.4和Cav3.2的抑制率分別為76%和57%（圖2，圖3）。故選擇BC-Co和BC-Cu進(jìn)一步研究其對離子通道Kv1.4和Cav3.2的影響。

Fig.2 Effect of baicalin and its metal complexes on Kv1.4.Kv1.4 ion channels are stably turned into CHO cells. A，B，C and D：inhibitory rate of BC，BC-Co，BC-Cu，and BCNi on KV1.4 was 8%，91%，76%and-10%（promotional rate），respectively.Solid and dotted line：before and after treat?ment with BC and BMC 10 μmol·L-1，respectively.

2.3 BC-Co和BC-Cu對Kv1.4和Cav3.2的影響

以濃度對數(shù)為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，進(jìn)行Logistic函數(shù)擬合，不同濃度BC-Co和BC-Cu對Kv1.4和Cav3.2的影響見圖4。由圖4可知，在10 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)，BC-Co和BC-Cu對Kv1.4的抑制率隨濃度增加而增加；在3 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)，BC-Co和BC-Cu對Cav3.2的抑制率隨濃度增加而增加，與空白對照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P<0.01）。當(dāng)濃度達(dá)>10 μmol·L-1時(shí)，呈現(xiàn)平臺期現(xiàn)象。不同的金屬配合物與BC絡(luò)合后，對不同離子通道電流的阻斷作用強(qiáng)度不同，表現(xiàn)為金屬離子的類效關(guān)系，BC-Co和BC-Cu對Kv1.4的IC50分別為1.69和1.66 μmol·L-1，對Cav3.2的IC50分別為0.81和0.58 μmol·L-1。

Fig.3 Effect of baicalin and its metal complexes on Cav3.2.Cav3.2 ion channels are stably turned into HEK293 cells.A，B，C and D：inhibitory rate of BC，BC-Co，BC-Cu，and BC-Ni on Cav3.2 was-3%，43%，57%and-14%（promotional ratio），respectively.Solid and dotted line：before and after treat?ment with BC and BMC 10 μmol·L-1，respectively.

Fig.4 Inhibitory effect of BC-Co and BC-Cu on Kv1.4 and Cav3.2 ion channels at different concentrations detected by whole-cell patch-clamp technique.A：Kv1.4 ion channel.IC50of BC-Co and BC-Cu were 1.69 and 1.66 μmol·L-1，respectively.B：Cav3.2 ion channel.IC50of BC-Co and BC-Cu were 0.81 and 0.58 μmol·L-1，respectively.The nonlinear fitting curve was obtained by Logistic function.x±s，n=4.

Tab.1 Effect of baicalin（BC）and baicalin metal complexes（BMC）on ion channels detected by whole-cell patch-clamp technique

Fig.5I-Vcurves of BC-Co and BC-Cu on Kv1.4 and Cav3.2.A：BC-Co 30 μmol·L-1on Kv1.4；B：BC-Cu 30 μmol·L-1on Kv1.4；C：BC-Co 30 μmol·L-1on Cav3.2；D：BC-Cu 30 μmol·L-1on Cav3.2.x±s，n=4.

從圖5的電流-電壓曲線可以看出，對于Kv1.4離子通道，以BC-Co或BC-Cu 30 μmol·L-1灌流后，可顯著抑制峰電流（P<0.01），隨著刺激電壓的增加而呈線型增長，具有典型的電壓依賴性特征（圖5A和B）。對于Cav3.2離子通道，BC-Co或BC-Cu 30 μmol·L-1灌流后，均可顯著抑制峰電流（P< 0.01），在刺激電壓-40 mV到達(dá)峰電流時(shí)其抑制率最大（圖5C和D）。

3 討論

離子通道是生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，無論動(dòng)物或植物、單細(xì)胞生物或多細(xì)胞生物的細(xì)胞膜上，都有離子通道的存在［8］，它們是細(xì)胞膜上控制離子進(jìn)出的功能蛋白，在細(xì)胞生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用，如離子吸收、滲透壓調(diào)控、電沖動(dòng)的形成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等［9-13］。根據(jù)離子類型的不同，離子通道可分為K+，Na+，Ca2+和Cl-離子通道。其中K+通道是數(shù)量最大、家族最為多樣的離子通道，對跨膜電流的產(chǎn)生是必要的，在細(xì)胞興奮性的調(diào)節(jié)中起著重要作用［14］。Cav3.2是T型Ca2+通道的一種亞型，在心臟中廣泛分布，主要影響心率，是心臟起搏的關(guān)鍵離子通道［15］。當(dāng)離子通道結(jié)構(gòu)變異或調(diào)控開關(guān)機(jī)制出現(xiàn)紊亂時(shí)，往往造成比較嚴(yán)重的病癥，其中有些是嚴(yán)重的遺傳性病癥，如癲癇、自閉癥、高血壓、心臟病、疼痛和癌癥等。而許多化合物［16］、金屬離子［17］、動(dòng)物毒素［18］、植物毒素［19］和藥物［20］等都可作用于離子通道，影響細(xì)胞膜上信號的產(chǎn)生和傳導(dǎo)。因此研究離子通道的藥理作用是新藥開發(fā)的熱點(diǎn)研究領(lǐng)域，具有非常重要的意義。

BC和BMC有多種藥效，BMC含有金屬離子，可考慮其對離子通道的影響。BMC作用的非主要靶點(diǎn)屬于非靶點(diǎn)靶點(diǎn)（off-target target）或存在潛在的副作用。本工作利用已有的穩(wěn)轉(zhuǎn)離子通道的細(xì)胞株進(jìn)行篩選，這些靶點(diǎn)包括了hERG等心臟的離子通道，因此也對心臟的藥理安全性進(jìn)行了最初評估。從篩選結(jié)果可見，BC-Co和BC-Cu對Kv1.4和Cav3.2離子通道有明顯的阻斷作用。

綜上所述，BMC對K+和Ca2+離子通道有影響，金屬離子因其電荷排布的不同有不同的配位能力和配位數(shù)，這可能與其活性和作用機(jī)制有關(guān)，表現(xiàn)為明顯的類效關(guān)系。從對各K+通道和Cav3.2通道的抑制作用來看，BC及BMC可能通過對離子通道的作用來發(fā)揮其藥理作用，其與離子通道蛋白的結(jié)合方式及空間構(gòu)效的不同可能是其抑制率不同的主要原因，而結(jié)合方式與配合物的離子種類也有很大的關(guān)系，但具體是以何種方式結(jié)合還有待深入的實(shí)驗(yàn)研究。

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Influence of new baicalin-metal complexes on Kv1.4 and Cav3.2 ion channels

GUO Ming1，F(xiàn)AN Jun1，CHEN Yuan2，CHEN Mao-qing3，XU Kai3，BIAN Ping-feng4
（1.School of Science，2.School of Forestry and Bio-technology，Zhejiang Agriculture&Forestry University，Lin′an 311300，China；3.Olive Biological Technology Co.，Ltd.of Deqing County，Deqing 323200，China；4.Department of Chemistry，Zhejiang University，Hangzhou 310027，China）

OBJECTIVE To investigate the effect of new baicalin（BC）metal ions（Co2+，Cu2+，and Ni2+）complexes（BMCs）on ion channels Kv1.4 and Cav3.2.METHODS HEK293 or CHO cells loaded with various ion channels（hERG，Kv1.2，Kv1.3，Kv1.4，Kv1.5，Kv1.6，Kv1.7，Kv1.8，Kir1.1，Kir2.1，KCNQ and Cav3.2）were obtained by stable transfection method.Whole-cell patch-clamp tech?nique was used to record current changes of each ion channel induced by BC and BMC in 10 μmoL·L-1. The effect of different concentrations（0.3，1，3，10 and 30 μmoL·L-1）of BC-Co and BC-Cu on Kv1.4 and Cav3.2 current was detected by whole-cell patch-clamp technique.RESULTS A model of HEK293 cells or CHO cells that stably expressed various ion channels was obtained.BMCs（BC-Co，BC-Cu and BC-Ni）had some impact on various ion channels，especially on Kv1.4 and Cav3.2.The inhibitory rate induced by BC-Co，BC-Cu and BC-Ni（10 μmol·L-1）was 91%，76%and-10%，respectively，for Kv1.4；and 43%，57%and-14%，respectively，for Cav3.2.IC50of BC-Co was 1.69 and 0.81 μmoL·L-1for Kv1.4 and Cav3.2.IC50of BC-Cu was 1.66 and 0.58 μmoL·L-1for Kv1.4 and Cav3.2.CONCLUSION BC-Cu and BC-Co concentration-dependently inhibit Kv1.4 and Cav3.2 ion channels.

baicalin；baicalin metal complexes；ion channel；whole-cell patch clamp technique

GUO Ming，E-mail：guoming@zafu.edu.cn，Tel：（0571）63740852

R285.5

A

1000-3002-（2016）09-0935-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.09.005

Foundation item：The project supported by National Natural Science Foundation of China（20877072）；and Scientific Research Development Fund Project of Zhejiang Agriculture&Forestry University（2013FR032）

2015-09-10接受日期：2016-07-17）

（本文編輯：齊春會(huì)）

國家自然科學(xué)基金（20877072）；浙江農(nóng)林大學(xué)科研發(fā)展基金（2013FR032）

郭 明，男，博士，教師，從事藥物分子相互作用等研究。

郭明，E-mail:guoming@zafu.edu.cn，Tel:（0571）63740852