廖海霞 綜述 張薇 馬驍 審校

(1.山東大學(xué)心血管重構(gòu)與功能研究教育部和衛(wèi)生部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室山東省心血管疾病轉(zhuǎn)換醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)山東大學(xué)齊魯醫(yī)院心血管內(nèi)科，山東 濟(jì)南 250012；2.濟(jì)南解放軍第456醫(yī)院心血管內(nèi)科，山東 濟(jì)南 250031)

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紅細(xì)胞微粒與冠心病關(guān)系的研究進(jìn)展

廖海霞1綜述 張薇1馬驍2審校

(1.山東大學(xué)心血管重構(gòu)與功能研究教育部和衛(wèi)生部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室山東省心血管疾病轉(zhuǎn)換醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)山東大學(xué)齊魯醫(yī)院心血管內(nèi)科，山東 濟(jì)南 250012；2.濟(jì)南解放軍第456醫(yī)院心血管內(nèi)科，山東 濟(jì)南 250031)

各種細(xì)胞(比如血小板、內(nèi)皮細(xì)胞、白細(xì)胞、紅細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞等)在激活或者程序性細(xì)胞死亡的過(guò)程中，產(chǎn)生并釋放于外周血中的直徑為0.1～1 μm的小囊泡被稱為細(xì)胞微粒，細(xì)胞微粒在結(jié)構(gòu)上保留了一部分前體細(xì)胞所特有的細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)，甚至一些簡(jiǎn)單的細(xì)胞器，由紅細(xì)胞釋放的小囊泡稱之為紅細(xì)胞微粒(erythrocyte-derived microparticles，ErMPs)[1]。ErMPs在調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能[2]以及血栓形成[3-4]、炎癥反應(yīng)[5-6]等方面都有重要的作用，近年來(lái)一些研究發(fā)現(xiàn)冠心病患者冠狀動(dòng)脈及外周血中ErMPs明顯升高[7-8]，因而ErMPs有望成為冠心病血栓形成時(shí)的新標(biāo)志物?，F(xiàn)主要將ErMPs的形成機(jī)制及其在冠心病中的作用做一概述。

1 ErMPs概述

1.1 ErMPs的形成

ErMPs是在炎癥反應(yīng)、缺氧等各種刺激因素作用下紅細(xì)胞激活或者程序性細(xì)胞死亡時(shí)的產(chǎn)物，ErMPs的形成和釋放貫穿于紅細(xì)胞的整個(gè)老化過(guò)程。目前發(fā)現(xiàn)能夠誘導(dǎo)紅細(xì)胞產(chǎn)生ErMPs的物質(zhì)有血流切應(yīng)力、補(bǔ)體蛋白C5b-9、氧化產(chǎn)物或者程序性細(xì)胞死亡前的刺激[9]。ErMPs的形成與帶3蛋白(Band 3蛋白)密切相關(guān)。Band 3蛋白是一種多次跨膜糖蛋白，它是紅細(xì)胞膜中主要的膜蛋白，Band 3蛋白胞漿區(qū)有膜骨架蛋白、血紅蛋白等的結(jié)合位點(diǎn)以及磷酸化位點(diǎn)，是連接Band 4.1、Band 4.2、CD47以及錨定蛋白等膜骨架蛋白的樞紐[10]。Band 3蛋白通過(guò)與這些膜骨架蛋白的連接維持紅細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。炎癥反應(yīng)、缺氧等刺激通過(guò)影響B(tài)and 3蛋白以及內(nèi)膜微環(huán)境，使細(xì)胞骨架張力和膜彎曲力之間的平衡被破壞，從而促進(jìn)膜骨架的重排和出芽，最終產(chǎn)生ErMPs。目前比較受認(rèn)可的Band 3蛋白介導(dǎo)的ErMPs形成模式有兩種：Band 3蛋白聚簇模式和紅細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡模式。在Band 3蛋白聚簇模式中，氧化應(yīng)激促使高鐵血色原的形成，高鐵血色原與Band 3蛋白結(jié)合能夠刺激Band 3蛋白聚簇的產(chǎn)生，聚簇化的Band 3蛋白與循環(huán)中的IgGs具有較強(qiáng)的親和性，因此大量IgGs沉積于紅細(xì)胞表面，誘發(fā)紅細(xì)胞膜自身囊泡化[11]，最后形成ErMPs。紅細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡模式中，鈣離子的內(nèi)流激活鈣蛋白酶、谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶2等，使磷酸酪氨酸激酶和磷酸酪氨酸磷酸酶對(duì)細(xì)胞膜Band 3蛋白酪氨酸的調(diào)節(jié)失衡，導(dǎo)致Band 3蛋白磷酸化顯著增加。Band 3蛋白胞漿區(qū)的磷酸化能降低其與錨定蛋白的結(jié)合，以錨定蛋白為中介的細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)的形成因而受到影響，最后降低膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[12-13]。ErMPs的形成機(jī)制尚未完全闡明，仍需進(jìn)一步的研究和探討。

1.2 ErMPs的組成

通過(guò)離心分離、蛋白組學(xué)等方法研究發(fā)現(xiàn)ErMPs的成分有紅細(xì)胞骨架相關(guān)的分子、膜蛋白、代謝相關(guān)蛋白、血紅蛋白、信號(hào)分子(如磷脂酶、同源IgG)、補(bǔ)體等。ErMPs的組成與紅細(xì)胞不完全相同，并且ErMPs的主要成分隨著紅細(xì)胞所受到的刺激的不同而有所變化[14-15]，目前被證實(shí)的主要有富含Band 3蛋白、血型糖蛋白、補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白、糖肌醇磷脂-錨定蛋白(GPI錨定蛋白)或脂筏標(biāo)記蛋白的ErMPs。在富含脂筏標(biāo)記蛋白的ErMPs的形成過(guò)程中，細(xì)胞骨架蛋白的氧化應(yīng)激會(huì)促進(jìn)膜表面的樣蛋白寡聚物側(cè)向移動(dòng)，使脂筏重排，誘導(dǎo)胞膜上的脂塊出芽，樣蛋白和GPI錨定蛋白從細(xì)胞分離，最終形成富含脂筏標(biāo)記蛋白的ErMPs[15-16]。ErMPs膜表面保留一些紅細(xì)胞的表面蛋白抗原，如CD235a(+)(血型糖蛋白A)、CD105(-)、CD45(-)、CD47、CD35(一種膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)、CD55(一種GPI錨定蛋白)、CD59[17-18]。CD47是正常紅細(xì)胞膜表面的一種蛋白，巨噬細(xì)胞能夠識(shí)別CD47從而不會(huì)吞噬紅細(xì)胞，而ErMPs的釋放使紅細(xì)胞膜表面的CD47表達(dá)減少時(shí)，巨噬細(xì)胞因不能更好地識(shí)別，因此會(huì)將紅細(xì)胞視為異己物質(zhì)而將其吞噬清除[19]。

2 ErMPs的檢測(cè)

隨著人們對(duì)ErMPs的臨床應(yīng)用研究的興趣逐漸增大，ErMPs的檢測(cè)技術(shù)也得到人們的研究和重視。目前ErMPs的檢測(cè)方法有以下幾種。

2.1 顯微鏡觀察

細(xì)胞微粒的直徑<1 μm，使用共聚焦顯微鏡和透射電子顯微鏡等特殊顯微鏡才可以觀察到細(xì)胞微粒。隨著高分辨率激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)的發(fā)展，不僅可以通過(guò)它直接觀察細(xì)胞微粒的大小、形態(tài)及內(nèi)部結(jié)構(gòu)，還可以動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞微粒的蛋白水解作用[20]。另外，在免疫組織化學(xué)技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的免疫電鏡技術(shù)也可以幫助人們定位觀察細(xì)胞微粒膜表面上的抗原等[21]。

2.2 酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附法是免疫酶測(cè)定法的一種，該法利用純化的抗體與細(xì)胞微粒結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)，具有靈敏度高、不受細(xì)胞微粒大小的限制、一次能完成大量標(biāo)本檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)是檢測(cè)結(jié)果容易受抗原、抗體質(zhì)變等因素的干擾；而且該法無(wú)法分辨檢測(cè)物質(zhì)的大小，因而檢測(cè)結(jié)果中可能包含細(xì)胞碎片、程序性細(xì)胞死亡小體等雜質(zhì)[22]。上述缺點(diǎn)限制了其在細(xì)胞微粒檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)

這種方法具有簡(jiǎn)便快捷以及可以進(jìn)行多元熒光標(biāo)記檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，是目前臨床廣泛應(yīng)用的一種檢測(cè)方法[23]。流式細(xì)胞術(shù)不僅可以檢測(cè)ErMPs的來(lái)源，還可以對(duì)其進(jìn)行半定量分析。傳統(tǒng)的流式細(xì)胞術(shù)對(duì)于直徑<0.30 μm的細(xì)胞微粒不敏感，隨著技術(shù)的進(jìn)步，目前能夠檢測(cè)到直徑最小約0.10 μm的細(xì)胞微粒[23]，但是由于各方面因素的影響，目前仍沒(méi)有一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)過(guò)程。結(jié)合免疫熒光技術(shù)，可以更精確地檢測(cè)到細(xì)胞微粒的數(shù)目和來(lái)源，以及如何利用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)到直徑更小的細(xì)胞微粒是目前研究的熱點(diǎn)[24]，Grisendi等[25]提出了聯(lián)合羥基熒光素二醋酸琥珀酰亞胺脂、CD235a(+)和膜聯(lián)蛋白V多參數(shù)著染的方法來(lái)測(cè)定ErMPs。Xiong等[26]提出了在預(yù)先設(shè)定的ErMPs計(jì)數(shù)比值下，混合使用校準(zhǔn)珠子和計(jì)數(shù)珠子來(lái)消除熒光干擾信號(hào)的方法；但這些改進(jìn)的流式細(xì)胞術(shù)仍需慎重探究。

2.4 蛋白組學(xué)

最近，蛋白組學(xué)也被應(yīng)用到ErMPs的研究中[27]。該技術(shù)能用來(lái)對(duì)ErMPs進(jìn)行定性分析，尤其在輸血領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[28]。由于ErMPs的形成復(fù)雜，完整的蛋白質(zhì)譜尚未明了。隨著質(zhì)譜分析和激光解析技術(shù)的應(yīng)用，拓寬了細(xì)胞微粒上蛋白質(zhì)的檢出范圍，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)將來(lái)可能成為檢測(cè)ErMPs的可靠方法[18]。

3 ErMPs與冠心病

ErMPs在調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能以及血栓形成、炎癥反應(yīng)等方面都有重要的作用，而這些環(huán)節(jié)與冠心病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，因此ErMPs成為了目前人們研究的熱點(diǎn)。

3.1 ErMPs與內(nèi)皮細(xì)胞

冠心病的發(fā)生與血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及其功能異常有密切關(guān)系[29]。正常血管的舒張功能主要受L-精氨酸、一氧化氮合酶、一氧化氮(NO)系統(tǒng)調(diào)控。NO有拮抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用，該作用的前提是有充足的NO。充足的NO能夠調(diào)整血小板的功能、白細(xì)胞的黏附和滲出，抑制低密度脂蛋白的氧化，防止血管平滑肌細(xì)胞增殖。在紅細(xì)胞老化過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生含有血紅蛋白的ErMPs和游離血紅蛋白，它們所含的亞鐵離子能迅速與NO反應(yīng)，促進(jìn)NO從體內(nèi)清除，從而降低NO的生物利用度[2]。ErMPs、游離血紅蛋白與NO的反應(yīng)速度差不多，兩者約為紅細(xì)胞與NO的反應(yīng)速度的1 000倍[30-31]。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，往老鼠體內(nèi)注射很少量的ErMPs、游離血紅蛋白就能促進(jìn)血管明顯的收縮反應(yīng)，進(jìn)一步提示ErMPs對(duì)于人體內(nèi)NO的清除起著重要的作用[32]。在冠心病的早期階段，內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)隨著NO的減少變得脆弱，增加受到損傷的可能性，白細(xì)胞的滲出也隨之增多，并且內(nèi)皮下層低密度脂蛋白也更容易氧化。同時(shí)，血管平滑肌細(xì)胞的增殖會(huì)使新生內(nèi)膜變厚。在冠心病的晚期階段，NO的減少使血小板更容易被激活，從而增加血栓形成和心肌梗死的風(fēng)險(xiǎn)。綜上，NO生物利用度的下降能促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化各個(gè)時(shí)期的進(jìn)展。另外，Camus 等[32]在研究鐮刀型貧血老鼠血液中的ErMPs與其腎血管血栓形成的關(guān)系中，發(fā)現(xiàn)ErMPs會(huì)損傷內(nèi)皮細(xì)胞，從而影響血管的舒張功能。

3.2 ErMPs與血栓形成

冠心病患者血栓形成主要繼發(fā)于斑塊纖維帽的破裂，斑塊破裂時(shí)會(huì)使大量ErMPs釋放出來(lái)，循環(huán)中的ErMPs也會(huì)增多，ErMPs在血栓形成中有重要的作用。Liu等[7]的研究結(jié)果表明急性冠狀動(dòng)脈綜合征患者血液中ErMPs較健康對(duì)照組明顯升高，而且ST段抬高型心肌梗死患者升高的幅度高于非ST段抬高型急性冠狀動(dòng)脈綜合征患者。Suades等[8]通過(guò)檢測(cè)外周血ErMPs及其表達(dá)的CD235a(+)的水平，發(fā)現(xiàn)ST段抬高型心肌梗死患者比健康對(duì)照組明顯升高，再灌注治療前較再灌注治療后明顯升高。正常細(xì)胞膜的磷脂呈不對(duì)稱分布，磷脂酰膽堿和鞘磷脂位于外層，磷脂酰乙醇胺和磷脂酰絲氨酸位于內(nèi)層，這種不對(duì)稱需要消耗能量來(lái)維持。由于ErMPs膜上的磷脂分布的不對(duì)稱性消失，使得大量帶負(fù)電荷磷脂酰乙醇胺和磷脂酰絲氨酸分布于膜的外層。帶負(fù)電荷的磷脂酰絲氨酸與凝血蛋白上帶正電荷的γ-羧基谷氨酸產(chǎn)生靜電作用，故較為容易與凝血因子結(jié)合。此外，磷脂酰絲氨酸是最有效的組織因子啟動(dòng)劑，它給凝血酶原酶和酶復(fù)合物提供結(jié)合位點(diǎn)，從而激活因子Ⅷ、Ⅸ和Ⅺ及凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致血栓的形成[3]。Liu等[7]的臨床研究也證實(shí)了急性冠狀動(dòng)脈綜合征患者血液中的ErMPs縮短了凝血時(shí)間，并促進(jìn)因子X(jué)的激活以及凝血酶原酶的形成。

在慢性溶血性貧血疾病中，ErMPs的升高與高凝狀態(tài)、纖溶系統(tǒng)以及內(nèi)皮細(xì)胞功能的激活明顯相關(guān)[4]。Zecher等[33]發(fā)現(xiàn)鐮刀型貧血老鼠血液中的ErMPs明顯高于野生型的，他們分別從鐮刀型貧血老鼠和野生型老鼠體內(nèi)提取ErMPs，經(jīng)過(guò)濃縮后注射到鐮刀型貧血老鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)來(lái)自鐮刀型貧血老鼠的ErMPs能夠明顯促進(jìn)受試?yán)鲜笱褐辛字＝z氨酸陽(yáng)性的細(xì)胞微粒的形成，而來(lái)自野生型的ErMPs作用很弱；另外，他們還發(fā)現(xiàn)鐮刀型貧血老鼠血液中ErMPs能夠明顯減慢老鼠腎血管的舒張期血流速度和平均血流速度，上述發(fā)現(xiàn)均提示鐮刀型貧血老鼠血液中的ErMPs與腎血管血栓形成明顯相關(guān)。

3.3 ErMPs與炎癥反應(yīng)

有研究表明ErMPs通過(guò)促進(jìn)選擇素P與其配體的相互作用，以及通過(guò)提高C反應(yīng)蛋白、免疫球蛋白和CD11b的數(shù)量，間接誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的趨化作用[5-6]，從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)。Zecher等[33]分別往健康小鼠和脂多糖誘導(dǎo)的膿毒血癥模型小鼠體內(nèi)注射純化的ErMPs，通過(guò)分析兩組小鼠血漿中白介素-6、角化細(xì)胞源性趨化因子、單核細(xì)胞趨化蛋白-1等炎性因子的水平，得出的結(jié)論是ErMPs能夠在炎癥的環(huán)境中放大肺泡巨噬細(xì)胞、脾臟巨噬細(xì)胞釋放炎性因子的作用。另外，該實(shí)驗(yàn)還驗(yàn)證了ErMPs在補(bǔ)體5a受體缺失的小鼠體內(nèi)無(wú)法誘導(dǎo)炎性因子的釋放，進(jìn)一步說(shuō)明了ErMPs可通過(guò)補(bǔ)體活化經(jīng)典途徑，促進(jìn)炎性因子的釋放。

另外，ErMPs可能有抗炎作用。Sadallah等[17]發(fā)現(xiàn)ErMPs能夠持續(xù)抑制炎性因子腫瘤壞死因子-α、白介素-10的釋放。ErMPs還可以通過(guò)調(diào)節(jié)膜上磷脂酰絲氨酸的表達(dá)或者其他機(jī)制間接抑制巨噬細(xì)胞的活性，從而影響炎癥的產(chǎn)生過(guò)程?？傊壳坝嘘P(guān)ErMPs對(duì)炎癥反應(yīng)起了促進(jìn)還是抑制作用的問(wèn)題尚未有統(tǒng)一定論，仍需繼續(xù)探討。

4 結(jié)束語(yǔ)

ErMPs由紅細(xì)胞活化或者程序性細(xì)胞死亡時(shí)產(chǎn)生，具有重要的生物學(xué)作用。ErMPs在冠心病中的作用也在不斷地被發(fā)現(xiàn)，如損傷內(nèi)皮細(xì)胞功能，促凝、促炎活性，但其作為一種新興的生物標(biāo)志物，各方面的具體作用機(jī)制仍然需要進(jìn)一步的探討。相信隨著針對(duì)ErMPs的研究越來(lái)越深入，將為冠心病的診治、診療途徑提供一些新的靶點(diǎn)。

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Current Advancements of Erythrocyte-derived Microparticles in Coronary Heart Disease

LIAO Haixia1,ZHANG Wei1,MA Xiao2

(1.TheKeyLaboratoryofCardiovascularRemodelingandFunctionResearch,ChineseMinistryofEducationandChineseMinistryofHealth;TheStateandShandongProvinceJointKeyLaboratoryofTranslationalCardiovascularMedicine,DepartmentofCardiology,QiluHospitalofShandongUniversity,Jinan250012,Shandong,China；2.DepartmentofCardiology,The456thHospitalofPLA,Jinan250031,Shandong,China)

國(guó)家自然科學(xué)基金(81470560)

廖海霞(1990—)，在讀碩士，主要從事冠心病相關(guān)研究。Email:liaohaixia20@163.com

張薇(1954—)，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，主要從事冠心病相關(guān)研究。Email:zhangweisdu7@163.com

馬驍(1967—)，副主任醫(yī)師，主要從事冠心病相關(guān)研究。Email:xmajn@163.com

2016-04-02