謝三磊，文鳳云，李俊強(qiáng)，王 晴，梁 鈺，劉藝婷，李 磊，陳 藝

（河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，洛陽471003）

黑羽鵪鶉ESRβ基因外顯子多態(tài)性及其與產(chǎn)蛋性狀的相關(guān)性分析

謝三磊，文鳳云＊，李俊強(qiáng)，王 晴，梁 鈺，劉藝婷，李 磊，陳 藝

（河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，洛陽471003）

摘 要：試驗(yàn)旨在研究鵪鶉雌激素受體β亞基（ESRβ）基因外顯子多態(tài)性及其與產(chǎn)蛋性能的關(guān)聯(lián)性，為鵪鶉產(chǎn)蛋性能候選基因的確立及分子標(biāo)記輔助選育提供理論依據(jù)。選取健康蛋用黑羽鵪鶉為研究對(duì)象，開產(chǎn)后進(jìn)行生產(chǎn)性能的持續(xù)統(tǒng)計(jì)（60d），采用PCR－SSCP法對(duì)鵪鶉ESRβ基因多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，并運(yùn)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行ESRβ基因多態(tài)性與生產(chǎn)性能的相關(guān)性分析。PCR－SSCP檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ESRβ基因外顯子1、3、4、5、6、7和8均存在單核苷酸多態(tài)性。相關(guān)性分析結(jié)果表明，在開產(chǎn)蛋質(zhì)量上，外顯子3CD基因型與CC和DD基因型有顯著性差異（P＜0.05）；在開產(chǎn)日齡上，外顯子5DD基因型與CD和CC基因型有顯著性差異（P＜0.05）；在平均蛋質(zhì)量上，外顯子7CD基因型與CC和DD基因型有顯著性差異（P＜0.05）。表明ESRβ基因與蛋用黑羽鵪鶉產(chǎn)蛋性狀有一定關(guān)聯(lián)性。

關(guān)鍵詞：鵪鶉；ESRβ基因；外顯子；SNPs；產(chǎn)蛋性能

鵪鶉蛋營(yíng)養(yǎng)豐富，相比烏雞蛋和普通雞蛋，其蛋白質(zhì)含量最高，且磷脂含量也較高［1］，故有“卵中佳品”之美稱［2］。鵪鶉還具有較高的藥用價(jià)值，對(duì)高血壓、結(jié)核和代謝障礙等疾病有一定的治療作用［3］。然而影響鵪鶉生產(chǎn)性能與繁殖性能的因素很多，其遺傳力低［4］，通過常規(guī)選育進(jìn)展較為緩慢。在分子標(biāo)記基礎(chǔ)上建立新一代分子育種技術(shù)已成為提高動(dòng)物生產(chǎn)性能的重要研究方向之一。1940年，日本學(xué)者Shimakura首次對(duì)鵪鶉形態(tài)遺傳標(biāo)記進(jìn)行了研究，報(bào)道了鵪鶉的羽色突變遺傳現(xiàn)象。Masaoke－Tsudzuke［5］則對(duì)鵪鶉毛色、喙形、腳趾形狀及蛋殼顏色等形態(tài)標(biāo)記進(jìn)行了報(bào)道。付晶等［6］以北京白羽蛋用鵪鶉為研究對(duì)象，篩選出了能夠準(zhǔn)確鑒定鵪鶉性別的CHD基因標(biāo)記。王旭等［7］利用生物信息學(xué)方法開發(fā)出鵪鶉的6個(gè)EST－SSR新的分子標(biāo)記，并在北京白羽鵪鶉和朝鮮鵪鶉中檢測(cè)其多態(tài)性，結(jié)果表明6個(gè)標(biāo)記均可用于鵪鶉的遺傳多樣性分析。目前，在鵪鶉遺傳分析方面雖然取得了一些成果，但相比之下，中國對(duì)鵪鶉的遺傳研究報(bào)道數(shù)量仍然較少，且研究進(jìn)展緩慢，研究?jī)?nèi)容尚不夠深入，尤其是在分子遺傳研究領(lǐng)域還存在大量的研究工作有待開展。

雌激素受體（estrogen receptor，ESR）基因廣泛存在于各種動(dòng)物體中，是一種配體激活轉(zhuǎn)錄因子家族中的核酸受體［8］，能夠與特異激素應(yīng)答DNA元件相結(jié)合，進(jìn)而改變雌激素調(diào)控的基因轉(zhuǎn)錄，影響動(dòng)物的繁殖性狀及其他生產(chǎn)性能［9］。ESR基因主要有3種亞型：ESRα、ESRβ和ESRγ，分別由不同的基因編碼［10］。本研究選擇與雌性繁殖周期中卵泡生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)的ESRβ基因，以蛋用黑羽鵪鶉作為試驗(yàn)動(dòng)物，采用PCR－SSCP方法檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性，建立鵪鶉ESRβ基因外顯子多態(tài)性與產(chǎn)蛋性狀的相關(guān)性，旨在探討ESRβ基因是否為鵪鶉產(chǎn)蛋性狀的主效基因或主效基因的連鎖基因，從而利用ESRβ基因進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇，為培養(yǎng)出產(chǎn)蛋性能更高的新型母本群體、提高其繁殖性能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1鵪鶉飼養(yǎng)及產(chǎn)蛋情況記錄

蛋用黑羽鵪鶉，共60只，由河南科技大學(xué)龐有志老師友情饋贈(zèng)。鵪鶉飼養(yǎng)采取個(gè)體籠養(yǎng)方式。采用鯤鵬飼料有限公司提供的蛋用鵪鶉產(chǎn)蛋后期配合飼料飼喂。

鵪鶉孵化飼養(yǎng)，從開產(chǎn)（7周齡左右）時(shí)對(duì)鵪鶉群體進(jìn)行產(chǎn)蛋記錄，持續(xù)記錄2個(gè)月（4月16日—6月16日），以獲取開產(chǎn)日齡、開產(chǎn)蛋質(zhì)量、60d產(chǎn)蛋數(shù)和60d平均蛋質(zhì)量等表型數(shù)據(jù)。

1.2基因組DNA提取

采用禽類全血基因組DNA提取試劑盒（北京鼎國生物技術(shù)有限公司）提取蛋用黑羽鵪鶉全血基因組，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中鵪鶉ESRβ基因全序列（登錄號(hào)：AF045149）信息，用在線軟件（http：／／genome.ucsc.edu／cgi－bin／hgBlat？command＝start）進(jìn)行外顯子序列查找。應(yīng)用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物，引物信息見表1。

表1　鵪鶉ESRβ基因各外顯子的引物序列Table 1 Primer sequences ofESRβgene exons in quail

1.4 PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系為20μL：模板DNA 1μL，10× Buffer 2μL，2.5mmol／L dNTP 1μL，上、下游引物各1μL，TaqDNA聚合酶1μL，ddH2O補(bǔ)足20μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，退火（退火溫度見表1）45s，72℃延伸50s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min；4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.5PCR－SSCP分型

將鑒定正確的PCR產(chǎn)物，加入10μL變性上樣緩沖液，煮沸10min，迅速冰浴10min，12%聚丙烯酰胺凝膠電泳后，銀染，拍照保存結(jié)果。根據(jù)PCR－SSCP電泳圖譜，確定純合子及雜合子帶型。

1.6統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)鵪鶉ESRβ基因各外顯子的不同基因型檢出個(gè)數(shù)，計(jì)算基因頻率和基因型頻率。運(yùn)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行基因型與產(chǎn)蛋性狀關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，以P＜0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1鵪鶉ESRβ基因外顯子PCR擴(kuò)增

分別對(duì)鵪鶉ESRβ基因外顯子1、3、4、5、6、7、8序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段與預(yù)期片段大小一致，部分?jǐn)U增結(jié)果見圖1，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠試劑盒回收純化后直接進(jìn)行PCR－SSCP電泳分析。

圖1　鵪鶉ESRβ基因外顯子PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification ofESRβgene exons in quail

2.2鵪鶉ESRβ基因外顯子PCR－SSCP結(jié)果

鵪鶉ESRβ基因各外顯子基因型均有3種：CC、CD、DD。外顯子1的PCR－SSCP檢測(cè)結(jié)果見圖2。

圖2　鵪鶉ESRβ基因外顯子1PCR－SSCP結(jié)果Fig.2 PCR－SSCP result ofESRβgene exon 1in quail

2.3 鵪鶉ESRβ基因外顯子基因頻率與基因型頻率

鵪鶉ESRβ基因各外顯子基因頻率及基因型頻率計(jì)算結(jié)果見表2。由表2可知，ESRβ基因外顯子1兩個(gè)等位基因C和D頻率分別為0.56和0.44；外顯子4各基因型頻率基本相等；外顯子5中CD基因型頻率為優(yōu)勢(shì)基因型；外顯子3、6、7中等位基因C占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)；外顯子8中等位基因C、D基因頻率分別為0.517和0.483。

經(jīng)卡方檢驗(yàn)表明，鵪鶉外顯子3、5達(dá)到顯著水平（P＜0.05），外顯子7達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），處于Hardy－Weinberg不平衡狀態(tài)。表明由于長(zhǎng)期有目的的人工選育，使群體處于Hardy－Weinberg不平衡狀態(tài)。

表2　鵪鶉ESRβ基因外顯子基因頻率及基因型頻率Table 2 The gene frequency and genotype frequency ofESRβgene exons in quail

2.4鵪鶉ESRβ基因外顯子多態(tài)性與產(chǎn)蛋性狀的相關(guān)性

通過SPSS 13.0軟件對(duì)黑羽鵪鶉的開產(chǎn)日齡、開產(chǎn)蛋質(zhì)量、60d平均蛋質(zhì)量等產(chǎn)蛋相關(guān)性狀進(jìn)行分析，獲得黑羽鵪鶉不同基因型與早期產(chǎn)蛋性狀間相關(guān)分析結(jié)果見表3。由表3可知，ESRβ基因外顯子1、4、6和8多態(tài)性位點(diǎn)在開產(chǎn)蛋質(zhì)量、平均蛋質(zhì)量、蛋形指數(shù)及開產(chǎn)日齡上，3種基因型均沒有顯著差異（P＞0.05）；外顯子3多態(tài)性與鵪鶉產(chǎn)蛋性狀的關(guān)系中，CD基因型開產(chǎn)蛋質(zhì)量與CC和DD基因型有顯著性差異（P＜0.05）；外顯子5多態(tài)性與鵪鶉產(chǎn)蛋性狀關(guān)系中，DD基因型在開產(chǎn)日齡上與CD和CC基因型有顯著性差異（P＜0.05）；外顯子7多態(tài)位點(diǎn)與鵪鶉產(chǎn)蛋性狀關(guān)系中，CD基因型在平均蛋質(zhì)量上與CC和CD基因型有顯著性差異（P＜0.05）。另外，外顯子1在開產(chǎn)日齡上DD基因型較CC和CD基因型占優(yōu)勢(shì)；外顯子3在平均蛋質(zhì)量上CD基因型略大于CC和DD基因型，但差異不顯著（P＞0.05）；外顯子4在開產(chǎn)蛋質(zhì)量上CD基因型略大于CC和DD基因型，而外顯子6在開產(chǎn)蛋質(zhì)量上則是DD基因型略大于CC和CD基因型，但差異均不顯著（P＞0.05）；外顯子8在開產(chǎn)日齡上為DD基因型占有優(yōu)勢(shì)，但差異不顯著（P＞0.05）。

表3　ESRβ基因外顯子多態(tài)性與鵪鶉產(chǎn)蛋性狀相關(guān)性分析Table 3 Association between polymorphisms and laying performance ofESRβgene exons in quail

3 討 論

為了從分子水平上揭示朝鮮鵪鶉、中國黃羽鵪鶉和中國黑羽鵪鶉3個(gè)群體遺傳結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系，白俊艷等［11］對(duì)3個(gè)群體進(jìn)行了微衛(wèi)星標(biāo)記的多態(tài)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中國黃羽鵪鶉群體遺傳多樣性最為豐富。龐有志等［12］對(duì)北京白羽鵪鶉群體的9個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記遺傳多樣性分析結(jié)果表明，在9個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記中共存在43個(gè)等位基因，有8個(gè)微衛(wèi)星基因座為高度多態(tài)性標(biāo)記，可作為北京白羽鵪鶉群體遺傳多樣性分析的有效遺傳標(biāo)記。吳勝軍等［13］利用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)對(duì)朝鮮鵪鶉群體的9個(gè)微衛(wèi)星座位進(jìn)行了遺傳多樣性分析，結(jié)果共檢測(cè)出了44個(gè)等位基因，表明朝鮮鵪鶉也是遺傳多樣性較為豐富的群體?；騿魏塑账岫鄳B(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）是指基因組中單個(gè)核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性［14］。SNP作為第3代分子標(biāo)記在分子遺傳學(xué)方面發(fā)揮著重要的作用［15］。SNP具有數(shù)量多、分布廣和穩(wěn)定遺傳等特點(diǎn)［16］，與人類的許多疾病、動(dòng)物的生產(chǎn)性能［17］等密切相關(guān)。本研究通過對(duì)蛋用黑羽鵪鶉ESRβ基因外顯子進(jìn)行SNP分析，統(tǒng)計(jì)鵪鶉的產(chǎn)蛋性狀，探討鵪鶉ESRβ基因外顯子與黑羽鵪鶉產(chǎn)蛋性能的相關(guān)性，為新型蛋用鵪鶉品系的培育工作提供理論依據(jù)。

ESR具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白質(zhì)的功能［18］，影響著雌激素基因在雌性脊椎動(dòng)物組織的表達(dá)與調(diào)控，在胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著重要作用［19］。美國IOWA州立大學(xué)Rothschild研究組發(fā)現(xiàn)，ESRβ基因的PvuⅡ酶切位點(diǎn)多態(tài)性，BB基因型比AA基因型母豬產(chǎn)活仔數(shù)／胎多0.44～1.15頭［9］，陳克飛等［20］也得到同樣的研究結(jié)果。徐寧迎等［21］發(fā)現(xiàn)，ESR基因和催乳素受體基因（prolactin receptor，PRLR）對(duì)金華母豬所有胎次的總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)有顯著的交互作用，對(duì)經(jīng)產(chǎn)的初生仔重有極顯著的交互作用。Wu等［22］研究結(jié)果也表明，ESR基因可以作為長(zhǎng)白豬同胎產(chǎn)仔數(shù)的選育標(biāo)記。對(duì)小尾寒羊ESR基因的研究結(jié)果也提示，ESR基因可能是控制小尾寒羊多胎性能的一個(gè)主效基因或與之存在緊密的遺傳連鎖［23］。在家禽方面，ESR基因也表現(xiàn)出與生產(chǎn)性能密切的關(guān)聯(lián)性。周俊等［24］對(duì)ESR基因與綠殼蛋雞早期產(chǎn)蛋性能相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，ESR基因5′側(cè)翼調(diào)控區(qū)的CC和CD基因型36周平均產(chǎn)蛋量差異顯著。王洪才等［25］對(duì)莊河大骨雞研究結(jié)果表明，ESR基因各基因型在產(chǎn)蛋數(shù)和蛋料比上存在顯著差異。于吉英等［26］對(duì)文昌雞繁殖性狀與ESR基因多態(tài)性關(guān)系研究結(jié)果表明，ESR基因多態(tài)性與300日齡產(chǎn)蛋數(shù)相關(guān)性顯著，與個(gè)體平均連產(chǎn)天數(shù)的相關(guān)性極顯著。湯青萍等［27］在海南文昌雞的研究中得到一致結(jié)果，ESR基因多態(tài)與產(chǎn)蛋性狀中的300日齡產(chǎn)蛋數(shù)顯著相關(guān)，與平均連產(chǎn)天數(shù)極顯著相關(guān)，與400日齡產(chǎn)蛋數(shù)、雙黃蛋數(shù)相關(guān)性不顯著。以上研究結(jié)果表明，ESR基因存在單核苷酸多態(tài)性，且與畜禽生產(chǎn)性狀密切相關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ESRβ基因外顯子3與開產(chǎn)蛋質(zhì)量顯著相關(guān)；外顯子5各基因型與開產(chǎn)日齡顯著相關(guān)；外顯子7與平均蛋質(zhì)量顯著相關(guān)。表明ESRβ基因?qū)Φ坝煤谟瘗g鶉產(chǎn)蛋性狀有一定作用。但由于試驗(yàn)個(gè)體數(shù)目及統(tǒng)計(jì)時(shí)長(zhǎng)等的局限性，僅僅關(guān)聯(lián)性分析的結(jié)果還不能確定該基因是否可以作為影響鵪鶉產(chǎn)蛋性狀的主效基因或與主效基因緊密連鎖的標(biāo)記基因而起作用，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

4 結(jié) 論

本研究在蛋用黑羽鵪鶉群體中分析ESRβ基因外顯子多態(tài)性與產(chǎn)蛋性能的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)ESRβ基因與鵪鶉產(chǎn)蛋性能有一定的相關(guān)性，但是否可以利用ESRβ基因進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇，還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

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（責(zé)任編輯 晉大鵬）

中圖分類號(hào)：S813.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1671－7236（2016）12－3293－07

doi：10.16431／j.cnki.1671－7236.2016.12.031

收稿日期：2016－05－18

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（31301940）；河南科技大學(xué)研究訓(xùn)練計(jì)劃（SRTP）項(xiàng)目（2009100）

作者簡(jiǎn)介：謝三磊（1987－），男，河南許昌人，學(xué)士，研究方向：獸藥殘留的快速檢測(cè)，E－mail：xiesanlei＠163.com

通信作者：＊文鳳云（1979－），女，陜西咸陽人，博士，講師，研究方向：動(dòng)物生物化學(xué)與分子生物學(xué)，Tel：0379－64282341；E－mail：newwfyun＠163.com

Single Nucleotide Polymorphisms inESRβGene of Black Plumage Quail and Its Association with Egg Production

XIE San－lei，WEN Feng－yun＊，LI Jun－qiang，WANG Qing，LIANG Yu，LIU Yi－ting，LI Lei，CHEN Yi
（CollegeofAnimalScienceandTechnology，HenanUniversityof ScienceandTechnology，Luoyang471003，China）

Abstract：This study aimed to investigate the correlation betweenESRβgene exon polymorphism and egg production of Black plumage egg quail，and provide the theoretical foundation for molecular selection.The healthy Black plumage egg quail were selected as research object，and the egg production were analyzed using SPSS 13.0software.Estrogen receptorβ（ESRβ）subunit gene was selected as candidates gene to screen the genomic variation by PCR－SSCP，and the association of theESRβgene polymorphisms with egg production were analyzed.The results of polymorphisms detection showed that exon 1，exon 3，exon 4，exon 5，exon 6，exon 7and exon 8ofESRβ gene all had nucleotide variation.The association analysis results ofESRβgene exons and egg production showed that the egg weight of first laying of exon 3CD genotype were significantly higher than that of CC and DD genotypes（P＜0.05）.The age at first laying of exon 5was also significant difference between DD and CC，CD genotypes（P＜0.05）.Moreover，the average egg weight of exon 7CD genotype was significant higher than that of CC and DD genotypes（P＜0.05）.These data suggested thatESRβgene could significantly affect egg production of Black plumage egg.

Key words：quail；ESRβgene；exon；SNPs；egg production