陳雪雯 朱紅梅 溫海

(上海市長征醫(yī)院皮膚科 全軍真菌病重點實驗室 上海市醫(yī)學真菌分子生物學重點實驗室，上海 200003)

·論著·

暗孢節(jié)菱孢菌引起面部感染1例及相關研究

陳雪雯 朱紅梅 溫海

(上海市長征醫(yī)院皮膚科 全軍真菌病重點實驗室 上海市醫(yī)學真菌分子生物學重點實驗室，上海 200003)

目的 報道暗孢節(jié)菱孢菌 (Arthriniumphaeospermum)引起的面部皮膚感染1例并進行相關真菌學研究。方法 患者女，29歲，兩頰對稱性浸潤性紅斑數年。皮損直接鏡檢、真菌培養(yǎng)，經形態(tài)觀察、分生鑒定菌種、并進行體外藥敏試驗及利用豚鼠致病性實驗重現組織病理特征。結果 直接鏡檢未見明顯菌絲，體外培養(yǎng)后為單一菌落，經棉蘭染色、小培養(yǎng)、掃描電鏡、分子生物學均鑒定為暗孢節(jié)菱孢菌 (Arthriniumphaeospermum)，均可見典型特征。體外藥敏試驗提示，該菌對卡泊芬凈、米卡芬凈、泊沙康唑、雷夫康唑、伏立康唑、特比萘芬敏感，對伊曲康唑、氟康唑耐藥。豚鼠致病性實驗中，對照組和免疫抑制組豚鼠皮下注射處大體可見膿腫，體表涂抹處大體表現紅斑、丘疹、脫屑，免疫抑制組癥狀持續(xù)較久。皮下注射處較體表涂抹處有明顯的組織病理學改變，可見多核巨細胞包裹菌絲或孢子，伴組織細胞、中性粒細胞、淋巴細胞浸潤。結論 該患者為罕見的暗孢節(jié)菱孢菌 (Arthriniumphaeospermum)引起的皮膚真菌感染。免疫功能對該菌感染所致疾病的臨床過程可能有影響。

暗孢節(jié)菱孢；皮膚真菌??；動物替代試驗

[Chin J Mycol，2016，11(6):357-360]

暗孢節(jié)菱孢菌 (Arthriniumphaeospermum)是一種世界性分布的真菌，宿主涉及毛竹、苔草、蘆葦等56種植物，也可存在于空氣、動物 (包括人)、土壤和植物碎屑、秸稈、青貯飼料和木材，營腐生生活，是一種植物致病菌[1]，迄今鮮見人類致病的報道。1989年Rai MK[2]首次從1例紅斑結節(jié)患者皮膚分離出變種Arthriniumphaeospermumvar.indicum。在國內，1990年、2005年分別由趙玉明等[3]、呂桂霞等[4]報道該菌引起頭皮感染、臀部感染各1例。我們近日診治1例面部感染患者，研究報道如下。

1 材料和方法

1.1 病歷資料

患者女，29歲，病史10 a。初發(fā)時表現為左面部反復紅斑，錢幣大小，上附有黃色結痂。病情反復，生理期前加重，5 a后發(fā)展至右側面部，其后病情反復，期間曾外院間斷口服伊曲康唑、特比萘芬、雷公藤、煙酰胺、西替利嗪，外用0.1%他克莫司軟膏、丁氫化可的松軟膏，自血療法、激素針等治療。目前皮損由錢幣大小發(fā)展至雙側面頰大面積邊界清楚的紅斑伴結痂、隆起、瘙癢來我院就診。

?？撇轶w：雙側面部可見對稱浸潤性紅斑 (見圖1a～b)。紅斑邊界清楚、高出皮面、油膩感，表面呈黃色多角形結痂，觸之略硬，皮溫升高，無明顯壓痛感。查血常規(guī)、肝腎功能、免疫指標未見異常。

1.2 標本采集

皮損邊緣及痂皮取材，用10%KOH制片行直接鏡檢。

1.3 真菌培養(yǎng)方法

將皮損規(guī)范操作,取適量皮屑并接種到沙氏培養(yǎng)基。另將菌株接種于沙氏培養(yǎng)管，培養(yǎng)2周后將菌落轉種到SDA、PDA、OA培養(yǎng)基上，分別置于28℃、30℃、35℃、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，連續(xù)觀察菌落變化。

1.4 觀察菌絲

于載玻片上滴加1滴乳酸石炭酸棉蘭染色液，從菌落中挑取適量菌絲放入載玻片上的液滴中，將菌絲分散開，蓋上蓋玻片，置于顯微鏡下觀察。

1.5 小培養(yǎng)觀察

將該菌用小培養(yǎng)的方法用OA在玻片上直接培養(yǎng)，30 d產孢后在掃描顯微鏡下觀察。

1.6 分子鑒定

菌株培養(yǎng)7 d后，用艾德萊試劑盒提取真菌DNA，PCR法擴增真菌核糖體RNA基因轉錄間隔2區(qū)域，真菌通用引物：ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')，ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)，由生工生物技術有限公司合成。PCR反應體系：總體積50 μL，含EasyTap MIX 25 μL (北京全式金生物技術有限公司)，ITS4 (10 uM)2 μL，ITS5 (10 uM)2 μL，模板1.5 μL，ddH2O 19.5 μL。PCR反應條件：95℃ 3 min，95℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 1 min共33個循環(huán)，最后72℃延伸5 min，之后12℃保持。取5 μL PCR產物于2%瓊脂糖凝膠在120 V電壓下電泳30 min，用溴化乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)下觀察。PCR產物的雙向序列測定委托美吉生物公司協(xié)助完成。

1.7 真菌藥敏試驗

將在OA上28℃培養(yǎng)30 d的產孢菌落用吐溫生理鹽水取適量孢子，用含MOPS的1640培養(yǎng)液稀釋，根據M38-A2[5]，將其稀釋成0.6×104CFU/mL菌液，加入100 μL/孔到包被好12種一定濃度梯度[6]的抗真菌藥物的單克隆培養(yǎng)板中。將Candidaparapsilosis(ATCC 22019)作為標準菌株。因樣本菌株在28℃生長最好，且在35℃不生長，故將其置于28℃培養(yǎng)，48 h后觀察，Candidaparapsilosis置于35℃ 48 h后觀察，得出MIC值。

1.8 動物實驗

選健康豚鼠18只，450～500 g，雌雄不限，均分為2組，A組為對照組，不做預處理；B組為處理組，實驗前4 d和前2 d用倍他米松注射液7 mg·kg-1·d-1股部肌肉注射；且接種后，給予地塞米松注射液7.5 mg/kg腹腔注射，隔日1次，共4次。實驗開始當天，背部備皮，做好自體處理區(qū)域劃分。常規(guī)消毒后，右側用無菌膠布黏貼撕去，重復4次至肉眼可見點狀出血為宜，涂布菌懸液，空白對照組涂以生理鹽水；左側4處實驗區(qū)，間隔皮下注射真菌孢子、無菌生理鹽水。

將培養(yǎng)的菌株用0.9%的無菌生理鹽水配制成菌懸液，皮下注射、表皮涂布2種方法每處接種108/mL菌懸液100 μL于豚鼠[7]背部上皮。每天觀察皮損狀況，包括：紅斑、脫屑、結痂、毛發(fā)生長情況。于感染后第12天，第21天處死動物，取材，組織切片 (HE染色、PAS染色)。

2 結 果

2.1 直接鏡檢

2次皮損邊緣及痂皮直接鏡檢，用10%KOH制片均未見明顯菌絲。

2.2 真菌培養(yǎng)

將皮損規(guī)范操作,取適量皮屑并接種到沙氏培養(yǎng)基,1周可見菌落 (見圖2a)。將其轉種于SDA、PDA、OA分別置于28℃、30℃、35℃、37℃培養(yǎng)，7 d后，該菌在三種培養(yǎng)基生長情況見下表 (見表1)。1 d萌發(fā)，初為絲狀白色菌落，1周左右可見橙黃色色素產生 (圖2b～c為PDA培養(yǎng)1周結果，圖3a～b為不同溫度下該菌株在SDA培養(yǎng)1周結果)。

表1 該暗孢節(jié)菱孢菌在不同培養(yǎng)基不同溫度下的生長情況記錄

Tab.1 The growth of obtained stain on different medium at different temperature

OAPDASDA萌發(fā)1d1d2d產孢30d48d60d28℃6.1cm4.1cm7.2cm30℃5.7cm3.8cm6.9cm35℃未生長未生長未生長37℃未生長未生長未生長

2.3 顯微鏡

棉蘭染色鏡下可見透明管狀分隔菌絲 (見圖4a～b)，90°側支。分生孢子從葫蘆形母細胞上單個產生，垂直于菌絲生長。棉蘭染色及小培養(yǎng)均可見暗棕色橢圓形晶狀體樣孢子，中間可見赤道痕，可見出芽時從該處向兩端凸起，為該菌鑒別特征 (見圖4c～d)。

2.4 掃描顯微鏡

可見垂直分支的分隔菌絲及特征性孢子：分生孢子呈雙凸透鏡樣，(8～12)×(5～7) μm，可見赤道部位發(fā)芽裂隙，為該菌鑒別特征 (見圖5a～c)。

2.5 分子測序及鑒定

ITS區(qū)測序結果提示：Arthriniumphaeospermum(詳見http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi#alnHdr_162285923：blastn suite：RID-F6SBB06R01R；Query ID：lcl|Query_128499)。

2.6 體外藥敏試驗

48 h后觀察，得出MIC值，分別為卡泊芬凈0.5 μg/mL，米卡芬凈0.25 μg/mL，泊沙康唑0.5 μg/mL，雷夫康唑0.031 25 μg/mL，伏立康唑0.25 μg/mL，特比萘芬2 μg/mL，伊曲康唑>64 μg/mL，氟康唑>64 μg/mL。

2.7 動物實驗

處理組和對照組均可見皮損。表皮涂菌處：免疫抑制組以脫屑為主，對照組以紅斑丘疹為主 (見圖6a～b)。皮下注射處 (見圖6c～f)：均表現為浸潤性紅斑、脫毛、小結節(jié)、灰白色皮下膿腫，處理組較對照組皮損持續(xù)時間久、膿腫較大、觸之浸潤更明顯。病理結果提示兩組都有病理性浸潤，PAS染色可見紫紅色分隔菌絲，橢球形棕褐色孢子，可見大量組織細胞、多核巨細胞、中性粒細胞和淋巴細胞浸潤。

2.8 治療

該患者對伊曲康唑口服200 mg/次，2次/d，7 d/月，5個月后效果見圖7a～b。此后隨訪9個月，多次真菌鏡檢和真菌培養(yǎng)，未見陽性結果。

3 討 論

暗孢節(jié)菱孢菌 (Arthriniumphaeospermum)是一種植物寄生菌，目前植物致病報道多見，而人種致病報道僅4例[1-4]。

該患者5次皮損鏡檢都未見菌絲，筆者認為與以下因素有關：①患者病史時間長，可能皮膚屏障結構改變有關，如表皮萎縮。②患者一直間斷服用特比萘芬或者伊曲康唑，也曾用雷公藤，外用激素軟膏，導致表皮真菌難以查出。③有文獻報道[3]其破壞毛囊皮脂腺，該暗孢節(jié)菱孢菌可能親脂，入侵后在皮膚較深層，考慮體表為反應性表現可能，最好結合病理學依據，而該患者皮損部位為面部，拒絕行病理活檢。

體外藥敏試驗顯示伊曲康唑耐藥，而臨床上，該患者對伊曲康唑口服200 mg/次，2次/d，7 d/月，5個月后治療有明顯效果?？紤]藥物在體內外不同內環(huán)境下起作用敏感性不用。國內呂桂霞等[4]報道1例暗孢節(jié)菱孢菌感染，其也對伊曲康唑耐藥。1965年Ellis MB[8]的藥敏試驗結果是AMB 0.13 μg/mL、5-FC 256 μg/mL、FLZ 128 μg/mL、ITZ 0.5 μg/mL、KTZ 2 μg/mL、MCZ 2 μg/mL，與本研究結果不同。考慮年限較遠，藥物更新，菌株與人種進化過程中各種因素所致藥物敏感性發(fā)生變化。

該菌在三種培養(yǎng)基中28℃生長狀態(tài)最好，在OA生長速度最快，在PDA產色素最早。35℃、37℃培養(yǎng)1周后菌落幾乎不生長，不產色素。與國內趙玉明等[3]的37℃生長對照的結果不一致，與國外Rai MK[2]結果一致。由此可推測該菌可能不引起深部感染。

我們進行了動物實驗模擬體表感染模型，處理組和對照組均能被該菌感染，且免疫抑制組感染持續(xù)時間較對照組久，皮損更明顯。結合該患者在皮損嚴重時常有骨痛主訴，且在抗真菌治療皮損改善時緩解，考慮免疫狀況與該菌入侵并導致感染可能相關，具體機制還需進一步探究。

圖1 a～b.患者初次就診臨床照片 圖2 a.將皮損接種于SDA 28℃培養(yǎng)7 d，可見兩管為同一種菌；b～c.將菌株接種于PDA 28℃培養(yǎng)7 d，可見白色絮狀菌絲和橙黃色色素 圖3 a～b.28℃、30℃、35℃、37℃下，該菌株在SDA培養(yǎng)1周結果：28℃、30℃生長良好，并能產橙色色素；而在35℃、37℃不生長 圖4 a～b.棉蘭染色后，可見透明管狀分隔菌絲由燒瓶狀母細胞垂直長出 (100×);c～d.可見暗棕色晶狀體樣孢子，簇狀分布，中央可見色澤較淺的赤道裂稍突出表面 (100×、40×) 圖5 a～c.簇狀分布的孢子,呈雙凸晶狀體形，可見孢子中央赤道痕均勻凸起于孢子一周;菌絲分隔，且垂直于主干分支 圖6 a～b.分別為對照組和處理組豚鼠感染后第12天皮損照片;c～f.分別為實驗的皮下注射組第21天大體圖、化膿處棉蘭染色直接鏡檢圖、病理切片HE、PAS染色40× 圖7 a～b.伊曲康唑口服200 mg/次，2次/d，7 d/月，5個月后皮損明顯好轉

Fig.1 a-b.Clinical manifestation during the patient's initial clinic visit Fig.2 a.The write flocculent colony on SDA for 2 weeks at 28℃;b-c.The write flocculent colony and orange pigment on PDA after 7 days at 28℃ Fig.3 a-c.The stain grew on SDA after 7 days respectively at 28℃,30℃,35℃,37℃,it grew well with chromogenesis at 28℃,30℃,and almost didn't grow at 35℃,37℃ Fig.4 a-b.Conidiophores arised singly from a lageniform cell,with hyaline septa;c-d.With cluster distribution,lenticular dark brown conidia provided with an equatorial germ slit,according to microculture and Medan staining Fig.5 a-c.With cluster distribution,lenticular conidia provided with an equatorial germ slit around,hypha with septa and vertical growing form median stem Fig.6 a-b.These areguinea pigs skin lesion photos respectivelyfrom control group and the experimental group 12 days after infected;c-f.Clinical manifestation,direct microscopy of suppurated lesions,and pathologic results of HE,PAS (40×) from the same lesion of the experimental group Fig.7 a-b.After 5-month treatment of oral itraconazole 200 mg/done week a month,lesions were obviously impoved

目前，文獻檢索國內外對于暗孢節(jié)菱孢菌的報道僅4例，且人群致病的研究甚少，流行病學資料不全，對于該菌的毒力、致病力等危害了解不多。就目前報道的案例表明，該菌主要引起淺表感染，表現不一。結合本例，目前常用的抗真菌藥物治療作用明顯，但易反復，考慮與患者前期多次間斷使用各種藥物包括抗真菌藥物有關，也與機體免疫狀態(tài)、藥物劑量、使用方法等有關[9]，也不排除目前國內抗真菌藥物的人群暴露較廣，出現耐藥情況。臨床醫(yī)生應對一些少見菌株致病提高警惕，積極深入研究、治療、隨訪。

[1] Kirk PM.Arthrinium phaeospermum[J].IMI Descriptions of Fungi and Bacteria，1991，1053:1-2.

[2] Rai MK.Mycosis in man due toArthriniumphaeospermumvar.indicum.First case report[J].Mycoses ，1989，32(9):472-475.

[3] 趙玉明，鄧成儒，陳曦，等.我國首次發(fā)現暗孢節(jié)菱孢菌所致皮膚真菌病：一株新的條件致病性真菌[J].真菌學報，1990，9(3)：232-235.

[4] 呂桂霞，沈永年，陳偉，等.暗孢節(jié)菱孢引起皮膚感染一例[J].中華皮膚科雜志，2005,38(4):232-234.

[5] Clinical and Laboratory Standards Institute.Referencemethodforbroth dilution antifungal susceptibility testing of filamentous fungi,2nded.Approved standard.CLSI documentM38-A2[S].Clinical and Laboratory Standards Institute,Wayne,PA,2008.

[6] Deng S,de Hoog GS,BadaliH,et al.Invitroantifungal susceptibility ofCladophialophoracarrionii,an agent of human chromoblastomycosis[J].Antimicrob Agents Chemother.2013 ，57(4):1974-1977.

[7] Shimamura T1,Kubota N,Shibuya K.Animal Model of Dematophytosis[J].J Biomed Biotechnol,2011,2012(1):180-197.

[8] Ellis MB.Dematiaceous hyphomycetes[M].6th ed.Oxfordshire ，CABI Publishing，1965:1-46.

[9] 廖萬清，顧菊林.真菌耐藥的現狀與對策[J].藥學服務與研究,2006,6(3):161-164.

[本文編輯] 王 飛

·短篇論著·

A case of cutaneous mycosis caused byArthriniumphaeospermum

CHEN Xue-wen,ZHU Hong-mei,WEN Hai

(PLAKeyLaboratoryofFungalDiseasesandShanghaiKeyLaboratoryofMolecularMedicalMycology,DepartmentofDermatology,ChangzhengHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200003,China)

Objective Report of a case of fungal infection caused byArthriniumphaeospermumand the relevant mycological study.Methods A-29-woman had suffered symmertrical infiltrative erythema for several years.Direct microscopy,culture,microculture,strain identification,drug susceptibility testinvitro,animal experiment were performed.Results While direct microscopy was negative,culture was positive andArthriniumphaeospermumwas identified.The typical characteristics of this isolate were observed with Medan staining,microculture and scanning electron microscopy.This isolate was resistant to itraconazole and fluconazole,but was susceptible to caspofungin,micafungin,posaconazole,ravuconazole,voriconazole and terbinafine.Animal experiment shows the veryArthriniumphaeospermumwas able to cause disease.Conclusion This was a rare dermatomycosis caused byArthriniumphaeospermum.Mycological examinations,drug susceptibility testinvitro,and animal experiment would have active guidance meaning and applied value for further cases.Abnormal immune status might be a risk factor for such cases.

Arthriniumphaeospermum；dermatomycoses;animal testing alternatives

國家自然科學基金 (31470252，81271800，31270181)

陳雪雯，女 (漢族)，碩士研究生在讀.E-mail:snowflychen@163.com

溫海,E-mail:wenhaipfk@126.com;朱紅梅,E-mail:hmzhu_cn@163.com

R 756.2

A

1673-3827(2016)11-0357-04

2016-10-01