劉秀清1，姜金斗，陶大利

(1.黑龍江省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)所，哈爾濱150088；2.農(nóng)業(yè)部乳品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，哈爾濱150090）

超濾濃縮-HPLC法測(cè)定乳中乳鐵蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)及功能性評(píng)價(jià)

劉秀清1，姜金斗2，陶大利2

(1.黑龍江省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)所，哈爾濱150088；2.農(nóng)業(yè)部乳品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，哈爾濱150090）

建立了超濾濃縮-高效液相色譜法測(cè)定乳中乳鐵蛋白的方法。該方法樣品處理為樣品用磷酸鹽緩沖液稀釋后，樣液先通過(guò)肝素免疫親和柱凈化、磷酸氫二鈉-氯化鈉溶液洗脫，然后采用超濾濃縮后直接測(cè)定。采用紫外檢測(cè)器檢測(cè)。本方法檢出限為0.01 mg/100 g。該法具有樣品處理簡(jiǎn)單方便，靈敏度高，重現(xiàn)性好，分析時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。該方法測(cè)定的為具有活性功能的乳鐵蛋白含量，解決了乳鐵蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低的生乳及各類液態(tài)乳只采用肝素親和柱凈化后測(cè)定靈敏度不能滿足測(cè)定要求的問(wèn)題，對(duì)評(píng)價(jià)乳的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值提供準(zhǔn)確數(shù)據(jù)。

超濾濃縮；乳；乳鐵蛋白；高效液相色譜

0 引言

乳鐵蛋白（Lf）是乳中特有的功能性成分，主要功能有促進(jìn)鐵吸收、抗菌、提高免疫力[1]等。常乳中平均質(zhì)量濃度是0.3 mg/mL左右[2]。由于乳中的乳鐵蛋白一旦變性將失去活性，其相應(yīng)的功能大幅降低。所以對(duì)深度受熱加工的乳品而言，其功能性將大打折扣。目前測(cè)定乳鐵蛋白測(cè)定方法時(shí)有報(bào)道，主要有高效毛細(xì)管電泳法、酶聯(lián)免疫法、液相色譜法、SDS-PAGE法等[2-8]。除酶聯(lián)免疫法外，大都測(cè)定的為乳鐵蛋白總量，特別是只采用肝素親和柱凈化-液相色譜測(cè)定的方法其檢出限（0.6 mg/100g）不能滿足乳中乳鐵蛋白檢測(cè)的要求。本研究是在免疫親和柱凈化后的基礎(chǔ)上，結(jié)合超濾去除大部分水分達(dá)到濃縮的目的，其靈敏度可較其他方法提高10倍以上，從而滿足了非添加、低質(zhì)量分?jǐn)?shù)非變性乳鐵蛋白的定量測(cè)定，對(duì)評(píng)價(jià)乳的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1試劑

甲醇、無(wú)水乙醇為色譜純；三氟乙酸；磷酸氫二鈉溶液(0.20 mol/L)：稱取28.4 g磷酸氫二鈉，加800 mL水溶解，用磷酸調(diào)pH值至8.00±0.5，加水定容至1 000 mL；磷酸氫二鈉-氯化鈉溶液：稱取7.10 g磷酸氫二鈉，58.4 g氯化鈉，加適量水溶解，用磷酸調(diào)pH值至8.00± 0.5，加水定容至1 000 mL；乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品(純度大于98%)。

1.2儀器及材料

Waters 2695高效液相色譜、2489紫外檢測(cè)器；冷凍離心機(jī)轉(zhuǎn)速≥10 000 r/min；固相萃取裝置；肝素親和柱（1mL）：于4℃冰箱內(nèi)儲(chǔ)存；離心式超濾管：截留分子量10 ku和30 ku；0.45 μm微孔水相濾膜。

1.3色譜條件

色譜柱：C4，5 μm，300 ?。（孔徑），250 mm×4.6 mm（內(nèi)徑）；柱溫為30℃；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為50 μL；流動(dòng)相為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%三氟乙酸溶液和乙腈，梯度洗脫。

1.4樣品處理

（1）樣品提取。準(zhǔn)確稱取10 g(精確至0.01 g)試樣于50 mL離心管中，加入10 mL磷酸氫二鈉溶液,渦旋振蕩器振蕩0.5 min，4℃下以8 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min，將上清液轉(zhuǎn)移到另一50 mL離心管中。再加入5 mL磷酸氫二鈉溶液重復(fù)操作一次，合并兩次液體作為樣品提取液備用。

（2）凈化濃縮。肝素親和柱先加入5 mL磷酸氫二鈉溶液平衡，處理完畢后加入樣品提取液，待樣液完全流出后，再用10 mL磷酸氫二鈉溶液淋洗，棄去全部流出液。最后用3.0 mL磷酸氫二鈉-氯化鈉溶液洗脫，全部流出液收集于超濾管中，放于離心機(jī)以4 000 r/min轉(zhuǎn)速離心至1 mL以下，在用磷酸氫二鈉-氯化鈉溶液定容至1 mL。溶液膜過(guò)濾后供液相色譜檢測(cè)分析用。

2 結(jié)果與討論

2.1樣品處理的優(yōu)化

由于乳中蛋白質(zhì)及脂肪含量較高，干擾物質(zhì)較多等，特別是脂肪對(duì)親和柱凈化時(shí)將產(chǎn)生嚴(yán)重干擾，所以需先通過(guò)離心除去脂肪。由于該親和柱對(duì)乳鐵蛋白的專一性吸附較強(qiáng)，而對(duì)其他蛋白（包括乳鐵蛋白在內(nèi)的變性蛋白）無(wú)吸附，所以在樣品前處理中無(wú)需考慮蛋白的影響。另一方面親和柱需在適宜的酸度條件下才可達(dá)到最佳效果，為此在樣品處理中采用樣液與緩沖液1:1即可符合此要求。通過(guò)上述處理后即可直接將樣液通過(guò)肝柱親和柱凈化。

2.2肝素親和柱性能的測(cè)定

該方法應(yīng)首先確保采用為肝素親和柱凈化的效果，為此需對(duì)該親和柱進(jìn)行驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了不同上樣量、不同吸附洗脫的速度測(cè)試，通過(guò)測(cè)定回收率進(jìn)行了最佳凈化條件的考察。首先采用含有0.5 mg的標(biāo)準(zhǔn)乳鐵蛋白溶液按1，2，3，4，5 mL/min吸附、洗脫相同的速度進(jìn)行測(cè)試；在室溫條件下證明當(dāng)流速高于2 mL/min時(shí)其效果顯著下降；當(dāng)超過(guò)4 mL/min時(shí)回收率僅83.3%，說(shuō)明流速過(guò)快對(duì)吸附洗脫效果影響顯著（見(jiàn)表1）。然后選用不同上樣量以2 mL/min的吸附洗脫速度測(cè)試的回收率在96%以上，證明該免疫親和柱性能優(yōu)良（見(jiàn)表2）。

表1 不同吸附洗脫速度對(duì)乳鐵蛋白測(cè)定結(jié)果的影響

表2 肝素親和柱性能驗(yàn)證結(jié)果

2.3超濾管類型的選擇

離心式超濾管的主要作用是將樣液中的水分及較低分子量的物質(zhì)通過(guò)超濾膜大部分被去除，如本研究中樣品洗脫液約為3 mL,通過(guò)超濾膜分離后可濃縮至1 mL,相當(dāng)于又將樣品的檢測(cè)靈敏度提高3倍。從而滿足了低含量乳鐵蛋白樣品的測(cè)定。由于超濾管離心過(guò)濾中會(huì)使一定分子量的物質(zhì)被過(guò)濾掉，若選用靠近乳鐵蛋白約為80 ku分子量的是不可以的，最好選擇目標(biāo)物分子量1/3以下的膜才可確保不損失；同時(shí)考慮到膜過(guò)濾的主要目的是為了去除水分及部分低分子物質(zhì)，若選擇低分子量的膜過(guò)濾其效率就會(huì)大大降低。為此本研究選擇了截留分子量分別為10 ku和30 ku的離心式超濾管進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。其方法是先用配制磷酸氫二鈉-氯化鈉溶液含有質(zhì)量濃度為50 g/mL和120 g/mL的兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取3 mL（濃縮后乳鐵蛋白分別相當(dāng)于150 μg與360）將上述標(biāo)準(zhǔn)溶液移入超濾管中，按1.4.2離心定容后上機(jī)測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3 不同規(guī)格超濾管對(duì)乳鐵蛋白損失率的影響

表3表明：所選兩種規(guī)格的超濾管對(duì)乳鐵蛋白基本無(wú)損失，考慮到過(guò)濾速度30 ku規(guī)格的超濾管優(yōu)于前者，本研究采用該超濾管。

2.4線性范圍與檢出限

在上述的最佳色譜條件下,根據(jù)乳中乳鐵蛋白質(zhì)量濃度范圍及樣品處理方法，配制成乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作液為30，100，200，300，500 μg/mL系列質(zhì)量濃度,采用外標(biāo)峰面積法定量。經(jīng)測(cè)定，在該系列質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,線性回歸方程為y= 0.00051x-3.36(x為峰面積；y為質(zhì)量濃度，μg/mL)，相關(guān)系數(shù)r=0.9998（見(jiàn)圖1）。以本底3倍噪音計(jì)算樣品最低檢出限為0.0 1mg/100mL。

2.5方法的回收率和精密度

分別選取生牛乳與滅菌乳添加乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液后進(jìn)行樣品處理，測(cè)定回收率；用生牛乳與滅菌乳樣品處理液分別進(jìn)樣6次測(cè)定精密度。兩樣品不同添加量回收率在85～96%間，平均為92.7%；生牛乳樣品平均RSD%為2.65，滅菌乳為11.98%，平均RSD%滅菌乳遠(yuǎn)大于生牛乳的原因主要是滅菌乳中非變性乳鐵蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低（在檢出限附近），測(cè)定時(shí)基線干擾所致?；厥章逝c精密度測(cè)定結(jié)果分別如表4和表5所示。

圖1 乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品色譜

圖3 樣品乳鐵蛋白色譜質(zhì)量濃度/（μg·mL-1）

表4 樣品中乳鐵蛋白回收率測(cè)定結(jié)果 μg/100g

表5 樣品乳鐵蛋白精密度測(cè)定結(jié)果

2.6樣品測(cè)定

通過(guò)對(duì)生乳滅菌純牛乳共6個(gè)樣品，采用建立的方法對(duì)乳鐵蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定，證明對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于0.01 mg/100 mL樣品中的非變性乳鐵蛋白可定量測(cè)定，如表6所示。

表6 生乳與滅菌乳中乳鐵蛋白測(cè)定結(jié)果 μg/100g

測(cè)定結(jié)果表明，生乳經(jīng)超高溫滅菌后，乳鐵蛋白的活性幾乎損失殆盡，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)甚至在檢出限以下，其乳的營(yíng)養(yǎng)養(yǎng)價(jià)值大大降低。從而為評(píng)價(jià)乳的功能性提供技術(shù)支持。

3 結(jié)論

（1）本研究建立了乳中乳鐵蛋白的肝素親和柱凈化、超濾濃縮、高效液相色譜測(cè)定方法。該法具有樣品處理簡(jiǎn)單、快速準(zhǔn)確、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。特別是經(jīng)過(guò)超濾濃縮后可滿足低質(zhì)量分?jǐn)?shù)乳中非變性乳鐵蛋白的測(cè)定。為評(píng)價(jià)乳中乳鐵蛋白的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值提供了可靠的技術(shù)。

（2）通過(guò)對(duì)肝素親和柱性能的測(cè)試，吸附洗脫速度應(yīng)控制在2 mL/min以內(nèi)；不同標(biāo)準(zhǔn)濃度乳鐵蛋白回收率在97～99%間，性能可靠。

（3）通過(guò)對(duì)樣品前處理方法的優(yōu)化，確定了采用緩沖液處理、離心脫脂、肝素親和柱凈化及超濾濃縮的方法，無(wú)需沉淀去除蛋白質(zhì)，通過(guò)親和柱凈化與色譜柱分離可達(dá)到乳鐵蛋白的基線分離，無(wú)干擾。最低檢出限為0.01 mg/100g。

（4）該方法線性范圍好，在30～500 g/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。,線性回歸方程為y= 0.00051x-3.36(x為峰面積；y為質(zhì)量濃度，μg/mL)，相關(guān)系數(shù)r=0.9998。

（5）樣品加標(biāo)回收率在86～96%間，平均為92.7%，生牛乳樣品平均RSD為2.65%，滅菌乳為11.98%，完全能滿足乳中乳鐵蛋白的定量測(cè)定的要求。

（6）通過(guò)對(duì)生牛乳及滅菌乳中乳鐵蛋白測(cè)定，表明通過(guò)超高溫滅菌后的乳中幾乎檢不出非變形乳鐵蛋白的含量。說(shuō)明乳的功能性成分大打折扣。從而為評(píng)價(jià)乳的功能性提供一可靠地檢測(cè)方法。

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Ultrafiltration-Determination of lactoferrin in milk by HPLC and evaluate the function

LIU Xiu-qing1，JIANG Jin-dou2，TAO Da-li2
(1.Heilongjiang Institute for Food and Drug Control Harbin 150088,China;2.Ministry of Agriculture Dairy Quality Su?pervision and Testing Center，Harbin 150090，China)

To establish a method for determination of lactoferrin in milk by ultrafiltration and HPLC.The method of sample treatment for samples with phosphate buffer diluted sample solution by heparin immunoaffinity column,two sodium hydrogen phosphate Sodium Chloride Solution elution,then using ultrafiltration after direct determination by UV detector.the detection limit of the method is simple and conve?nient,this method has high sensitivity for 0.01 mg/100g,good reproducibility,short analysis time.The method for the determination of lacto?ferrin has active function,solves all kinds of raw milk and liquid milk lactoferrin mass fraction low production only The determination of the sensitivity of the heparin affinity column after purification can not meet the requirements of the measurement,and provide accurate data for evaluating the nutritional value of milk.

Ultrafiltration；milk；lactoferrin；HPLC

TS252.7

A

1001-2230（2016）11-0053-04

2016-05-20

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助（201403071）。

劉秀清（1974-），男，高級(jí)工程師，主要從事食品質(zhì)量安全與檢測(cè)技術(shù)研究。

姜金斗