黃勛和，張金楓，陳潔波，葉偉慶，李威娜，鐘福生，杜炳旺＊

（1.嘉應(yīng)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，梅州514015；2.廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湛江524088）

貴妃雞MHC－B區(qū)域微衛(wèi)星位點LEI0258遺傳多樣性研究

黃勛和1，張金楓1，陳潔波1，葉偉慶2，李威娜1，鐘福生1，杜炳旺2＊

（1.嘉應(yīng)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，梅州514015；2.廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湛江524088）

摘 要：為研究貴妃雞的遺傳多樣性，試驗應(yīng)用主要組織相容性復(fù)合體B區(qū)域（MHC－B）復(fù)合微衛(wèi)星位點LEI0258測定了貴妃雞的等位基因信息，結(jié)合已發(fā)表的序列，進行等位基因與核苷酸多態(tài)性、單倍型中介網(wǎng)絡(luò)圖分析。40份樣品中共檢測到9個等位基因，長度為193～297bp，其中5個為貴妃雞特有。觀察雜合度（Ho）、期望雜合度（He）和多態(tài)信息含量（PIC）分別為0.625、0.716和0.666。3個等位基因與6種已知MHC血清型相匹配?；趥?cè)翼區(qū)變異信息的中介網(wǎng)絡(luò)圖將等位基因分為5個進化枝，貴妃雞9個等位基因分布于A和B進化枝中，這2個進化枝同樣存在于紅原雞中。研究結(jié)果表明貴妃雞保持著中等偏上的遺傳多樣性水平，可能起源于紅原雞。

關(guān)鍵詞：貴妃雞；多態(tài)性；主要組織相容性復(fù)合體；微衛(wèi)星位點LEI0258；進化；血清型

貴妃雞，又稱貴婦雞，原產(chǎn)于法國烏當(dāng)，分布于法國、英國、荷蘭等歐洲國家，因其頭頂華麗毛冠和肉質(zhì)鮮美聞名全球，是著名的觀賞與肉用珍禽。貴妃雞于20世紀90年代引入中國，21世紀初廣東海洋大學(xué)家禽育種中心率先對其進行了系統(tǒng)的研究和品種選育，成功選育出了國內(nèi)第一個飼養(yǎng)的商用配套系。在貴妃雞的基礎(chǔ)研究中，主要集中在生物學(xué)特性［1－4］、品種選育［5－7］、飼養(yǎng)技術(shù)與效果［8－11］等。在遺傳多樣性方面，線粒體控制區(qū)和細胞色素b序列分析提示貴妃雞起源于紅原雞［12－13］。

雞主要組織相容性復(fù)合體B區(qū)域（major histocompatibility complex B region，MHC－B）定位于16號染色體上，與宿主許多傳染性疾?。ㄈ珩R可氏?。┑目剐曰蛞赘行杂嘘P(guān)［14－15］。傳統(tǒng)方法常采用通過B區(qū)血清反應(yīng)對MHC進行血清型鑒定［16－17］，但受限于血清型的鑒定來源［18］，該方法在其他品種中的應(yīng)用有限，不同研究也難以進行平行比較［19］。微衛(wèi)星位點LEI0258定位于MHC－B［20］，并與其血清型有很好的對應(yīng)關(guān)系［21］，因而獲得了廣泛的關(guān)注，前人對此微位星位點進行了大量研究［19，22－24］。本研究利用微衛(wèi)星位點LEI0258分析貴妃雞的遺傳多樣性與進化，探討LEI0258等位基因與MHC血清型的對應(yīng)關(guān)系，為貴妃雞保種選育和飼養(yǎng)管理提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

40只貴妃雞血液樣品來自廣東海洋大學(xué)家禽育種中心。肱靜脈取血0.5～1.0mL放入預(yù)先添加1mL 95%乙醇的2mL離心管中，－80℃保存。

1.2主要試劑及儀器

基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購自廣州美基生物技術(shù)有限公司；PCR試劑、DNA Marker均購自寶生物工程（大連）有限公司。PCR擴增儀、凝膠成像系統(tǒng)、電泳儀和電泳槽均購自Bio－Rad公司；冷凍高速離心機購自Eppendorf公司。

1.3引物設(shè)計與合成

參考McConnell等［20］方法設(shè)計引物，微衛(wèi)星位點LEI0258擴增引物序列為：LEI0258F：5′－CACGCAGCAGAACTTGGTAAGG－3′；LEI0258R：5′－AGCTGTGCTCAGTCCTCAGTGC－3′，正向引物5′端加上熒光標(biāo)記FAM。引物由廣州艾基生物技術(shù)有限公司合成。

1.4PCR擴增、基因分型與測序

PCR反應(yīng)體系20μL：10×PCR Buffer 2μL，dNTP Mixture（2.5mmol／L）1.6μL，正、反向引物（20μmol／L）各2μL，TaqDNA聚合酶（5U／μL）0.2μL，DNA模板（50～100ng）1μL，滅菌雙蒸水補足20μL。PCR擴增程序：94℃預(yù)變性4min；94℃變性30s，65℃退火1min，72℃延伸1min，35個循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送往無錫翼和應(yīng)用生物技術(shù)有限公司采用ABI 3730分析儀進行基因型判定。基于毛細管凝膠電泳的基因分型結(jié)果，挑選貴妃雞不同的等位基因進行DNA測序。每個等位基因挑選2～3個樣品直接進行雙向測序（廣州艾基生物技術(shù)有限公司）。

1.5數(shù)據(jù)分析

等位基因數(shù)（Na）、觀察雜合度（observed heterozygosity，Ho）、期望雜合度（expected heterozygosity，He）和多態(tài)信息含量（polymorphic information content，PIC）由Cervus 3.0.3［25］軟件測定。DNA序列由BioEdit 7.2.5［26］軟件編輯處理，并輔以人工校驗。在NCBI（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／nuccore／）中下載已發(fā)表的LEI0258序列，并根據(jù)前人研究報道確定不同等位基因的家雞品種／原雞［19，21，24］。根據(jù)已發(fā)表的LEI0258等位基因與血清型的對應(yīng)關(guān)系確定貴妃雞的血清。序列比對采用Mega 6.0［27］進行，使用軟件SplitsTree 4.10構(gòu)建基于LEI0258側(cè)翼序列的中介網(wǎng)絡(luò)圖（medianjoining network）［28］。

2 結(jié)果與分析

2.1LEI0258PCR及基因分型結(jié)果

PCR產(chǎn)物進行2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖1A。由圖1A可知，目標(biāo)條帶清晰，片段長度為190～300bp左右，符合微衛(wèi)星LEI0258的特征。LEI0258正向引物加上5′FAM熒光標(biāo)記后，PCR產(chǎn)物在自動毛細管凝膠電泳檢測中顯示出很好分型效果（圖1B）。

圖1　LEI0258PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖（A）和基因分型圖（B）Fig.1 Gel electrophoretogram（A）and genotyping（B）of LEI0258PCR products

2.2LEI0258等位基因多態(tài)性

40份貴妃雞樣品經(jīng)基因分型共檢測到8個等位基因，片段大小為193～300bp（表1）。等位基因275頻率最高（0.45），其次是251（0.23）和242（0.19），205和298最低（0.01）。貴妃雞保持著中等偏上的遺傳多樣性，觀察雜合度、期望雜合度和多態(tài)信息含量均高于0.5，分別為0.625、0.716和0.666。

表1　貴妃雞微衛(wèi)星位點LEI0258等位基因信息Table 1 Information of microsatellite LEI0258alleles in royal chicken

2.3LEI0258核苷酸多態(tài)性

挑選28個片段進行DNA雙向測序，獲得9個等位基因，片段長度范圍為193～297bp（表2）。通過毛細管電泳分型的等位基因193和205與測序結(jié)果大小相一致，其余均小于測序結(jié)果。LEI0258由2個重復(fù)單元R13（CTATGTCTTCTTT）和R12（CTTTCCTTCTTT）組成，重復(fù)次數(shù)分別為1和3～11。重復(fù)區(qū)上游有77bp（包括引物序列），下游76bp。上游發(fā)現(xiàn)2個變異位點，分別是等位基因295在－29－30缺失堿基“TT”，等位基因241在－38－39的“CC”替換原“TT”。下游發(fā)現(xiàn)4個變異位點，轉(zhuǎn)換和顛換各出現(xiàn)1次，等位基因193、205和241在11—18位置缺失“ATTTTGAG”。與常規(guī)微衛(wèi)星位點等位基因的定義不同，LEI0258結(jié)合了片段大小和側(cè)翼區(qū)的變異信息，因此出現(xiàn)了片段大小相同但等位基因不同的情況，如249和273。在貴妃雞的9個等位基因中，有5個為首次發(fā)現(xiàn)。3個等位基因找到6種對應(yīng)的血清型，分別是B5、B11、B13、B15.1、B27和B61。

2.4LEI0258側(cè)翼區(qū)序列分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫下載已發(fā)表的微衛(wèi)星位點LEI0258序列，去除相同的序列，然后去除LEI0258的重復(fù)區(qū)序列，基于側(cè)翼區(qū)變異信息構(gòu)建包括貴妃雞在內(nèi)的中介網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果見圖2。由圖2可知，94條LEI0258共分為5個進化枝，每個進化枝含8～35條序列。貴妃雞9個等位基因分布于進化枝A和B中，2個249等位基因分布于不同的進化枝（A和B）。紅原雞分布于進化枝A、B和E中，其他地方雞品種分布于A、B、C、D和E中。

表2　貴妃雞微衛(wèi)星LEI0258位點等位基因多態(tài)性Table 2 Polymorphisms of the microsatellite LEI0258alleles in royal chicken

圖2　基于LEI0258側(cè)翼區(qū)變異信息的中介網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Median－joining network of LEI0258alleles based on variation of the flanking regions

3 討 論

本研究利用微衛(wèi)星位點LEI0258分析了貴妃雞群體的遺傳多樣性。結(jié)果表明，盡管經(jīng)歷了多年系統(tǒng)的品種選育，貴妃雞仍保持著中等偏上的遺傳多樣性水平。與地方雞相比，如會寧雞、靜寧雞，貴妃雞的遺傳變異性明顯較低，但與明勤雞基本持平。然而，與商品雞相比，貴妃雞遺傳多樣性高于洛島紅雞而低于安卡紅雞和海蘭褐雞［29］?？傮w而言，地方雞品種的遺傳多樣性高于商品雞。研究表明，MHC遺傳多樣性豐度、重要生產(chǎn)指標(biāo)與繁殖性能（如體重、蛋重、產(chǎn)蛋強度和性成熟體重等）呈顯著正相關(guān)［30］。因此，后期的品種培育應(yīng)注意親代來源的多樣化，減少親緣關(guān)系較近的個體作為親本的情況，以提高貴妃雞群體的遺傳多樣性水平，達到提高生產(chǎn)水平和繁殖性能的目的。

在40個貴妃雞個體中，共檢測到9個LEI0258等位基因，其中5個為貴妃雞特有。貴妃雞LEI0258等位基因符合其基本特征，如下游位置的“ATTTTGAG”缺失現(xiàn)象［23－24］，但與Fulton等［21］報道的“ATTTGAGG”有所不同。根據(jù)已發(fā)表的序列，94條LEI0258序列分化為5條差異顯著的進化枝。貴妃雞分布于進化枝A和B中，這兩個進化枝同樣有紅原雞的等位基因分布［19，24］，提示貴妃雞可能起源于紅原雞，與前人研究結(jié)論相一致［12－13］。但需要注意的是，由于微衛(wèi)星位點LEI0258等位基因的界定同時包含重復(fù)單元次數(shù)和側(cè)翼區(qū)的變異信息［31－32］，因而基于側(cè)翼區(qū)變異信息構(gòu)建的中介網(wǎng)絡(luò)圖可能更多地反映了等位基因之間的關(guān)系，而非系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系［19］。因此，貴妃雞的起源還需進一步研究。

LEI0258等位基因與雞MHC血清型類型存在較強的關(guān)聯(lián)性，因而可以通過研究LEI0258來對雞MHC血清型進行分型［21］。在9個貴妃雞等位基因中，其中3個找到6個相對應(yīng)的血清型，而剩余6個等位基因未找到匹配的血清型。研究表明雞的抗病能力往往與MHC血清型類型的豐富程度呈正相關(guān)［19，33－34］。因此，將來需要開展貴妃雞MHC血清型鑒定工作以及血清型與抗病能力的對應(yīng)關(guān)系研究，從而為貴妃雞抗病研究和品種選育提供科學(xué)理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

本試驗在40份貴妃雞血液樣品中共檢測到9個等位基因，其中5個為貴妃雞特有，3個等位基因與6種已知MHC血清型相匹配?；趥?cè)翼區(qū)變異信息的中介網(wǎng)絡(luò)圖將等位基因分為5個進化枝，貴妃雞9個等位基因分布于A和B進化枝中，這2個進化枝同樣存在于紅原雞中，貴妃雞保持著中等偏上的遺傳多樣性水平，可能起源于紅原雞。

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（責(zé)任編輯 姚倩倩）

中圖分類號：S831.2

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1671－7236（2016）12－3300－06

doi：10.16431／j.cnki.1671－7236.2016.12.032

收稿日期：2016－04－13

基金項目：廣東省自然科學(xué)基金項目（2014A030307018）；嘉應(yīng)學(xué)院"創(chuàng)新強校工程"項目（CQX019）；廣東省科技計劃項目（2015A020208020、2016A030303068）；國家科技基礎(chǔ)條件平臺－特種動物子平臺建設(shè)子課題（201520）；嘉應(yīng)學(xué)院重點科技計劃項目（2015KJM03）

作者簡介：黃勛和（1982－），男，廣東河源人，博士，講師，研究方向：中國家雞遺傳多樣性與進化，E－mail：hxh826＠jyu.edu.cn

通信作者：＊杜炳旺（1954－），男，山西運城人，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：家禽育種與生產(chǎn)，E－mail：dudu903＠163.com

Genetic Diversity of Microsatellite LEI0258in MHC－B Region of Royal Chicken

HUANG Xun－h(huán)e1，ZHANG Jin－feng1，CHEN Jie－bo1，YE Wei－qing2，LI Wei－na1，ZHONG Fu－sheng1，DU Bing－wang2＊
（1.SchoolofLifeSciences，JiayingUniversity，Meizhou514015，China；2.CollegeofAgricultural，GuangdongOceanUniversity，Zhanjiang524088，China）

Abstract：The aim of this study was to evaluate the polymorphism and evolution in royal chicken using the tandem repeat microsatellite LEI0258located within the chicken major histocompatibility complex B region（MHC－B）.Genomic DNA was extracted from forty blood samples of royal chicken and used to be genotyped and sequenced.Combining the published sequences，the analysis of allele and nucleotide polymorphism and median－joining network were carried out.A total of nine alleles ranging from 193to 297bp in 40samples were found，five of which was novel for royal chicken.The observed heterozygosity，expected heterozygosity and polymorphic information content were 0.625，0.716and 0.666，respectively.Three alleles were corresponding to six available serotypes.Alleles were classified into five clusters，based on the SNPs and indels found within the sequences flanking the repeats.The alleles of royal chicken existed in clades A and B，both of which were also found in Red junglefowl.The results suggested that royal chicken had a middle or high level of genetic diversity in microsatellite LEI0258，and that might originate from Red junglefowl.

Key words：royal chicken；polymorphism；major histocompatibility complex；microsatellite LEI0258；evolution；serotype