王曉東

漢黃芩素對(duì)人肝癌SMMC-7721的抑制作用及其作用機(jī)制研究

王曉東

目的研究漢黃芩素對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的抑制及其作用機(jī)制。方法MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖抑制率，Western-blot檢測(cè)細(xì)胞凋亡通路中關(guān)鍵蛋白Pro-caspase-9和Pro-caspase-8的表達(dá)水平。結(jié)果漢黃芩素能抑制人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的增殖，作用癌細(xì)胞后，Procaspase-9蛋白的表達(dá)水平明顯降低，Pro-caspase-8的表達(dá)水平無明顯變化。結(jié)論漢黃芩素能夠抑制SMMC-7721細(xì)胞增殖，漢黃芩素通過線粒體信號(hào)通路促進(jìn)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的凋亡，漢黃芩素作為抗肝癌藥物具有廣闊的應(yīng)用前景。

漢黃芩素；肝腫瘤；細(xì)胞凋亡

漢黃芩素全稱是5，7-二羥基-8-甲氧基黃酮[1]，是傳統(tǒng)中草藥黃芩中發(fā)現(xiàn)41種黃酮類化合物的有效成分之一[2]。自從漢黃芩素被發(fā)現(xiàn)有抗腫瘤活性以來[3]，研究人員從卵巢癌[4]﹑乳腺癌[5]﹑鼻咽癌[6]等方面對(duì)漢黃芩素的抗癌作用及作用機(jī)制進(jìn)行了深入的研究[7]，發(fā)現(xiàn)漢黃芩素對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用有其獨(dú)特的機(jī)制[8]。本研究將對(duì)此做進(jìn)一步研究。

1 試劑及儀器

人肝癌SMMC-7721細(xì)胞株來源于本醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心自我凍存；漢黃芩素購自上海源葉生物科技有限公司；MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒購﹑蛋白定量試劑盒﹑蛋白提取液等購自碧云天公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 MTT法檢測(cè)不同濃度漢黃芩素作用細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞增殖的影響

取處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的SMMC-7721細(xì)胞接種于96孔板中，接種密度5×104個(gè)/100 μL/孔。分別加入50﹑100﹑150﹑200﹑250 μmol/L的漢黃芩素作為實(shí)驗(yàn)組，并以不加漢黃芩素的作為對(duì)照組。分別作用24 h和48 h后在培養(yǎng)體系中加入MTT試劑染色，測(cè)定各孔A570。

2.2 Western-blot 檢測(cè)細(xì)胞凋亡通路中關(guān)鍵蛋白Pro-caspase-9和Pro-caspase-8的表達(dá)水平

步驟如下：（1）利用漢黃芩素處理SMMC-7721細(xì)胞48 h；（2）超聲細(xì)胞破碎機(jī)將細(xì)胞充分破碎；（3）將破碎后細(xì)胞混合物離心機(jī)10 000 g條件下離心15 min；（4）提取總蛋白；（5）SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳進(jìn)行蛋白分離；（6）電泳結(jié)束后將分離的蛋白轉(zhuǎn)移PVDF印跡膜上；（7）5%脫脂奶粉中封閉2 h；（8）Pro-caspase-9和Pro-caspase-8的一抗與PVDF膜過夜孵育；（9）用PBST清洗混合液；（10）二抗抗體室溫且避光條件下共孵育；（11）曝光顯影；顯影后圖片用Bio-Rad Image分析系統(tǒng)查看。:

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果

不同濃度漢黃芩素作用肝癌SMMC-7721分別作用24 h和48 h后，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度的漢黃芩素均可以對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的增殖產(chǎn)生抑制作用；作用時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用越明顯；作用48 h后，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)50% 時(shí)的漢黃芩素濃度為210 μM。

3.2 Western Bolt檢測(cè)Pro-caspase-9和Pro-caspase-8蛋白實(shí)驗(yàn)結(jié)果

利用漢黃芩素處理肝癌細(xì)胞48 h，提取細(xì)胞總蛋白并利用Western Bolt檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡兩種信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白Pro-caspase-9及Pro-caspase-8的表達(dá)水平。Western Bolt檢測(cè)結(jié)果顯示：漢黃芩素作用肝癌細(xì)胞前后，作為參照的β-actin的灰度值分別為0.785﹑0.794；Pro-caspase-8的灰度值分別為0.598﹑0.612；Pro-caspse-9的灰度值分別為0.608﹑0.397。結(jié)果表明，Pro-caspase-8的表達(dá)水平并無明顯變化（P=0.328＞0.05）；Pro-caspse-9的表達(dá)水平明顯降低（P＜0.001）。

4 討論

本研究在確認(rèn)了漢黃芩素對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞的增殖抑制及肝癌細(xì)胞致死作用之后，對(duì)漢黃芩素促肝癌細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路進(jìn)行了探討，以進(jìn)一步揭示漢黃芩素對(duì)肝癌細(xì)胞的分子作用機(jī)制。

隨著分子生物學(xué)研究的不斷深入，極為復(fù)雜的細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路和分子機(jī)制的研究取得了重大進(jìn)展。細(xì)胞凋亡主要有兩條信號(hào)通路：線粒體凋亡通路和死亡受體凋亡通路。線粒體通路又稱內(nèi)源性凋亡途徑，在有藥物誘導(dǎo)等外源性刺激情況下，分布于線粒體膜間隙的細(xì)胞色素C（Cytc）等促凋亡活性蛋白釋放至包漿內(nèi)，活化半胱氨酸天冬酶-9前體（Pro-caspase-9），從而激活半胱氨酸天冬酶-9（Caspase-9），進(jìn)一步切割底物使細(xì)胞凋亡；死亡受體通路也成外源性凋亡途徑，該途徑為胞外信號(hào)所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑，死亡因子受體（Fas）在胞外死亡去形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（DISC）后引起胞質(zhì)內(nèi)Pro-caspase-8（半胱氨酸天冬酶-8前體）活化，從而激活Caspase-8（半胱氨酸天冬酶-8），進(jìn)一步啟動(dòng)下游caspase相關(guān)蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果表明漢黃芩素對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的增殖具有抑制作用，且漢黃芩素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡主要是通過線粒體信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。

綜述所述，Pro-caspase-9和Pro-caspase-8的活化是兩條細(xì)胞凋亡途徑的主要區(qū)別。本研究通過Western Blot法檢測(cè)了漢黃芩素作用前后人肝癌SMMC-7721細(xì)胞中Pro-caspase-9和Pro-caspase-8表達(dá)水平的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，漢黃芩素作用后Pro-caspase-9的表達(dá)水平明顯降低而Pro-caspase-8的表達(dá)水平無明顯變化。本研究表明，漢黃芩素對(duì)肝癌細(xì)胞的作用機(jī)制是通過線粒體信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。漢黃芩素作為抗腫瘤藥物尤其是在抗肝癌腫瘤方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

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[2]王沛明，陳文，孟憲麗. 黃芩有效成分在炎癥通路中的作用靶點(diǎn)研究進(jìn)展[J]. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2016，22（17）：12-13.

[3]嚴(yán)靜怡，陳寶安. 漢黃芩素的提取及抗腫瘤的作用機(jī)制[J]. 時(shí)珍國醫(yī)國藥，2012，23（9）：2210-2212.

[4]張娜，周琦，陸松梅，等. 漢黃芩素逆轉(zhuǎn)卵巢癌SKOV3細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性[J]. 腫瘤，2016，36（2）：166-172.

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The Anti-tumor Effect of of Wogonin for SMMC-7721 Hepatocellular Carcinom Cells and its Mechanisms

WANG Xiaodong Department of Pharmacy, The Sixth Affiliated Hospital of Zhongshan University, Guangzhou Guangdong 510000, China

ObjectiveTo observe the anti-tumor effects of Wogonin and investigate the underlined mechanisms preliminarily.MethodsSMMC-7721 cells were cultured with different concentrations of Wogonin and for 24 h or 48 h, cell viabilities were measured by the MTT assay, the expression levels of Pro-caspase-9 and Pro-caspase-8 were detected by Western-blot experiment.ResultsWogonin could inhibit the proliferation of SMMC-7721 cells, after cultured with the Wogonin, the expression levels of Pro-caspase-9 decreased obviously, and the expression levels of Pro-caspase-8 had no obvious decrease.ConclusionThe wogonin has the function of inhibition of the SMMC-7721 cells, the study shows that the wogonin induces tumor cells apoptosis by the mitochondrial pathway, there are broad application prospects for Wogonin as an anti-tumor drug.

Wogonin, Liver neoplasms, Apopatosis

R735.7

A

1674-9308（2016）34-0180-03

10.3969/j.issn.1674-9308.2016.34.100

中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 廣州 510000