郭麗蕓 時(shí)飛 楊柳燕 周國勤 茆建強(qiáng)

摘要：目前好氧反硝化菌生物脫氮的研究還處于試驗(yàn)階段，且主要集中在對高濃度含氮廢水的處理方面，對低濃度含氮污水很難做到深度處理。為解決這一問題，從富營養(yǎng)化的太湖表層水體中篩選3株好氧反硝化菌，經(jīng)生理生化性能測定及分子生物學(xué)方法鑒定，分別為施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）、不動(dòng)桿菌（Acinetobacter sp.）、布魯氏菌（Brucella sp.），株系分別命名為T1、N2、ADB-7。當(dāng)碳氮比為9、pH值為7～9、溫度為30 ℃、搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min時(shí)，菌株ADB-7的好氧反硝化效率最高。隨后研究菌株T1、N2、ADB-7對人工生活污水及富營養(yǎng)化湖泊水樣的氮素脫除情況。結(jié)果表明：24 h內(nèi)菌株ADB-7對人工生活污水中硝態(tài)氮、氨態(tài)氮的去除率分別達(dá)54.32%、83.36%；菌株T1、N2對富營養(yǎng)化湖泊水樣硝態(tài)氮、氨態(tài)氮脫除效果較好，終濃度分別低于1.0、0.2 mg/L。由結(jié)果可知，菌株 ADB-7 短期脫氮效果好，而菌株T1、N2脫氮效果持久，可將3種菌制作混合微生物菌劑，用于環(huán)境水體氮素的脫除。

關(guān)鍵詞：好氧反硝化；人工生活污水；富營養(yǎng)化湖泊；脫氮；微生物菌劑

中圖分類號： S132；X172文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0523-04

近年來，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，工業(yè)廢水及生活污水排放量日益增大，湖泊水質(zhì)環(huán)境受到不同程度的污染，富營養(yǎng)化狀況嚴(yán)重[1-2]。水體中的氨態(tài)氮、硝態(tài)氮都是嚴(yán)重的環(huán)境問題，其中氨態(tài)氮對魚類和其他水生生物具有很強(qiáng)的毒性[3]，硝態(tài)氮能夠破壞水生生物的免疫系統(tǒng)[4]。20多年來，我國科研工作者在湖泊富營養(yǎng)化的治理控制及氮素去除技術(shù)方面做了深入而廣泛的研究，認(rèn)為利用硝化-反硝化脫氮是最行之有效、無2次污染的技術(shù)[5]。

傳統(tǒng)理念認(rèn)為，反硝化作用是在無氧或厭氧條件下進(jìn)行的。20世紀(jì)80年代中后期，首個(gè)好氧反硝化菌株的發(fā)現(xiàn)開啟了人們研究好氧狀態(tài)下脫氮作用的新領(lǐng)域[3]。好氧反硝化菌由于具備異養(yǎng)硝化-好氧反硝化能力，使得硝化、反硝化得以在同一個(gè)反應(yīng)器中進(jìn)行，且操作簡便、運(yùn)行成本低；同時(shí)，反硝化過程釋放的堿可以補(bǔ)償硝化過程中釋放的酸，維持了體系酸堿度穩(wěn)定，受到廣大研究者的青睞[6-7]。國內(nèi)外的專家學(xué)者也陸續(xù)從自然環(huán)境如池塘、底泥、活性污泥等生境中分離出具有好氧反硝化作用的菌株，如Alcaligenes[8]、Pseudomonas[9-10]、Bacillus[11]、Paracoccus、Rhodococcus[12]等。

目前國內(nèi)對于好氧反硝化菌進(jìn)行生物脫氮的研究基本處于試驗(yàn)的探索階段[13-14]，分離得到的好氧反硝化菌菌株多用于對高濃度含氮廢水進(jìn)行脫氮處理[15]，處理后往往還有一定濃度的氮素殘留，很難做到深度處理。因此，針對低氮濃度污水進(jìn)行深度脫氮的研究成為水污染控制工程領(lǐng)域的熱點(diǎn)。本研究從富營養(yǎng)化的太湖水體中篩選出好氧條件下能有效脫氮的菌株，并在實(shí)驗(yàn)室條件下應(yīng)用該菌株對人工生活污水及富營養(yǎng)化湖泊水體進(jìn)行模擬脫氮，以期為富營養(yǎng)化湖泊脫氮的實(shí)際應(yīng)用提供生物材料和理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1培養(yǎng)基及試劑

富集培養(yǎng)基：100 mmol/L NaNO3，2.84 g/L琥珀酸鈉，0.27 g/L（NH4）2SO4，1.36 g/L KH2PO4，0.19 g/L MgSO4·7H2O，1 mL/L微量元素母液[16]，用去離子水補(bǔ)至相應(yīng)體積，調(diào)節(jié)pH值至7.2，于 121 ℃ 滅菌20 min。

反硝化培養(yǎng)基：6.77 g/L檸檬酸三鈉，2.0 g/L KNO3，0.2 g/L MgSO4·7H2O，1.0 g/L KH2PO4，2 mL/L微量元素母液，用去離子水補(bǔ)至相應(yīng)體積，調(diào)節(jié)pH值至7.0～7.5，于 121 ℃ 滅菌20 min。

溴百里酚藍(lán)（Bromothymol Blue，BTB）瓊脂平板：20 g/L瓊脂，1 g/L KH2PO4，1 g/L MgSO4·7H2O，0.5 g/L FeCl2·6H2O，8.5 g/L琥珀酸鈉，1 mL/L BTB（1%溶于乙醇），用去離子水補(bǔ)至相應(yīng)體積，0.15 g/L CaCl2調(diào)節(jié)pH值至7.0～73，于121 ℃滅菌20 min。

半固體BTB培養(yǎng)基：含10 g/L瓊脂，其余成分同BTB瓊脂平板。

人工生活廢水：取校園生活污水，適當(dāng)添加不同量的葡萄糖、KNO3、NH4Cl以及微量元素母液[16]后作為試驗(yàn)用水。

1.2好氧反硝化菌的分離

分別于江蘇省無錫市太湖梅梁灣、貢湖灣及湖心等水域取表層水樣100 mL，加入250 mL三角燒瓶中，在磁力恒溫?cái)嚢柘?，周期性加入少量?.5 mL/h）富集培養(yǎng)基，于30 ℃富集培養(yǎng)24 h后取1 mL，分別稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9濃度梯度，再分別涂布BTB平板。由于反硝化是產(chǎn)堿過程，可使酸堿指示劑BTB變藍(lán)，因此待長出單菌落后，挑取邊界清晰、形態(tài)差異明顯的藍(lán)色單菌落，穿刺接種至半固體BTB培養(yǎng)基，選取培養(yǎng)基頂部顏色變藍(lán)且培養(yǎng)基中有氣泡產(chǎn)生（反硝化產(chǎn)物N2、NO或N2O）或培養(yǎng)基發(fā)生破裂的菌株為好氧反硝化陽性菌株。挑選好氧反硝化速率最高的3株菌，分別命名為T1、N2、ADB-7。

1.3菌株的形態(tài)學(xué)觀察

對菌株T1、N2、ADB-7進(jìn)行革蘭氏染色，用光學(xué)顯微鏡及掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，觀察菌株是否形成菌膜、菌環(huán)，是否有運(yùn)動(dòng)性等，并觀察菌落形態(tài)。

1.4菌株的分子生物學(xué)鑒定

以菌株T1、N2、ADB-7的基因組DNA為模板，采用細(xì)菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGATC（A/C）TGGCTCAG-3′）、1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）擴(kuò)增16S rDNA序列。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 50 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后由生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結(jié)果通過GenBank BLAST進(jìn)行比對，并用MEGA 4[17]軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5菌株生長曲線的測定

取培養(yǎng)16 h的菌懸液于8 000 r/min離心2 min，用滅菌水洗滌2次后進(jìn)行接種。250 mL三角瓶裝100 mL反硝化培養(yǎng)基，以1%接種量于30 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)，每2 h取樣，測定菌體生物量（D600 nm），繪制生長曲線。

1.6不同條件對菌株ADB-7好氧反硝化能力的影響

以菌株ADB-7為代表菌株，采用250 mL三角瓶作為反應(yīng)容器，在恒溫?fù)u床條件下分別測定不同pH值、溫度、碳氮比（C/N）和溶解氧條件下菌株對反硝化培養(yǎng)基氮素的脫除效果。為控制溶解氧的不同，pH值分別取5、7、9，溫度分別設(shè)為20、30、37 ℃，攪拌器轉(zhuǎn)速分別設(shè)為100、120、180 r/min。分別在碳氮比為3、6、9時(shí)，測定菌株反硝化作用的強(qiáng)度。

1.7菌株低濃度氮素去除試驗(yàn)

配制人工生活污水，使硝態(tài)氮、氨態(tài)氮濃度各為25～30 mg/L。試驗(yàn)裝置如圖1所示，反應(yīng)器容積為5 L，試驗(yàn)在室溫下進(jìn)行。取培養(yǎng)16 h的菌懸液1 000 mL，按上述方法離心后加入水樣中，進(jìn)水后啟動(dòng)攪拌裝置進(jìn)行有氧反應(yīng) 23 h，靜止沉降1 h后排水，取樣并測定硝態(tài)氮、氨態(tài)氮的含量。

1.8富營養(yǎng)化湖水氮素去除試驗(yàn)

將取自江蘇省無錫市太湖梅梁灣水樣過濾、去除雜質(zhì)后，加入到上述反應(yīng)器中。每隔1個(gè)反應(yīng)周期（23 h反應(yīng)+1 h沉降）取樣，測定各形態(tài)氮的含量。

1.9檢測方法

水樣經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后進(jìn)行硝態(tài)氮、氨態(tài)氮含量的測定，硝態(tài)氮采用紫外分光光度法測定；氨態(tài)氮采用納氏試劑光度法測定。

2結(jié)果與分析

2.1好氧反硝化菌的分離

經(jīng)過富集培養(yǎng)、BTB平板涂布共獲取48株具有好氧反硝化能力的菌株。經(jīng)半固體BTB穿刺培養(yǎng)復(fù)篩后選取如圖2中間試管的，培養(yǎng)基頂部變藍(lán)（產(chǎn)堿）且有氣泡產(chǎn)生（產(chǎn)氣）的菌株為陽性菌株[18]，其中菌株T1、N2、ADB-7在較短時(shí)間內(nèi)具有較強(qiáng)的反硝化作用。

2.2好氧反硝化菌的的形態(tài)學(xué)觀察

2.5不同條件對好氧反硝化效率的影響

由于菌株ADB-7前期脫氮效率較高，因此測定不同條件對該菌株反硝化作用的影響試驗(yàn)。由圖6-a可見，碳氮比對菌株的好氧反硝化效率具有較大影響，碳氮比越高，好氧反硝化效率越高，這是由于該菌株為異養(yǎng)微生物，需要外界環(huán)境為其提供有機(jī)物以維持菌體自身生長和代謝[7]；當(dāng)碳氮比為9時(shí)，菌體脫氮效果良好。酸堿度也是影響好氧反硝化菌進(jìn)行反硝化作用的1個(gè)重要影響因素[7]。由圖6-b可見，在中性（pH值=7）、堿性（pH值=9）環(huán)境下，菌株ADB-7的反硝化作用明顯強(qiáng)于酸性條件。此外，溫度對菌株的好氧反硝化作用也有明顯影響，溫度高于30 ℃時(shí)，菌株的好氧反硝化作用明顯增強(qiáng)，詳見圖6-c。但是，由于30、37 ℃條件下二者效果相差不大，且考慮到環(huán)境中的實(shí)際溫度除夏季外很少達(dá)到37 ℃，因此本研究將30 ℃定為最適溫度，用于后續(xù)的研究。由圖6-d可見，通過控制搖床轉(zhuǎn)速來控制反應(yīng)器的溶解氧含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min時(shí)，菌株反硝化速率較高，說明該菌株為好氧反硝化菌株，其反硝化作用酶系不受氧氣抑制。

2.6人工生活廢水的氮素去除效果

由表2可見，有氧反應(yīng)24 h后，水體的氮素濃度均有明顯下降，菌株對于硝態(tài)氮的去除率為35%～54%，而對于氨態(tài)氮的去除率則更高，達(dá)到61%～83%，這是因?yàn)槲⑸飼?huì)優(yōu)先利用氨態(tài)氮而非其他形態(tài)氮素構(gòu)建生物量[19-20]。喬楠等通過研究好氧反硝化菌菌株H1對硝態(tài)氮、氨態(tài)氮的利用情況認(rèn)為，在碳源充足的情況下，菌株優(yōu)先利用氨態(tài)氮，而對硝態(tài)氮的利用不顯著或明顯滯后[21]。因此，菌株ADB-7對硝態(tài)氮的去除效率仍有提高空間，菌株ADB-7對硝態(tài)氮、氨態(tài)氮的去除效率均較其他2種菌株高。

2.7富營養(yǎng)化湖泊水樣模擬脫氮試驗(yàn)

由圖7可見，菌株對水體的硝氮確實(shí)存在還原作用。在前60 h，菌株ADB-7去除硝態(tài)氮、氨態(tài)氮的效率均高于菌株T1、N2，說明菌株ADB-7具有快速脫氮的效果，這與人工生活廢水的氮素去除試驗(yàn)結(jié)果（24 h內(nèi)）一致；同時(shí)可見，菌株ADB-7對于硝態(tài)氮的利用率較高，而對于氨態(tài)氮的利用率較低，說明菌株ADB-7用于構(gòu)建生物量的氮素并不多[19-20]，因此其生物量的增加并沒有菌株T1、N2幅度大（圖5）。在60 h后，菌株T1、N2的脫氮效果明顯增強(qiáng)，且強(qiáng)于菌株ADB-7，硝態(tài)氮、氨態(tài)氮的終濃度維持在較低水平，分別低于1.0、0.2 mg/L。因此，菌株ADB-7快速脫氮效果較好，而菌株T1、N2的脫氮持久性較好，可考慮將三者按照不同比例做成高效脫氮菌劑，用于環(huán)境水體的脫氮處理。

3結(jié)論

從自然水體中分離純化得到3株好氧反硝化菌菌株，經(jīng)鑒定后分別命名為（30 ℃）、碳源充足（碳氮比為9）和一定的溶氧量（搖床轉(zhuǎn)速 180 r/min）條件下，菌株的氮還原能力達(dá)到最優(yōu)。3株菌均可在好氧條件下對人工生活污水和富營養(yǎng)化湖泊水樣進(jìn)行硝態(tài)氮和氨態(tài)氮的脫除。菌株ADB-7具有快速脫氮的特點(diǎn)，而菌株T1、N2則可持久脫氮。可將3個(gè)菌株混合制作微生物制劑，用于富營養(yǎng)化湖泊的氮素控制。

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