（華測(cè)檢測(cè)認(rèn)證集團(tuán)上海華測(cè)品標(biāo)檢測(cè)技術(shù)有限公司，上海 201206）

高效液相色譜法測(cè)定乳粉中維生素K1的改進(jìn)

邵艷，翟立斐，王煥新，柴平海

（華測(cè)檢測(cè)認(rèn)證集團(tuán)上海華測(cè)品標(biāo)檢測(cè)技術(shù)有限公司，上海 201206）

建立了固相萃取-高效液相色譜法分析乳品中維生素K1的方法。樣品經(jīng)磷酸鹽緩沖液和脂肪酶酶解，正己烷提取和三氧化二鋁柱純化后，以正己烷定容，以Eclipse XDB C8色譜柱（配柱后鋅粉衍生柱）分析，溶解了10 mmol氯化鋅、5 mmol乙酸鈉和5 mmol冰醋酸的甲醇為流動(dòng)相，在0.8 mL/min的流速下，激發(fā)波長(zhǎng)243 nm，發(fā)射波長(zhǎng)：430 nm檢測(cè)。維生素K1的加標(biāo)回收率為86.4% ～ 92.6%，變異系數(shù)為1.3%～2.4%，線性范圍為0.05～10.0 μg/mL，相關(guān)系數(shù)為0.9994，方法的檢出限為10 μg/kg。該方法線性范圍廣，靈敏度高，凈化效果好，可滿足實(shí)際樣品分析的需求。

脂肪酶；固相萃取；高效液相色譜；XDB C8色譜柱；維生素K1

0 引言

維生素K1是一種萘醌衍生物，化學(xué)名稱為2-甲基-3-（3，7，11，15-四甲基-2-十六碳烯基）-1，4-萘醌。維生素K1能控制血液凝結(jié)，因此在臨床上將維生素K1廣泛應(yīng)用于凝血酶過(guò)低、維生素K1缺乏癥、新生兒自然出血癥的防止[1]。維生素K1是脂溶性的物質(zhì)，對(duì)熱、氧及水分的作用很穩(wěn)定，但在堿性環(huán)境下，受陽(yáng)光照射會(huì)分解[2]。目前維生素K1的檢測(cè)方法主要有電極法[3]、毛細(xì)管電泳法[4]、高效液相色譜法[5-8]。一般維生素K1測(cè)定所使用的前處理酶解方法，在液相色譜圖中目標(biāo)峰的前面有一個(gè)很大的干擾峰，且出峰時(shí)間長(zhǎng)。本研究?jī)?yōu)化前處理方法，采用常規(guī)的甲醇溶液為流動(dòng)相，建立了應(yīng)用C8色譜柱和鋅粉柱后衍生柱對(duì)維生素K1的高效液相色譜分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1材料與試劑

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：維生素K1（99.0%）；甲醇（色譜純）；冰醋酸（色譜純）；正己烷（色譜純）；脂肪酶（酶活力≥700 U/mg）；中性氧化鋁柱（500 mg/6 mL）其他試劑無(wú)水乙醇、氯化鋅、氫氧化鈉、無(wú)水硫酸鈉等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀，帶FLD檢測(cè)器；色譜柱（Agilent Eclipse XDB-C8，5 μm 4.6×150 mm）；鋅粉衍生柱（50 mm×4.6 mm，鋅粉50 ～70 μm）；高速離心機(jī)；DK-S28型電熱恒溫水浴鍋；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（EYELA OSB-2100）；電子天平（AL204）；渦旋混合器（WH-861）。

1.3方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取50 mg維生素K1于25 mL容量瓶中，用正己烷溶解定容，配制成質(zhì)量濃度為2 000 μg/mL，-18℃儲(chǔ)存?zhèn)溆肹6]。根據(jù)需要濃度用正己烷稀釋成20 μg/mL工作液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線配制：分別吸取0.1，0.2，0.5，0.8和1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)工作液；用正己烷定容至10 mL，配制成質(zhì)量濃度分別為0.20，0.40，1.00，1.60和2.00 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

1.3.2 樣品前處理

稱取2.5 g奶粉于50 mL塑料離心管中，加入25 mL磷酸鹽緩沖液（45 ～50℃，1.39 g磷酸二氫鈉和1.28 g磷酸氫二鈉溶解定容到500 mL），1.0 g脂肪酶，于37℃±5℃水浴振蕩器中過(guò)夜。取出樣液，加2 mL氫氧化鈉溶液（濃度10 mol/L），用50 mL乙醇溶液轉(zhuǎn)移入250 mL分液漏斗中，用100 mL正己烷分兩次萃?。ū匾獣r(shí)加飽和氯化鈉溶液去乳化）。合并的有機(jī)相真空旋蒸干，用2 mL正己烷溶出，在0℃以下冷凍1 h以上，高速離心后，上清液過(guò)中性氧化鋁柱，用1.5 mL石油醚淋洗，4 mL正己烷洗脫接收到10 mL試管中（控制流出速度，1滴/3 s）。洗脫液置氮吹儀上于40℃±2℃下吹干后，用1 mL正己烷定容，再經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，供檢測(cè)。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：AgilentEclipseXDB-C8，5μm4.6×150mm，鋅柱（50 mm×4.6 mm）；流速為0.8 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL；柱溫為30℃；流動(dòng)相為甲醇溶液（10 mmol氯化鋅、5 mmol乙酸鈉和5 mmol冰醋酸）；熒光檢測(cè)波長(zhǎng)為激發(fā)波長(zhǎng)243 nm，發(fā)射波長(zhǎng)430 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1前處理?xiàng)l件的選擇

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)用脂肪酶酶解時(shí)，加入磷酸鹽緩沖液[9]后，目標(biāo)峰前面的干擾峰變小。有文獻(xiàn)介紹[10]，胰脂肪酶的酶解效果不錯(cuò)，但是價(jià)格昂貴，出于對(duì)檢測(cè)成本考慮，本研究還是采用脂肪酶酶解，然后再用氧化鋁柱純化，干擾峰明顯變小。

2.2色譜柱的選擇

一般文獻(xiàn)資料里介紹都采用C18柱進(jìn)行維生素K1的測(cè)定。由于維生素K1側(cè)鏈上有四個(gè)異戊二烯殘基，所以在C18柱上保留強(qiáng)，導(dǎo)致出峰時(shí)間很長(zhǎng)，因此采用了C8柱進(jìn)行了優(yōu)化。維生素K1在Eclipse XDB-C8色譜柱上的保留時(shí)間在6 min左右，而以同樣的流速和甲醇溶液流動(dòng)相，維生素K1在Eclipse XDB-C18色譜柱上的保留時(shí)間在15 min左右，峰型也不好，應(yīng)用C8柱大大縮短了分析檢測(cè)時(shí)間。

2.3流動(dòng)相和流速的選擇

GB 5413.10-2010中測(cè)定維生素K1，流動(dòng)相中加入的二氯甲烷，大量長(zhǎng)期使用對(duì)儀器有損害，本實(shí)驗(yàn)只用甲醇溶液做流動(dòng)相進(jìn)行色譜分析，保留時(shí)間為5.8 min，流速0.8 mL/min時(shí)達(dá)到了合適的保留時(shí)間、峰型以及分離效果.

2.4繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)系列各進(jìn)樣10 μL，得到維生素K1的色譜圖，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并對(duì)曲線進(jìn)行線性回歸。該方法在質(zhì)量濃度為0.05 ～10.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好?；貧w方程及相關(guān)系數(shù)如表1所示。

表1 維生素K1的回歸方程和相關(guān)系數(shù)

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5樣品分析和檢出限

將標(biāo)準(zhǔn)品、加標(biāo)樣品按照方法進(jìn)行測(cè)定，得到其色譜圖（圖2和圖3）。樣品的檢出限為10 μg/kg。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)色譜

圖3 加標(biāo)樣品色譜

2.6回收率、精密度

在奶粉中分別加入10，20，100 μg/kg三個(gè)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的標(biāo)準(zhǔn)品；分別進(jìn)行6次平行實(shí)驗(yàn)，得到方法的回收率和精密度如表2所示。

表2 方法回收率和精密度（n=6）

3 結(jié) 論

本文建立了高效液相色譜法測(cè)定乳粉中的維生素K1。采用固相萃取柱凈化，Eclipse XDB C8柱進(jìn)行高效液相色譜分離，熒光檢測(cè)器測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用脂肪酶酶解后氧化鋁柱純化，對(duì)于乳粉有較好的凈化效果，應(yīng)用C8柱大大縮短了樣品檢測(cè)的時(shí)間。實(shí)驗(yàn)證明，該方法快捷，結(jié)果準(zhǔn)確，適用于實(shí)驗(yàn)室對(duì)乳粉中維生素K1的檢測(cè)。

[1]王昂，王麗麗，蔣沁，等.維生素K的生產(chǎn)及應(yīng)用研究[J].河北化工，2008，31（9）：35-37.

[2]聶洪勇.維生素及其分析方法[M].上海：科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，1987.

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[7]GB 5413.10-2010嬰幼兒食品和乳品中維生素K1的測(cè)定[S].

[8]王竹，王光亞.蔬菜中維生素K1的測(cè)定-HPLC法[J].Acta Nutri?menta Sinica，1999，21（4）：450-453.

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Improvement research on the determination of Vitamin K1in milk using High Performance Liquid Chromatography

SHAO Yan，ZHAI Li-fei，WANG Huan-xin，CHAI Ping-hai
（Shanghai PinBiao Company of Centre Testing International（shenzhen）Corporation，Shanghai 201206，China）

An analytical method was developed for the determination of Vitamin K1in milk by solid phase extraction-high performance liq?uid chromatography.The sample was enzymatic hydrolysis by lipase in phosphate buffer solution，extracted with hexane，and then the extract was purified with aluminium oxide column，and finally，Vitamin K1was stored in hexane solution.The separation was achieved by using Eclipse XDB C8 column and an elution with the mobile phases of methanol dissolving 10 mmol Zinc chloride，5 mmol sodium acetate and 5 mmol glacial acetic acid.The identification and quantitative analysis were carried out with fluorescence detector at excitation 243nm and emission 430 nm with flow rate 0.8 mL/min.The recoveries ranged from 86.4%to 92.6%with the relative standard deviations(RSDs）be?tween 1.3%and 2.4%.The linear range was 0.05 ～10.0 μg/mL and the correlation coefficient（r2）was 0.9994.The limit of detection was 10 μg/kg.The method is enough for the analysis of Vitamin K1in actual samples with wide linear range and high sensitivity.

lipase;solid phase extraction;High Performance Liquid Chromatography spectrometry;XDB C8 chromatography column;Vitamin K1

TS252.7

A

1001-2230(2016)11-0057-02

2016-03-30

邵艷（1975-），女，碩士，研究方向?yàn)槭称窓z測(cè)分析。