（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，農(nóng)業(yè)部食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（楊凌），陜西楊凌712100）

QuEChERS-HPLC-MS/MS法檢測液態(tài)乳中9種β2-受體激動劑殘留量

李婧妍，郭春鋒，崔立輝，劉拉平

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，農(nóng)業(yè)部食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（楊凌），陜西楊凌712100）

建立了QuEChERS-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時檢測液態(tài)乳中9種β2-受體激動劑藥物殘留量方法。樣品以乙腈、EDTA-Mcllvaine緩沖液和三氯乙酸為提取試劑、NaCl為吸水劑，PSA為吸附劑進行凈化。用Shim-pack XR-ODS(3.0mmi.d× 75mm)色譜柱分離，以乙腈溶液和0.1%甲酸水溶液為流動相進行梯度洗脫，電噴霧正離子模式(ESI+)電離，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式檢測。結(jié)果表明，樣品經(jīng)QuEChERS處理后，9種β2-受體激動劑在1.0～200 μg/kg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r2）大于0.991，檢出限（LOD）范圍為0.03～0.13 μg/kg，定量限（LOQ）范圍在0.1～0.4 μg/kg之間?；厥章式橛?8.2%～96.0%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏（RSD）均低于13.7%之間。

液態(tài)乳；β2-受體激動劑藥物殘留量；QuEChERS；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

0 引言

β2-受體激動劑是一類乳制品中經(jīng)常能夠檢出的獸藥之一，具有促進動物體內(nèi)脂肪分解和提高瘦肉率等功效[1]。目前，檢測-受體激動劑的方法有GC-MS[2]、HPLC-MS/MS[3]、ELISA[4]和HPLC[5-7]。我國和國際上常用的β2-受體激動劑確證方法為HPLC-MS/MS法，但該方法前處理環(huán)節(jié)存在有機溶劑消耗量大、操作復(fù)雜等缺陷。因此，需建立高通量、高靈敏度、簡單快速的針對液態(tài)乳中β2-受體激動劑殘留的專項方法。

QuEChERS提取方法在獸藥殘留檢測方面得到廣泛引用[8]。利用該方法，研究人員已有效提取液態(tài)乳中固醇類激素[9]和β2-內(nèi)酰胺類[10]殘留，但關(guān)于提取β2-受體激動劑的方法還未見報道。因此本研究用QuEChERS方法進行前處理，HPLC-MS/MS法檢測液態(tài)乳中的β2-受體激動劑類獸藥殘留量。

1 實驗

1.1儀器

高效液相色譜儀（島津LC-2010A）-串聯(lián)質(zhì)譜儀（AB 4000 QTRAR），配有電噴霧（ESI）離子源；渦旋混合器（KQ-250DE）；高速冷凍離心機；十萬分之一分析天平；氮吹水浴濃縮儀（DCY-III）。

1.2標(biāo)準(zhǔn)品和試劑

克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺、特布他林標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%）；西馬特羅、非諾特羅、氯丙那林、妥布特羅、噴布特羅標(biāo)準(zhǔn)品（純度純度≥99%）。C18、PSA、NH2和中性氧化鋁吸附劑購自天津博納艾杰爾公司。乙腈、甲醇為色譜純；其他試驗用試劑均為分析純；試驗所用液態(tài)乳。實驗室用水為去離子水。

1.3色譜條件

色譜柱為 Shim-pack XR-ODS(3.0mmi.d× 75mm)；流動相A為0.1%（體積分數(shù)）甲酸水，流動相B為0.1%甲酸乙腈。梯度洗過程序：0 ～1.5 min，流動相B為90%（體積分數(shù)）；1.5 ～9 min，流動相B由90%降至5%；9 ～11 min，流動相B由5%升至90%；11.1 ～15 min，B為90%。流速為0.3 mL/min；進樣量10 μL。ESI源正離子掃描；動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測。

1.4標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精確稱取各種標(biāo)準(zhǔn)10.0 mg，分別置于100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即為質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。吸取上述溶液各1 mL加入到100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中間貯備液。吸取中間貯備液1 mL，用甲醇定容至100 mL，即為9種β2-受體激動劑質(zhì)量濃度為10 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.5樣品前處理方法

稱取樣品2 g液態(tài)乳樣品置于50 mL離心管中，加入2 mL濃度為0.1 mol/L的EDTA-Mcllvaine緩沖液、8 mL乙腈溶液和1 mL三氯乙酸，渦旋混合2 min，以10 000 r/min離心5 min。將上清液移入另一50 mL離心管中，加入6 g的Na2SO4，渦旋混合2 min，以10 000 r/min離心5 min。吸取2 mL提取液，加入50 mg PSA吸附劑，渦旋混合2 min，4 000 r/min離心5 min。移取上清液至10 mL離心管中，氮氣吹干，加入1 mL體積比為10∶90的甲醇-0.1%甲酸水溶液溶解殘渣，用0.45 μm再生纖維素膜過濾至樣品瓶中。

1.6基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

以空白樣品提取液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋液，配置質(zhì)量分數(shù)分別為1.0，2.5，5.0，10，20，50，100，200，300 μg/kg的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。以各組分進樣濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制線性關(guān)系圖，制作回歸方程。以3倍和10倍信噪比（S/N）考察9種β2-受體激動劑的檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。

1.7方法回收率及檢出限

稱取陰性待測樣品2 g，加入適量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配置成加標(biāo)量分別為50，100和200 ng/g三個梯度的加標(biāo)樣品，依據(jù)優(yōu)化的樣品前處理方法和色譜條件進行測定，每個濃度平行測定6份樣品，計算日內(nèi)和日間回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

2 結(jié)果與分析

2.1儀器條件優(yōu)化

2.1.1 色譜條件優(yōu)化

在分析本研究涉及的9種β2-受體激動劑時，研究人員多采用C18色譜柱進行分析[11-12]。因此本試驗選用性能較好的Shim-pack XR-ODS(3.0 mmi.d×75 mm)色譜柱。流動相的使用對目標(biāo)分析物的影響較大，相關(guān)研究中所用流動相多為水相和有機相的混合物，其中有機相為甲醇或乙腈，水相則為低濃度的甲酸水溶液，并執(zhí)行梯度洗脫程序。本研究在確定色譜柱后對比了水-甲醇、水-乙腈、0.1%甲酸水-甲醇、0.1%甲酸水-乙腈、水-0.1%甲酸甲醇、水-0.1%甲酸乙腈、0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇和0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈組成的流動相的分析效果。結(jié)果表明，0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈作為流動相時保留時間和分離效果相對較好，通過改變不同時間段水相和有機相比例，反復(fù)試驗后確定最佳梯度洗脫條件為：0 ～1.5 min，流動相B的體積分數(shù)為90%；1.5 ～9 min，B由90%降至5%；9 ～11 min，B由5%升至90%；11.1 ～15 min，B為90%。

2.1.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

ESI+模式下分別對1 mg/L 9種β2-受體激動劑的標(biāo)準(zhǔn)溶液進行一級質(zhì)譜掃描分析，得到每種成分的母離子，對其進行全掃描確定子離子。以MRM模式進行監(jiān)測，優(yōu)化每種β2-受體激動劑的母離子和子離子所需最佳碰撞能量（DP）和最佳錐孔電壓（CE），得到優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

表1 9種β-受體激動劑的質(zhì)譜優(yōu)化條件

2.2提取條件優(yōu)化

β2-受體激動劑屬于強極性的化合物，含有胺類結(jié)構(gòu)，部分還有1，2苯二酚（兒茶酚）等功能團［13］。該類藥物的提取劑以甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯和二氯甲烷為主。由于液態(tài)乳中富含蛋白和脂質(zhì)成分，且研究指出，乙腈具有良好的沉淀蛋白能力［14-15］，因此本研究以乙腈為提取劑進行試驗。比較了三氯乙酸、乙酸、氨水和EDTA-Mcllvaine緩沖液對提取效果的影響，結(jié)果表明EDTA-Mcllvaine緩沖液和三氯乙酸可提高乙腈的提取效果（圖1）。EDTA為金屬離子配合劑，可競爭配合β2-受體激動劑母核結(jié)構(gòu)中的金屬離子，使目標(biāo)化合物游離出來。三氯乙酸是熊林等人針對傳統(tǒng)酶法提取β2-受體激動劑改進的水解方法，避免了酶解耗時長、提取效果不穩(wěn)定以及回收率偏低等缺點[4]。將EDTA和三氯乙酸同時添加到乙腈中，可將提取效果提高大約10%左右（圖2）。因此本研究用2 mL的EDTA、8 mL乙腈和1 mL三氯乙酸作為提取劑進行后續(xù)試驗。

圖1 不同物質(zhì)對9種β2-受體激動劑回收率的影響

圖2 EDTA-Mcllvaine和三氯乙酸對9種β2-受體激動劑回收率的影響

2.3脫水劑的優(yōu)化

NaCl、MgSO4和Na2SO4是常用的脫水劑，液態(tài)乳中水分含量較高，因此分別用6 g NaCl，MgSO4，Na2SO4對上清液除水（圖3）。結(jié)果表明，MgSO4作為脫水劑時回收率較低，這可能與目標(biāo)物易與Mg2+形成螯合物有關(guān)。NaCl的效果最好，但提高用量后提取效果下降，其原因可能是部分目標(biāo)物進入到水相中。

圖3 脫水劑對9種β2-受體激動劑回收率的影響

2.4凈化條件優(yōu)化

液態(tài)乳經(jīng)酸化乙腈和EDTA-Mcllvaine緩沖液提取后，已清除了蛋白質(zhì)和大部分干擾物。為進一步提高凈化效率，采用分散固相萃取法凈化手段對樣品進行處理。本研究選取C18，NH2，PSA比較其凈化效果。結(jié)果表明，在相同用量下（100 mg），PSA作為凈化劑的效果最好（圖4）。三種填料均以硅膠為基質(zhì)，分別鍵合C18、氨丙基和N-丙基乙二胺。PSA可有效去除提取液中的脂類和糖類物質(zhì)，并且對β2-受體激動劑無顯著吸附。液態(tài)乳中乳糖和乳脂肪含量較高，這可能是PSA具有較好凈化作用的主要原因。

圖4 凈化劑對9種β2-受體激動劑藥物回收率的影響

2.5基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍和檢出限及定量限

在質(zhì)譜分析中，浸提物共流出組分對電噴霧離子化效果和檢測信號有增強作用。為消除基質(zhì)效應(yīng)對β2-受體激動劑測定的影響，以經(jīng)驗證不含有9種β2-受體激動劑藥物的空白液態(tài)乳提取液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋液，采用優(yōu)化后的前處理方法，制作基質(zhì)加標(biāo)工作曲線，得到線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)r2在0.991 ～0.998之間，線性范圍為1.0～200 μg/kg。說明9種藥物在該質(zhì)量分數(shù)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。以定量離子信噪比（S/N）大于3為樣品的檢出限（LOD），以S/N大于10為定量限（LOQ），得到9種β2-受體激動劑的LOD為0.03 ～0.13 μg/kg，LOQ為0.1 ～0.4 μg/kg（見表2）。

2.6方法的回收率和精密度

采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，在空白液態(tài)乳樣品中分別添加3個水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進行回收率試驗，每個添加水平依據(jù)本實驗方法做6次平行測定，得到每個β-受體激動劑殘留量的平均回收率為78.2～96.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.7～13.7%，符合獸藥殘留檢測相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的要求。

3 結(jié)論

本文結(jié)合液態(tài)乳基質(zhì)特性和β2-受體激動劑類獸藥的理化性質(zhì)，展開了QuEChERS–液相色譜法質(zhì)譜法測定液態(tài)乳中9種β2-受體激動劑藥殘留的分析方法研究。對液態(tài)乳中9種β2-受體激動劑獸藥殘留的提取、鹽析和凈化過程中的各種影響因素進行了評價與優(yōu)化，提高了提取方法效率。該方法前處理方法快速、簡潔，定量方法準(zhǔn)確，成本較低，能夠滿足對液態(tài)乳樣品中β2-受體激動劑獸藥殘留的快速檢測，也適用于大量篩查β-受體激動劑殘留。

表2 9種β2-受體激動劑的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)（r2）、檢出限（LOQ）和定量限（LOD）

表3 9種β2-受體激動劑的回收率和RSD

[1]JUAN C,IGUALADA C,MORAGUES F,et al.Development and validation of a liquid chromatography tandem mass spectrometry meth?od for the analysis ofβ-agonists in animal feed and drinking water[J]. J Chromatogr A,2010,1217:6061-6068.

[2]王培龍，范理，蘇曉鷗，等．分子印跡固相萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法測定豬尿中4種β-受體激動劑[J].分析化學(xué)，2012，40（3）：470-473.

[3]苗虹，鄒建宏，范賽，等．高效液相色譜-離子阱質(zhì)譜法測定尿液中β2-受體激動劑及β-受體阻斷劑[J].譜，2010，28（6）：572-578.

[4]熊琳，李維紅，高雅琴，等．肉品中β-受體激動劑類藥物殘留檢測技術(shù)研究進展食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報[J].2015，6（2）：528-533.

[5]BLOMGREN A,BERGGREN C, HOLMBERG A.Extraction of clen?buterol from calf urine using a mo?lecularly imprinted polymer fol?lowed by quantitation by high-per?formance liquid chromatography with UV detection[J].Chromatog?raphy A,2002,975:157-164.

[6]吳平谷，王強，陳慧華，等.同時檢測動物肌肉中26種β2-興奮劑和激素殘留[J].分析化學(xué)，2008，36（11）：1476-1482.

[7]王煉，黎源倩.高效液相色譜法測定動物性食品中4種β2-興奮劑[J].中國衛(wèi)生檢志，2008，18（7）:1227-1230.

[8]ANASTASSIADES M,LEHOTAY S J,STAJNBAHER D,et al.Fast and easy multiresidue method employing acetonitrile extraction/parti?tioning and dispersive solid-phase extraction for the determination of pesticide residues in produce[J].Journal of Aoac International,2003,86 (2):412-431.

[9]李寧，林濤，邵金良，等.基質(zhì)固相分散－超高效液相色譜－質(zhì)譜檢測器測定牛奶中9種類固醇激素殘留[J].色譜，2015，33（11）：1163-1168.

[10]鄭小平，孟 瑾，何亞斌，等.QuEChERS-UPLC-MS/MS法同時測定羊奶中8種β-內(nèi)酰胺類抗生素[J].食品與機械，2015，31（3）：66-69.

[11]黎娟，喬慶東，莊景新，等.改進的高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜方法同時測定動物性食品中4種β2-受體激動劑殘留[J].色譜，2016，34（2）：170-175.

[12]蔡英華，薛毅，張，等.UPLC-MS/MS法測定動物源性食品中4個四環(huán)素類藥物和10個β受體激動劑類藥物殘留[J].藥物分析雜志，2014，34（7）：1 223-1 230.

[13]羅輝泰，黃曉蘭，吳惠勤，等.分散固相萃取－同位素稀釋－高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定豬肉中26種β-受體激動劑[J].色譜，2016，34（5）：481-489.

[14]孫雷，張驪，汪霞，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對動物源性食品中13種β-內(nèi)酰胺類藥物殘留的檢測[J].分析測試學(xué)報，2009，285：576-580.

[15]郭萌萌，李兆新，譚志軍，等.分散固相萃取/液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中的8種青霉素殘留[J].分析測試學(xué)報，2011，30（9）：969-975.

Determination of 9β2-agonist drug residues by high performance liquid chro?matography-tandem mass spectrometry with QuEChERS in milk

LI Jing-yan,GUO Chun-feng,CUI Li-hui,LIU La-ping
（College of Food Science and Engineering，Northwest A&F University，F(xiàn)ood Quality Supervision and Inspection Test?ing Center（Yangling），Ministry of Agriculture，Yangling 712100，China）

A method was developed for simultaneous determination ofβ2-agonist drug residues in milk by QuEChERS-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS).The milk was extracted with acetonitrile,EDTA-Mcllvaine and tri?chloroacetic,dehydrated with NaCl,purified with PSA sorbent and separated by Shim-pack XR-ODS(3.0mmi.d×75mm)column using acetonitrile and water(containing 0.1%formic acid)as mobile phase.The mass spectrometric acquisitions were carried out by means of multi?ple reaction monitoring(MRM)in positive ionization mode.The linear relation of 9β2-agonist drug was good and the correlation coeffi?cient was more than 0.991.The limit of detection(LOD)of 9β2-agonist drugs was 0.03～0.13 μg/kg and the limit of quantification(LOQ) was 0.1～0.4 μg/kg.The recovery rates of the target analyte were between 78.2%～96.0%.The relative standard deviations(RSD)were less than 13.7%.The method was reliable for the determination ofβ2-agonist drug inmilk.

milk;β2-agonist drug residues;QuEChERS;HPLC-MS/MS

TS252.7

A

1001-2230（2016）11-0049-04

2016-06-22

李婧妍（1980-）女，實驗師，從事食品和農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥和獸藥殘留檢測工作。

劉拉平