張 寶，馬麗媛，王春生，杜文敬，樸善花，安鐵洙

（東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱150040）

小鼠MyoD基因誘導(dǎo)綿羊臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞為成肌細(xì)胞的研究

張 寶，馬麗媛，王春生，杜文敬，樸善花，安鐵洙＊

（東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱150040）

摘 要：為了探討小鼠MyoD基因誘導(dǎo)綿羊臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs）為成肌細(xì)胞的可能性，本研究用小鼠MyoD－pcDNA3.1真核表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染綿羊UCMSCs，在觀察細(xì)胞形態(tài)變化的同時(shí)，檢測(cè)成肌細(xì)胞標(biāo)記蛋白表達(dá)、表達(dá)成肌細(xì)胞特異蛋白的細(xì)胞比率和成肌細(xì)胞特異基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，與對(duì)照組（未轉(zhuǎn)染）相比，在轉(zhuǎn)染MyoD－pcDNA3.1質(zhì)粒后第21天，大部分細(xì)胞呈現(xiàn)似成肌細(xì)胞的細(xì)長(zhǎng)管狀；與對(duì)照組未表達(dá)相關(guān)蛋白相比，轉(zhuǎn)染MyoD－pcDNA3.1后第8天，在熒光倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞表達(dá)MyoD和Desmin蛋白熒光，轉(zhuǎn)染后第16天，不僅觀察到細(xì)胞表達(dá)MyoD和Desmin，而且觀察到MyoG蛋白的表達(dá)；對(duì)于轉(zhuǎn)染細(xì)胞后22d的細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，表達(dá)MyoD、MyoG和Desmin的細(xì)胞比率分別達(dá)93.5%、97.4%和99.5%；此外，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)顯示，轉(zhuǎn)染MyoD－pcDNA3.1后第28天，其細(xì)胞中的MyoD、MyoG和Desmin mRNA相對(duì)表達(dá)量分別提高2.046、2.389和5.489倍。上述結(jié)果表明，利用小鼠MyoD構(gòu)建真核表達(dá)載體具有誘導(dǎo)UCMSCs分化為成肌細(xì)胞的功效。

關(guān)鍵詞：小鼠；MyoD基因；綿羊臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；誘導(dǎo)；成肌細(xì)胞

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（Umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs）具有與其他成體干細(xì)胞類似的自我更新和多向分化能力。誘導(dǎo)UCMSCs為其他體細(xì)胞的相關(guān)研究在探明細(xì)胞重編程機(jī)制中具有重要意義。目前，已建立包括人在內(nèi)的多種動(dòng)物UCMSCs分離培養(yǎng)及純化流程［1－2］，該細(xì)胞分離培養(yǎng)簡(jiǎn)便，且因其體外可分化為胰島β細(xì)胞［3］、肝細(xì)胞［4］、心肌細(xì)胞［5］等而備受關(guān)注。研究證實(shí)，利用MyoD基因構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒，不僅能夠誘導(dǎo)肌衛(wèi)星細(xì)胞為成肌細(xì)胞，而且能誘導(dǎo)其他已分化細(xì)胞為成肌細(xì)胞［6］。韋林蓋等［7］利用分離培養(yǎng)的蒙古羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)成脂、成骨和成軟骨細(xì)胞獲得成功。但有關(guān)動(dòng)物異源MyoD基因誘導(dǎo)分化UCMSCs為成肌細(xì)胞的研究鮮有報(bào)道。鑒于此，本研究利用前期構(gòu)建的小鼠MyoD－pcDNA3.1真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染綿羊UCMSCs，探討其誘導(dǎo)綿羊UCMSCs為成肌細(xì)胞的可能性，為建立簡(jiǎn)便、有效的利用UCMSCs獲取成肌細(xì)胞新方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

DMEM／F12培養(yǎng)基、0.25%Trypsin、bFGF和EGF均購自Gibco公司；GFP質(zhì)粒由東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動(dòng)物發(fā)育研究室制備；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購自TIANGEN公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司；MyoD1Rabbit PolyAb、Desmin Rabbit PolyAb和MyoG Rabbit PolyAb1均購自Proteintech公司；Goat Anti－rabbit IgG FITC購自康為世紀(jì)公司；綿羊UCMSCs為實(shí)驗(yàn)室冷凍儲(chǔ)備細(xì)胞；小鼠MyoD－pcDNA3.1真核表達(dá)載體由東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動(dòng)物發(fā)育研究室構(gòu)建［8］。

1.2綿羊UCMSCs的培養(yǎng)與誘導(dǎo)

用DMEM／F12（1∶1）（含10%FBS、1%谷氨酰胺、1%雙抗、4ng／mL EGF和4ng／mL bFGF），采用常規(guī)方法將冷凍保存的綿羊UCMSCs進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)至3～4代，在細(xì)胞達(dá)到50%～60%匯合時(shí)，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說明書分別轉(zhuǎn)染GFP質(zhì)粒（陽性對(duì)照）和小鼠MyoD－pcDNA3.1真核表達(dá)載體質(zhì)粒；轉(zhuǎn)染24h后，用DMEM／F12（1∶1）（含10%FBS、1%谷氨酰胺、1%雙抗）培養(yǎng)基進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)。

1.3誘導(dǎo)細(xì)胞的檢測(cè)

1.3.1細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn) 當(dāng)用GFP質(zhì)粒和小鼠MyoD－pcDNA3.1真核表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染綿羊UCMSCs并對(duì)其進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)后，每隔24h在熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞的形態(tài)變化和細(xì)胞表達(dá)GFP而發(fā)出綠色熒光的情況。

1.3.2成肌細(xì)胞標(biāo)記物的檢測(cè) 用12孔培養(yǎng)板培養(yǎng)對(duì)照組（未經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞）和誘導(dǎo)細(xì)胞，在開始培養(yǎng)后的第8和16天，用預(yù)冷的PBS輕輕漂洗，室溫下添加4%多聚甲醛進(jìn)行固定15min，PBS清洗3次；添加1.0%TritonX－100并置于冰上5min，PBS清洗3次；分別添加稀釋100倍的MyoD1Rabbit PolyAb、Desmin Rabbit PolyAb和MyoG Rabbit PolyAb1（一抗），置于37℃培養(yǎng)箱中孵育45min，PBS清洗3次；添加稀釋500倍的Goat Anti－rabbit IgG FITC（二抗），置于37℃培養(yǎng)箱中孵育45min，PBS清洗2次。經(jīng)上述處理后，在熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞是否有表達(dá)相應(yīng)蛋白所發(fā)出的熒光。

1.3.3表達(dá)成肌細(xì)胞特異蛋白的細(xì)胞比率檢測(cè)

將對(duì)照組和誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞，在開始培養(yǎng)后的第22天，用BD Accuri－C6個(gè)人流式細(xì)胞儀檢測(cè)，所獲數(shù)據(jù)通過Accuri CFlow Plus軟件輸出后，利用FlowJo軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，獲得表達(dá)成肌細(xì)胞MyoD、Desmin和MyoG蛋白的細(xì)胞比率。

1.3.4成肌細(xì)胞特異基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè) 在開始誘導(dǎo)培養(yǎng)后的第28天，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，分別提取對(duì)照組和誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞的RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)成肌細(xì)胞的標(biāo)記基因MyoD、MyoG和Desmin，內(nèi)參用GAPDH基因。根據(jù)GenBank中山羊GAPDH基因序列和標(biāo)記基因序列，利用Oligo 6.0和Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系20μL：SYBR Premix ExTaq（2×）10μL，上、下游引物各0.4μL，模板cDNA 2μL，ROX Reference DyeⅡ（50×）0.4μL，ddH2O 6.8μL。PCR反應(yīng)條件：95℃30s；95℃3s，60℃34s。

表1　引物序列Table 1 Primer sequences

2 結(jié)果與分析

2.1誘導(dǎo)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征

采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染綿羊UCMSCs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染24h后，在熒光倒置顯微鏡下有少量發(fā)出熒光細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染后的48h有80%以上細(xì)胞發(fā)出熒光（圖1）。采用相同方法，將MyoD－pcDNA3.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染綿羊UCMSCs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與未經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞（對(duì)照組）呈長(zhǎng)梭形且旋渦狀排列（圖2A）相比，在轉(zhuǎn)染MyoD－pcDNA3.1質(zhì)粒后第12天，可見部分細(xì)胞呈現(xiàn)似成肌細(xì)胞的細(xì)長(zhǎng)狀或星形（圖2B）；在轉(zhuǎn)染后的第21天，大部分細(xì)胞呈現(xiàn)似成肌細(xì)胞的細(xì)長(zhǎng)管狀（圖2C）。

圖1　轉(zhuǎn)染GFP質(zhì)粒的綿羊UCMSCs（50×）Fig.1 Sheep UCMSCs transfected with GFP plasmid（50×）

圖2　轉(zhuǎn)染MyoD－pcDNA3.1的綿羊UCMSCs形態(tài)Fig.2 Morphology of sheep UCMSCs transfected with MyoD－pcDNA3.1

2.2誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)成肌細(xì)胞標(biāo)記物的檢測(cè)

將MyoD－pcDNA3.1轉(zhuǎn)染傳代培養(yǎng)的綿羊UCMSCs并誘導(dǎo)培養(yǎng)后，采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)細(xì)胞表達(dá)成肌細(xì)胞標(biāo)志蛋白情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組（圖3A）未表達(dá)相關(guān)蛋白相比，經(jīng)轉(zhuǎn)染MyoD－pcDNA3.1的綿羊UCMSCs，在開始誘導(dǎo)培養(yǎng)后第8天，在熒光倒置顯微鏡下，分別觀察到細(xì)胞表達(dá)MyoD和Desmin蛋白所呈現(xiàn)的熒光（圖3B、3C）；在轉(zhuǎn)染MyoD－pcDNA3.1后第16天，分別觀察到誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)MyoD、Desmin和MyoG蛋白所呈現(xiàn)的熒光（圖3D、3E、3F）。

圖3　誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)成肌細(xì)胞標(biāo)記物的檢測(cè)（50×）Fig.3 Detection of induced cell myoblast markers（50×）

2.3 表達(dá)成肌細(xì)胞特異蛋白的細(xì)胞比率檢測(cè)

當(dāng)用MyoD－pcDNA3.1轉(zhuǎn)染傳代培養(yǎng)的綿羊UCMSCs后第22天，用BD Accuri－C6流式細(xì)胞儀檢測(cè)表達(dá)成肌細(xì)胞特異蛋白的細(xì)胞比率，其數(shù)據(jù)通過Accuri CFlow Plus軟件輸出，并利用FlowJo軟件分析獲得表達(dá)MyoD、Desmin和MyoG蛋白的細(xì)胞比率，結(jié)果見圖4。由圖4可知，所檢測(cè)的細(xì)胞中表達(dá)成肌細(xì)胞特異因子MyoD、MyoG和Desmin蛋白的細(xì)胞比率分別為93.5%、97.4%和99.5%。

圖4　誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)MyoD（A）、MyoG（B）和Desmin（C）流式分析圖Fig.4 The flow analysis chart of MyoD（A），MyoG（B）and Desmin（C）induced cell

2.4誘導(dǎo)細(xì)胞的成肌細(xì)胞特異基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè)

以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增、熔解曲線分析及根據(jù)2－ΔΔCt計(jì)算方法，分別檢測(cè)未經(jīng)誘導(dǎo)（對(duì)照組）的綿羊UCMSCs和經(jīng)MyoD－ pcDNA3.1轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)培養(yǎng)后的第28天誘導(dǎo)細(xì)胞的MyoD、MyoG和Desmin基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果見圖5。由圖5可知，當(dāng)對(duì)照組的表達(dá)量為1時(shí)，誘導(dǎo)細(xì)胞的MyoD、MyoG和Desmin mRNA相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組分別提高2.046、2.389和5.489倍。

圖5　誘導(dǎo)細(xì)胞成肌細(xì)胞特異基因mRNA相對(duì)表達(dá)量Fig.5 The mRNA relative expression of myoblast specific genes induced culture

3 討 論

研究證實(shí)，受肌肉生長(zhǎng)抑制素（myostatin，MSTN）調(diào)控的MyoD和Myf5在干細(xì)胞分化為成肌細(xì)胞過程中起作用［9－10］。肌分化因子MyoD（myf3）和肌細(xì)胞生成素MyoG在成肌細(xì)胞及骨骼肌中高表達(dá)［11－12］。Li等［13］研究表明，在未分化的肌源性細(xì)胞中Desmin表達(dá)被抑制，但隨著成肌細(xì)胞的融合，其表達(dá)量逐漸增加至最高值。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠Desmin基因的啟動(dòng)子中具有CREB結(jié)合位點(diǎn)，MyoD可以與CREB結(jié)合蛋白相互作用［14－15］。上述結(jié)果表明，MyoD蛋白能夠激活Desmin和MyoG基因表達(dá)，從而引起未分化的肌源性細(xì)胞分化為成肌細(xì)胞，并誘發(fā)其向骨骼肌分化。

Rudnicki等［16］建立了利用MyoD基因構(gòu)建真核表達(dá)載體以誘導(dǎo)成肌細(xì)胞的方法。采用該方法，不僅能夠誘導(dǎo)肌衛(wèi)星細(xì)胞為成肌細(xì)胞，而且能誘導(dǎo)其他已分化細(xì)胞為成肌細(xì)胞［17－18］。上述結(jié)果表明，MyoD基因構(gòu)建的真核表達(dá)載體方法誘導(dǎo)成肌細(xì)胞有效。此外，MyoD和MyoG在成肌細(xì)胞及骨骼肌中高表達(dá)［11－12］。此外，隨著成肌細(xì)胞的融合，Desmin表達(dá)量逐漸增加。上述結(jié)果表明，MyoD、MyoG和Desmin可作為檢測(cè)成肌細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白。

以往在轉(zhuǎn)染MyoD質(zhì)粒以誘導(dǎo)成肌細(xì)胞的相關(guān)研究中，主要利用源于同種動(dòng)物（包括人）的MyoD基因，鮮有利用異源動(dòng)物MyoD誘導(dǎo)成肌細(xì)胞的相關(guān)報(bào)道。為了探討利用異源MyoD誘導(dǎo)成肌細(xì)胞的可能性，本研究將前期工作中構(gòu)建的小鼠MyoD真核表達(dá)質(zhì)粒［8］轉(zhuǎn)染綿羊UCMSCs后，檢測(cè)其是否分化為成肌細(xì)胞，結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染MyoD－pcDNA3.1質(zhì)粒后第21天，大部分細(xì)胞呈現(xiàn)似成肌細(xì)胞的細(xì)長(zhǎng)管狀；在轉(zhuǎn)染MyoD－pcDNA3.1第8天，可觀察到細(xì)胞表達(dá)MyoD和Desmin蛋白，轉(zhuǎn)染后第16天，不僅觀察到細(xì)胞表達(dá)MyoD和Desmin，而且MyoG蛋白表達(dá)呈陽性；對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞后22d的細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，表達(dá)MyoD、MyoG和Desmin的細(xì)胞比率分別達(dá)93.5%、97.4%和99.5%；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)顯示，轉(zhuǎn)染MyoD－pcDNA3.1后第28天，其細(xì)胞中的MyoD、MyoG和Desmin mRNA相對(duì)表達(dá)量分別提高2.046、2.389和5.489倍。上述結(jié)果表明，利用異源MyoD構(gòu)建的真核表達(dá)載體具有誘導(dǎo)UCMSCs分化為成肌細(xì)胞的功效，但能否利用異源MyoD誘導(dǎo)其他成體細(xì)胞干細(xì)胞或體細(xì)胞分化為成肌細(xì)胞有待于進(jìn)一步研究探討。

4 結(jié) 論

本研究用小鼠MyoD－pcDNA3.1真核表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染綿羊UCMSCs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染后的第21天，大部分細(xì)胞呈現(xiàn)似成肌細(xì)胞的細(xì)長(zhǎng)管狀；在開始誘導(dǎo)培養(yǎng)后的第8天，分別觀察到細(xì)胞表達(dá)MyoD和Desmin蛋白所呈現(xiàn)的熒光，轉(zhuǎn)染后第16天，分別觀察到誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)MyoD、Desmin和MyoG蛋白所呈現(xiàn)的熒光。表明利用異源MyoD構(gòu)建的真核表達(dá)載體具有誘導(dǎo)MSCs分化為成肌細(xì)胞的功效。

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（責(zé)任編輯 晉大鵬）

中圖分類號(hào)：Q813

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1671－7236（2016）12－3232－07

doi：10.16431／j.cnki.1671－7236.2016.12.022

收稿日期：2016－05－09

基金項(xiàng)目：黑龍江省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（2016012）；國家自然科學(xué)基金（31000990）

作者簡(jiǎn)介：張 寶（1992－），男，內(nèi)蒙古呼倫貝爾人，碩士，研究方向：干細(xì)胞定向分化，E－mail：zhangbao182＠163.com

通信作者：＊安鐵洙，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與體細(xì)胞重編程，Tel：0451－82191785；E－mail：antiezhu＠qq.com

Study on Differentiation of Sheep Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells into Muscle Cells Induced by MouseMyoDGene

ZHANG Bao，MA Li－yuan，WANG Chun－sheng，DU Wen－jing，PIAO Shan－h(huán)ua，AN Tie－zhu＊
（CollegeofLifeScience，NortheastForestryUniversity，Harbin150040，China）

Abstract：In order to investigate the differentiation of sheep umbilical cord mesenchymal stem cells（UCMSCs）into muscle cells induced by mouseMyoDgene.This study based on the previous work constructed the eukaryotic expression vector of MyoD－pcDNA3.1in mice，and the vector was transfected into sheep UCMSCs.The morphological changes of cells were observed by fluorescent microsco，the expression ofMyoD，DesminandMyoGgenes were detected by immunofluorescence，the percentage of cells expressing the cell specific factor（MyoD，Desmin and MyoG）was analyzed by flow cytometry and Real－time quantitative PCR to detect the relative expression of mRNA relative to muscle cell specific factor.Compared with the control group（no transfection），the vector was transfected into sheep UCMSCs，it was found that the cells were transformed into a long，slender，muscular cell state，and the cell spiral gradually disappeared at 21th day.It was found that MyoD and Desmin showed positive expression by immunofluorescence assay at 8th day，the expression of MyoG was also found after 16dof induction，and the expression of MyoD decreased，the amount of Desmin expression was no change；By flow cytometry，the percentages of the expression of MyoD，MyoG and Desmin were 93.5%，97.4%and 99.5%，re－spectively；Real－time quantitative PCR results showed that the relative expression of MyoD，MyoG and Desmin were increased and compared with the control group（non transfected cells），the cells were increased by 2.046，2.389and 5.489times，respectively.The results showed that mouceMyoDgene could induce the differentiation of sheep UCMSCs into muscle cells.

Key words：mouse；MyoDgene；sheep umbilical cord mesenchymal stem cells；induction；myoblasts