任　敏，李東霞

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050)

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綜述

黑色素瘤動物模型治療相關機制研究進展

任敏，李東霞

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050)

[關鍵詞]黑色素瘤；動物模型；治療機制

黑色素瘤源于神經(jīng)脊黑素細胞，多發(fā)生于皮膚，由細胞色素痣、發(fā)育不良痣演變或新發(fā)而成，與紫外線照射、創(chuàng)傷與刺激、免疫抑制、家族遺傳等因素有關[1]。目前，黑色素瘤占皮膚惡性腫瘤的第三位，每年仍以4%～6%的速度增長[2]。多數(shù)早期患者通過手術能夠治愈，但晚期黑色素瘤患者的預后差，轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者中位生存期僅為6～9個月，5年生存率不足5%[3]。近年來，隨著對黑色素瘤侵襲、增殖及轉(zhuǎn)移分子機制認識的不斷加深，黑色素瘤的基因免疫治療方面取得了顯著的成果，部分被應用于臨床[4]。筆者就近年來相關文獻對黑色素瘤的動物模型建立及其治療相關機制方面進展綜述如下。

1黑色素瘤動物模型的構建

目前常用于腫瘤研究的動物模型有自發(fā)瘤模型、誘導模型、轉(zhuǎn)基因動物模型和移植模型[5]。黑色素瘤的研究中以移植模型最為常見，根據(jù)其移植物的不同可進一步分為黑色素瘤外科標本移植模型及細胞株移植模型。而影響黑色素瘤動物移植模型建立成功的因素眾多，與黑色素瘤細胞或外科標本的特性、移植部位及移植黑色素瘤細胞的數(shù)量、動物的品系和周齡以及生長環(huán)境有關。

1.1構建黑色素瘤動物模型的動物種類目前報道的應用于抗黑色素瘤作用及機制體內(nèi)試驗研究的動物種類較多，主要有小鼠，其中包括BALB/c、C57BL、DBA/2、裸小鼠(nude mice)、Scid小鼠等。大鼠，其中包括Fisher、裸大鼠、SD(Sprague-Dawley)、Wistar大鼠等品種。其他還有兔、豬、恒河猴等，其中以小鼠應用較多[6]。

1.2黑色素瘤組織移植模型取人或動物新鮮的黑色素瘤組織，短時間內(nèi)移入動物皮下，因免疫排異反應，一般采用免疫缺陷動物移植。吳海燕等[7]建立免疫細胞缺陷的BNX 小鼠 (T、B、NK 細胞功能缺陷)B16黑色素瘤細胞移植模型，通過皮下移植—肺轉(zhuǎn)移—皮下移植的途徑篩選出具有高轉(zhuǎn)移特點的小鼠皮下黑色素瘤模型，更好地反映了黑色素瘤的臨床特征。姚明等[8]將人黑色素瘤皮下移植至Scid小鼠皮下，反復篩選出了具有自發(fā)肺轉(zhuǎn)移并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的動物模型。組織移植成功率較低，但移植后的黑素瘤仍保持原有的功能和形態(tài)，更能真實地反應黑素瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的過程。

1.3黑色素瘤細胞移植模型黑色素瘤細胞移植模型是指將人或動物黑素瘤細胞接種于動物體內(nèi)，張燕等[9]采用不同濃度的B16黑色素瘤細胞懸液注射于C57BL/6小鼠背部，發(fā)現(xiàn)隨著濃度的升高小鼠的出瘤時間及生存期隨之縮短。當濃度太大時不宜推注，以109L-1時為最適濃度。黑色素瘤細胞移植模型成功率高于組織移植，并且黑色素瘤組織可由細胞移植獲得，獲取時間較為確定，是目前研究最多的黑色素瘤移植模型。

2黑色素瘤動物模型的中藥治療研究

近幾年，黑色素瘤的中藥治療引起了越來越多國內(nèi)外專家學者的關注。 中藥成分抗黑色素瘤作用具有多靶點、多環(huán)節(jié)、多效應的特點，其在抑制黑色素瘤血管生成、DNA的合成以及增強腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因的表達等方面有顯著作用。

2.1影響腫瘤轉(zhuǎn)移相關基因的表達袁波等[10]對黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移B16小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)益氣敗毒湯組與環(huán)磷酰胺(CTX)組相比療效尚有差距，與生理鹽水組相比小鼠肺轉(zhuǎn)移的腫瘤數(shù)明顯減少，實驗證實CTX及益氣敗毒湯經(jīng)胃管給藥治療后，小鼠肺腫瘤組織中腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因nm23的表達強度明顯增強，且組間nm23基因強度的表達差異無統(tǒng)計學意義?？梢娭兴幹苿┮鏆鈹《緶赏ㄟ^調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移相關基因nm23影響黑色素瘤的轉(zhuǎn)移。

2.2對免疫系統(tǒng)的影響來改善黑色素瘤程序性死亡因子1/程序性死亡因子配體(PD-1/PD-Ls)通路的活化可抑制效應T細胞的細胞因子分泌以及增殖活化并促進T細胞的凋亡，進而引發(fā)抗腫瘤免疫的失活及腫瘤免疫逃逸[11]。中藥黃芪多糖可抑制與免疫細胞活性負相關PD-1/PD-Ls通路以及減少免疫負性調(diào)控細胞調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)的數(shù)目來抑制黑色素瘤的生長。負性調(diào)控細胞Treg可直接抑制T細胞的活化、增殖及相關免疫功能來影響腫瘤生長。王潔茹等[12]在黃芪多糖調(diào)節(jié)黑色素瘤小鼠PD-1/PD-Ls分子表達的研究中證明黃芪多糖抑制共刺激分子 PD-1/PD-Ls 的表達，推測這種作用通過增強小鼠 T 淋巴細胞抗腫瘤免疫活性而抑制腫瘤的生長。張舒玉等[13]認為黃芪多糖可能通過降低荷瘤鼠脾臟中調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)數(shù)目，抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)，白細胞介素-10(IL-10)分泌，從而實現(xiàn)其抑瘤作用。

2.3對黑色素瘤血管生成的影響近年來研究發(fā)現(xiàn)三氧化二砷(As2O3)及白術內(nèi)酯I抑制黑色素瘤的主要機制是抑制腫瘤中血管的生成。李楠等[14]通過活體成像技術發(fā)現(xiàn)經(jīng)三氧化二砷腹腔注射的小鼠黑色素瘤組織血管密度顯著降低，腫瘤組織中心發(fā)生壞死，抑制了腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移，其抑制腫瘤血管的機制還需進一步研究。潘利文等[15]實驗證實白術內(nèi)酯I能夠顯著抑制血管內(nèi)皮成管可能與其抑制荷瘤小鼠腫瘤的生長有關。

2.4抑制黑色素瘤組織內(nèi)細胞表達基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)MMPs是一組Zn2+依賴性肽酶，可以降解多種細胞外基質(zhì)和基底膜中的膠原成分，從而促進腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移及血管生成，其中又以MMP-2和MMP-9研究較多[16]。姜新等[17]實驗證實人參皂苷Rg3能夠抑制小鼠黑色素瘤細胞表達MMP-9，使腫瘤的侵襲能力降低抑制黑色素瘤的轉(zhuǎn)移。韓麗娜等[18]在木鱉子醇提物抑制小鼠黑素瘤B16細胞體內(nèi)外侵襲轉(zhuǎn)移的實驗研究中證實木鱉子醇提物能下調(diào)B16細胞中MMP-2和MMP-9的mRNA和蛋白水平，但不能降低金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP-1、TIMP-2)的表達。推測木鱉子醇提物抑制黑素瘤B16細胞侵襲的作用機制與其抑制MMP-2和MMP-9的表達有關。

3黑色素瘤動物模型的基因治療研究

基因治療作為黑色素瘤的一種靶向治療已取得一定效果。常見的有自殺基因療法、癌基因信號通路的阻斷、基因失活、增強抑癌基因的表達、阻斷腫瘤血液供應等。

3.1自殺基因療法自殺基因療法是將某些細菌和病毒的基因?qū)肽[瘤細胞，通過相關藥物殺死攜帶該基因的受體細胞。曾玲等[19]建立具有綠色熒光蛋白(GFP)示蹤功能的單純皰疹病毒 1 型胸苷激酶基因/更昔洛韋自殺基因系統(tǒng)(HSV1-tkGFP/GCV)，實驗證實重組 HSV1-tkGFP/GCV 系統(tǒng)存在一定的旁殺效應，對小鼠黑色素瘤有明顯抑制作用。

3.2癌基因信號通路的阻斷細胞信號通路是細胞通過胞膜或胞內(nèi)受體感受信息分子的刺激，經(jīng)細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)轉(zhuǎn)換，從而影響細胞生物學功能的一系列酶促反應通路。研究發(fā)現(xiàn),Notch 信號通路與腫瘤的發(fā)生關系密切，可通過Notch受體與相鄰細胞表面的配體結(jié)合導致腫瘤的發(fā)生[20-21]。齊艷霞等[22]在Notch1 siRNA對小鼠惡性黑色素瘤細胞抑瘤作用的研究中證實靶向 Notch1基因小干擾RNA(siNotch)下調(diào)Notch1的表達，明顯減緩了小鼠成瘤速度，從而抑制黑色素瘤的發(fā)展。

3.3抑癌基因的研究抑癌基因通過表達抑制細胞增殖和促進細胞分化的各種因子在細胞的正常周期中發(fā)揮重要的作用，抑癌基因的失活使激活的癌基因發(fā)揮作用，導致細胞失去正常生長的調(diào)控發(fā)生癌癥。LKB1基因為公認的抑癌基因，實驗證實LKB1基因與黑色素瘤關系密切，它的失活將導致高轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細胞的產(chǎn)生[23]。發(fā)生LKB1基因缺失的黑色素瘤患者預后不良，黑色素瘤發(fā)生LKB1基因缺失的發(fā)生率約占10%。目前尚不能確定LKB1缺失導致腫瘤轉(zhuǎn)移的機制，推測LKB1的缺失與激活驅(qū)動腫瘤轉(zhuǎn)移蛋白的src激酶有關。李宗河等[24]采用不同濃度的腺病毒介導攜帶綠色熒光蛋白的nm23-H1基因藥物(Ad-GFP-nm23-H1)對裸鼠移植A375實體瘤注射，發(fā)現(xiàn)對裸鼠黑色素瘤具有明顯的抑制作用，且隨著劑量的增大抑瘤作用越明顯。李鶴等[25]采用攜帶mda-7基因的腺病毒(Ad·mda-7)與達卡巴嗪(DTIC)聯(lián)合治療裸鼠惡性黑色素瘤移植瘤模型，瘤體內(nèi)注射病毒Ad·mda-7，腹腔注射DTIC，腫瘤生長速度明顯變慢。

3.4對腫瘤血管生成的影響腫瘤新生血管壁薄，缺乏基底膜，為腫瘤的轉(zhuǎn)移提供了良好的條件，新生血管的不斷形成可為腫瘤提供營養(yǎng)支持，是腫瘤生長步驟之一[26]。在抵抗腫瘤的血管生成中，內(nèi)皮抑素的作用至關重要。曹瑞華等[27]采用腺病毒介導的內(nèi)皮抑素基因(Ad-mES)于小鼠黑色素瘤瘤體內(nèi)注射，腫瘤體積增長減慢，認為原因可能為腫瘤血管的內(nèi)皮細胞在內(nèi)皮抑素的作用下凋亡，阻斷了腫瘤的血液供應，從而達到抑制腫瘤生長轉(zhuǎn)移的效果，除了這種經(jīng)典腫瘤血管生成途徑之外，亦有研究發(fā)現(xiàn)多種惡性腫瘤中存在由腫瘤細胞圍成的管道結(jié)構血管生成擬態(tài)(VM)，謝群等[28]在對小鼠黑色素瘤VM的研究中發(fā)現(xiàn)蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制劑重組蛋白(sv-cystatin)能抑制VM的形成。

4黑色素瘤動物模型的免疫治療研究

黑色素瘤的免疫治療是采用主動免疫和被動免疫治療的方法，激發(fā)和調(diào)動機體的免疫系統(tǒng)，增強腫瘤微環(huán)境抗腫瘤免疫力，從而控制和殺傷腫瘤細胞。

4.1樹突狀細胞疫苗激活小鼠T淋巴細胞免疫反應樹突狀細胞(DC)為功能最強的抗原提呈細胞，在腫瘤的免疫反應中發(fā)揮重要的作用，在腫瘤的免疫反應中樹突狀細胞提呈的抗原與主要組織相容性復合體Ⅰ(MHC-Ⅰ)相結(jié)合，抗原被T細胞識別，促進腫瘤殺傷性T細胞的活化與增殖[29]。齊淵元等[30]通過靜脈注射體外制備的荷載CD8殺傷性T細胞表位雞卵蛋白(OVA)257-264肽段的成熟DC，成功誘導小鼠細胞毒性T淋巴細胞(CTL)免疫反應，抵抗黑色素瘤的成瘤，為DC腫瘤疫苗的研發(fā)提供了一種可行的方法，同時證明了采用靜脈注射樹突狀細胞疫苗能夠使疫苗分布于非淋巴器官以及淋巴器官進行T細胞的激活。

4.2MAGE-A基因疫苗誘導特異性CTL的產(chǎn)生MAGE-A基因編碼的腫瘤特異性抗原肽能被MHC-Ⅰ分子提呈給細胞毒性T淋巴細胞特異的殺傷腫瘤細胞，發(fā)揮抗腫瘤作用。Vogel等[31]在治療黑色素瘤臨床預實驗探索中，將痘病毒載體重組的MAGE基因制成疫苗，導入HLA-A2/K轉(zhuǎn)基因小鼠。結(jié)果證實靶細胞轉(zhuǎn)染MAGE-A1、MAGE-A3和MART-1抗原肽疫苗后可誘導特異性CTL的產(chǎn)生，從而發(fā)揮CTL細胞的抗腫瘤作用溶解自體和異體同源的腫瘤細胞。

4.3黑色素瘤的過繼免疫治療將具有特異性的腫瘤殺傷性細胞在體外大量擴增后回輸?shù)胶闪鲶w內(nèi)達到抗腫瘤的目的，但由于腫瘤微環(huán)境中復雜的免疫抑制網(wǎng)絡，使腫瘤發(fā)生免疫耐受。調(diào)節(jié)性T細胞(Tregs)在腫瘤的免疫耐受中發(fā)揮著重要的作用[32]。李衛(wèi)泊等[33]將體外制備的針對B16細胞的大量CTLs回輸?shù)胶闪鲂∈篌w內(nèi)并聯(lián)合CTX腹腔注射治療，發(fā)現(xiàn)對腫瘤的生長有明顯的抑制作用。李冬斌等[34]在研究半相合基因腫瘤特異性樹突狀細胞活化的特異性CTL(DCs-CTL)對小鼠黑色素瘤的抑制作用及其移植物抗宿主反應(GVHD)反應中，采用半相合基因鼠來源的DCs-CTLs效應細胞經(jīng)鼠尾靜脈回輸，小鼠腫瘤質(zhì)量減少且均未見明顯GVHD病理變化。

5展望

黑色素瘤是個多因素、多環(huán)節(jié)、多階段的復雜疾病，隨著對黑色素瘤發(fā)病機制認識的不斷加深，近年來，黑色素瘤動物試驗的研究取得了巨大的成果，本研究已列舉了眾多黑色素瘤動物實驗中，中藥、基因靶向研究及免疫研究方面的進展，為其應用于臨床試驗奠定了基礎。但是目前仍存在一些問題有待解決。首先，探索黑色素瘤侵襲轉(zhuǎn)移的分子生物關鍵機制，并尋找阻斷其發(fā)展的關鍵藥物將成為今后研究的熱點之一；其次，實現(xiàn)黑色素瘤的早發(fā)現(xiàn)，早診斷，早治療，在此基礎上探索針對黑色素瘤早期的、敏感的、特異的診斷指標。最后，在藥物的聯(lián)合應用方面值得深入研究，關注藥物的聯(lián)合應用是否進一步提高抗腫瘤效果。這些將成為今后黑色素瘤動物實驗研究的重點。

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[收稿日期]2015-10-10

[中圖分類號]R739.5

[文獻標識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)09-1021-04

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.09.042

[基金項目]2014年內(nèi)蒙古自治區(qū)科技計劃項目(2014 kjt14sf16)

[通信作者]李東霞，E-mail:ldx828@sina.com