依維莫司對胃癌細(xì)胞株生長、遷移和侵襲的作用研究

俞榕，沈迎春

依維莫司對胃癌細(xì)胞株生長、遷移和侵襲的作用研究

俞榕，沈迎春

目的探討依維莫司對胃癌細(xì)胞HGC-27和KATO III生長、遷移和侵襲的作用。方法采用MTT試驗(yàn)檢測兩種胃癌細(xì)胞在不同濃度依維莫司作用下的生長狀況，并計(jì)算出相應(yīng)的IC50值；采用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測依維莫司作用后細(xì)胞周期狀況；采用Annexin V/PI雙染法檢測依維莫司作用后細(xì)胞凋亡狀況；采用Transwell法檢測依維莫司作用后細(xì)胞的遷移和侵襲能力變化；采用Western blot法檢測兩種細(xì)胞的mTOR蛋白表達(dá)水平。結(jié)果依維莫司顯著抑制HGC-27細(xì)胞和KATO III細(xì)胞的生長，并且這種抑制作用具有濃度依賴性；依維莫司誘導(dǎo)HGC-27細(xì)胞和KATO III細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯；依維莫司誘導(dǎo)KATO III細(xì)胞發(fā)生凋亡，但不誘導(dǎo)HGC-27細(xì)胞發(fā)生凋亡；依維莫司抑制HGC-27細(xì)胞和KATO III細(xì)胞的遷移和侵襲能力；mTOR蛋白在HGC-27和KATO III細(xì)胞中均有表達(dá)。結(jié)論依維莫司可以顯著抑制胃癌細(xì)胞的生長、遷移和侵襲，可以作為臨床上治療胃癌，預(yù)防胃癌復(fù)發(fā)的靶向藥物。

胃腫瘤；癌；依維莫司

目前我國每年約40余萬成為胃癌新患者，而約30余萬胃癌患者死亡［1］。雖然外科手術(shù)已成為胃癌最主要的治療手段，但部分患者仍需行化療以延長生存期，降低復(fù)發(fā)率。目前靶向治療藥物在腫瘤治療中吸引著眾人的眼球。本研究檢測目前臨床上常見的靶向藥物mTOR抑制劑依維莫司對胃癌細(xì)胞株HGC-27［2］和KATO III細(xì)胞［3］生長、遷移和侵襲的作用?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1材料人胃癌細(xì)胞株 HGC-27和KATOIII均購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫；依維莫司購自瑞士novartis公司；RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自美國Hyclone公司；青鏈霉素購自美國Sigma公司；MTT試劑購自美國Sigma公司；AnnexinV-FITC雙染色試劑盒購自美國Invitrogen公司；Transwell細(xì)胞培養(yǎng)小室購自美國corning公司；抗mTOR單克隆抗體購自美國santacruz生物公司；蛋白提取試劑盒購自美國BD公司；羊抗鼠二抗購買自美國KPL公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購買自美國Pierce公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)將人胃癌細(xì)胞株HGC-27和KATOIII培養(yǎng)在10 cm培養(yǎng)皿中，細(xì)胞均采用RPMI 1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，RPMI 1640培養(yǎng)基中需添加10%胎牛血清和1%青鏈霉素。細(xì)胞培養(yǎng)在37℃，含5%CO2、95%空氣的恒溫培育箱中。細(xì)胞培養(yǎng)基每天更換，當(dāng)細(xì)胞生長至70%～80%匯合程度時(shí)即予以0.25%的胰蛋白酶消化，然后以1∶3的比例接種至3個新的培養(yǎng)皿中。

1.2.2MTT試驗(yàn)將處于對數(shù)生長期的兩種胃癌細(xì)胞接種消化接種至96孔板，保持每孔細(xì)胞數(shù)目約5×103個。在細(xì)胞培育過夜后，分別加入不同濃度的依維莫司（0、1、2、4、8、16、32 mol/L）。在藥物處理72 h后，去除含有藥物的培養(yǎng)基，PBS沖洗細(xì)胞，加入MTT溶液；在細(xì)胞與MTT溶液共同孵育4 h后，去除MTT溶液，加入DMSO溶液。然后振蕩混勻，在37℃孵育10 min。上酶標(biāo)儀檢測490 nm處的吸光值。根據(jù)MTT結(jié)果測算出IC50值，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中依維莫司采用IC50值的濃度進(jìn)行。

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，選取對數(shù)生長期的HGC-27和KATO III細(xì)胞接種于6孔板培育過夜。分別加入0、10、20、30、40 mmol/ml依維莫司，在藥物作用72 h后收集細(xì)胞，預(yù)冷的70%乙醇在4℃下固定細(xì)胞過夜，然后分別加入PI（終濃度50 g/ml）和冰冷RNA酶（終濃度50 g/ml）染色0.5 h，樣本上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，采用 Flowjo軟件對流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡采用Annexin V/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡情況，所有操作按照說明書進(jìn)行。選取對數(shù)生長期的HGC-27和KATO III細(xì)胞接種于6孔板培育過夜。分別加入0、10、20、30、40 mmol/ml依維莫司，在藥物作用72 h后收集細(xì)胞，PBS沖洗細(xì)胞后，分別在避光條件下加入Annexin VFITC試劑和PI試劑進(jìn)行雙染色0.5 h。然后在1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.2.5細(xì)胞遷移和侵襲試驗(yàn)采用Transwell小室試驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移和侵襲情況。選取藥物處理48 h和藥物未處理的HGC-27和KATO III細(xì)胞接種于Transwell小室的上室（遷移試驗(yàn)）或鋪有基質(zhì)膠的上室（侵襲試驗(yàn)），然后采用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，在Transwell小室的下室加入含15%胎牛血清的培養(yǎng)基。在培養(yǎng)72 h后，去除小室中培養(yǎng)基，PBS沖洗后甲醇固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染色15 min，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞和基質(zhì)膠。然后在光鏡下技術(shù)染色的細(xì)胞數(shù)目。

1.2.6western blot檢測mTOR的表達(dá)水平首先采用蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，然后采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。取30g蛋白進(jìn)行變性后，上樣到10%的SDS-PAGE膠，進(jìn)行電泳1 h；然后采用麗春紅進(jìn)行膠染色，在確定有蛋白條帶后用PVDF膜轉(zhuǎn)膜1 h；將附有蛋白的膜采用脫脂奶粉封閉，然后分別加入相應(yīng)的抗 mTOR單克隆一抗（1∶1 000），在4℃下孵育過夜，然后加入二抗（1∶5 000）在室溫下孵育1 h，然后采用 ECL發(fā)光試劑盒在暗室中進(jìn)行熒光發(fā)光，并用膠片進(jìn)行顯影和定影。本實(shí)驗(yàn)采用 -actin蛋白作為內(nèi)參照。

1.2.7統(tǒng)計(jì)方法所有數(shù)據(jù)采用 SPSS 11.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示；多組比較采用單因素方差分析分析，兩組比較采用 檢驗(yàn)。＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1依維莫司抑制 HGC-27細(xì)胞和KATOIII細(xì)胞的生長通過MTT試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)依維莫司處理72 h對兩種胃癌細(xì)胞HGC-27和KATO III都有顯著的生長抑制作用，并且這種生長抑制作用具有濃度依賴性。藥物濃度越高，生長抑制作用越顯著（封二彩圖4）。依維莫司對HGC-27和KATO III細(xì)胞的IC50值分別為1.606 mol/L和5.944 mol/L。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，本研究采用的依維莫司濃度分別為兩種細(xì)胞所計(jì)算出的IC50值。

2.2依維莫司誘導(dǎo) HGC-27細(xì)胞和KATOIII細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，筆者發(fā)現(xiàn)在依維莫司作用72 h后，HGC-27和KATO III細(xì)胞出現(xiàn)了G1期阻滯，表現(xiàn)為G1期細(xì)胞比例增高（=7.521、9.195，均＜0.05），S和G2期細(xì)胞相對減少。其中藥物處理組HGC-27細(xì)胞G1期比例為（72.71±1.83）%，對照組 G1期比例為（61.67±1.76）%；藥物處理組KATOIII細(xì)胞G1期比例為（73.51±1.69）%，對照組G1期比例為（60.64±1.74）%。

2.3依維莫司誘導(dǎo)KATO III細(xì)胞發(fā)生凋亡通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)依維莫司作用72 h后，KATOIII細(xì)胞發(fā)生顯著的凋亡（=10.601，＜0.05），藥物處理組KATOIII細(xì)胞凋亡比例為（28.30±1.99）%，對照組凋亡比例為（9.79±2.27）%；另外，依維莫司并不誘導(dǎo)HGC-27細(xì)胞發(fā)生凋亡，藥物處理組細(xì)胞凋亡比例（［9.32±1.24）%］和對照組細(xì)胞凋亡比例（［8.96%±0.90%）］差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=1.006，＜0.05）。

2.4依維莫司抑制 HGC-27細(xì)胞和KATOIII細(xì)胞的遷移和侵襲能力通過Transwell遷移和侵襲試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)依維莫司作用72 h后，HGC-27細(xì)胞和KATO III細(xì)胞的遷移能力和侵襲能力顯著降低，表現(xiàn)為兩種細(xì)胞穿過Transwell膜的數(shù)目顯著少于對照組。遷移試驗(yàn)中藥物處理組穿膜的 HGC-27細(xì)胞數(shù)量為（123.7±28.4）個，對照組為（238±43.9）個，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=3.785，＜0.05）；藥物處理組穿膜的KATOIII細(xì)胞數(shù)量為（139.7±27.6）個，對照組為（231.3±48.2）個，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=2.858，＜0.05）。侵襲試驗(yàn)中藥物處理組穿膜的HGC-27細(xì)胞數(shù)量為（67±4.6）個，對照組為（198±9.6）個，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=21.251，＜0.05）；藥物處理組穿膜的KATOIII細(xì)胞數(shù)量為（63.3±1.5）個，對照組為（151.3±29.3）個，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=5.202，＜0.05）。

2.5mTOR蛋白在HGC-27和KATO III細(xì)胞中的表達(dá)水平通過 western blot實(shí)驗(yàn)，筆者檢測了 mTOR蛋白在HGC-27細(xì)胞和KATOIII細(xì)胞中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，mTOR蛋白在兩種胃癌細(xì)胞中均有表達(dá)。見封二彩圖5。

3　討論

依維莫司是雷帕霉素的衍生物，也是mTOR蛋白抑制劑，多項(xiàng)研究表明其具有抗腫瘤的作用，2012年新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志就曾報(bào)道過依維莫司應(yīng)用于雌激素陽性的絕經(jīng)婦女乳腺癌患者的三期臨床試驗(yàn)，取得了較好的療效［4］。另有研究發(fā)現(xiàn)依維莫司可作為轉(zhuǎn)移性腎癌患者在應(yīng)用血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFR）酪氨酸激素抑制劑如貝伐單抗等治療失敗后的替代藥物，并可收到較好的療效［5］。但目前關(guān)于依維莫司在胃癌治療中的作用尚存在爭議，一些研究認(rèn)為依維莫司可以顯著延長一部分胃癌患者生存期［6］，而一些研究認(rèn)為依維莫司無法顯著延長胃癌患者生存期［7］。

本研究通過基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)探討依維莫司對胃癌細(xì)胞株HGC-27和KATO III的作用。依維莫司是哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的特異性抑制劑，可以顯著抑制 mTOR的活性及其介導(dǎo)的下游通路。通過western blot試驗(yàn)，筆者發(fā)現(xiàn)mTOR在兩種細(xì)胞中均正常表達(dá)，表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過MTT試驗(yàn)，筆者發(fā)現(xiàn)依維莫司在體外可以顯著抑制HGC-27和KATOIII細(xì)胞的增殖，并且這種抑制作用具有濃度依賴性。HGC-27屬于未分化胃癌細(xì)胞，KATOIII屬于低分化胃癌細(xì)胞。未分化癌細(xì)胞通常對于化療藥物更敏感，在研究中筆者發(fā)現(xiàn)依維莫司對HGC-27細(xì)胞的半數(shù)致死濃度（IC50）值更低。

目前已知依維莫司可能通過以下三種途徑抑制細(xì)胞生長：誘導(dǎo)周期阻滯［8］、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［9］和促進(jìn)細(xì)胞自噬［10］。筆者通過細(xì)胞周期檢測發(fā)現(xiàn)，依維莫司可以誘導(dǎo)兩種胃癌細(xì)胞均發(fā)生G1期阻滯。這與他人結(jié)果相符合，說明依維莫司可以通過調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程而抑制細(xì)胞生長。依維莫司誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯的機(jī)制主要依賴于其作為mTOR抑制劑，可以與mTOR結(jié)合，抑制mTOR的活性，然后激活ERK/MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，下調(diào)周期相關(guān)蛋白cyclinD1表達(dá)，上調(diào)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子（CKI）如p21、p27等蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)周期進(jìn)程阻滯，導(dǎo)致生長阻滯［11］。目前研究發(fā)現(xiàn)，依維莫司除了可以誘導(dǎo)周期阻滯外，還可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，依維莫司可以誘導(dǎo)KATOIII細(xì)胞凋亡，卻不能誘導(dǎo)HGC-27細(xì)胞凋亡，說明依維莫司可能通過調(diào)控細(xì)胞周期而發(fā)揮抑制HGC-27細(xì)胞生長的作用，而依維莫司對于KATOIII細(xì)胞生長的調(diào)控可能涉及周期阻滯和細(xì)胞凋亡兩個方面。

除此之外，筆者還發(fā)現(xiàn)依維莫司顯著抑制HGC-27和KATOIII細(xì)胞的遷移和侵襲，這與前人在其他腫瘤中的研究結(jié)果相仿［12］，說明依維莫司可以調(diào)控腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲特性，但其中的具體分子機(jī)制卻未見報(bào)道，有待以后實(shí)驗(yàn)的闡明。

總之，依維莫司可以作為治療胃癌的潛在藥物，但其具體療效和副作用仍有待大規(guī)模臨床試驗(yàn)驗(yàn)證。

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10.3969/j.issn.1671-0800.2016.04.033

R735.2

A

1671-0800（2016）04-0478-03

2015-02-08

（本文編輯：姜曉慶）

330200寧波，鄞州區(qū)集市港鎮(zhèn)衛(wèi)生服務(wù)中心（俞榕）；寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院（沈迎春）

俞榕Email：huangjie1981_ 1981@163.com