實時熒光定量PCR在食品微生物檢測中的應用和質(zhì)量控制

◎莫怡沖

（汕尾市疾病預防控制中心，廣東 汕尾 516600）

實時熒光定量PCR在食品微生物檢測中的應用和質(zhì)量控制

◎莫怡沖

（汕尾市疾病預防控制中心，廣東 汕尾 516600）

通過概述實時熒光定量PCR技術(shù)的原理、特點，以及其在食品微生物檢測、轉(zhuǎn)基因食品等領(lǐng)域的應用和質(zhì)量控制情況，旨在為食品安全監(jiān)測提供依據(jù)。

實時熒光定量PCR技術(shù)；定量檢測；食品微生物；質(zhì)量控制

隨著人民生活水平的提高，對食品安全要求越來越高，新版《食品安全法》以“四個最嚴”標準，保障人民群眾舌尖上的安全。目前，廣泛應用物理、化學、儀器等檢測食品方法，由于存在某些局限，無法高效、快速、準確地滿足現(xiàn)代食品安全檢測需要，特別是在微生物領(lǐng)域，傳統(tǒng)的檢測方法無法勝任快速精準的檢測要求。

1　實時熒光定量PCR技術(shù)在食品微生物檢測和質(zhì)量控制中的應用

1.1食品中致病菌的檢測

1.1.1坂歧腸桿菌

坂歧腸桿菌（Enterobacter sakazakii）是運動型的無孢子、兼性厭氧革蘭陰性桿菌，最近幾年嬰幼兒配方奶粉中坂歧腸桿菌的檢測已成為世界矚目的焦點。

1.1.2沙門菌

沙門菌（Salmonella）為革蘭陰性無芽孢桿菌，由其引起的食物中毒占世界食物中毒病例之首，是食品安全與質(zhì)量檢測的一項重要指標。

1.1.3副溶血性弧菌

副溶血性弧菌（Vibrio Parahemolyticus）是一種嗜鹽性細菌。主要來源于海產(chǎn)品，如墨魚、海蝦、海蜇等，以及含鹽分較高的腌制食品，如咸菜、腌肉等。

1.1.4金黃色葡萄球菌

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是引發(fā)多種類型感染和食物中毒的病原菌。RTQ-PCR技術(shù)為快速準確地檢測食品中金黃色葡萄球菌及其腸毒素提供了可靠的方法。

1.2 實時熒光定量PCR技術(shù)檢測中的質(zhì)量控制

1.2.1質(zhì)量指標

（1）特異性。使用的試劑必須符合國家藥監(jiān)局所批的試劑，序列的特異性必須通過專家所認證的。

（2）敏感性。實驗中加入模板的量是微量的，有的是3 μ L，有的是5 μ L，常規(guī)的PCR反應體系一般是30～50 μ L（以25 μ L為主）。在30～50 μ L的反應體系下，一般模板的量在5 μ L就足夠了。如果從5 μ L變成了10 μ L，雖然可以提高1倍的敏感性，但是里面的干擾物質(zhì)會相應增加，影響結(jié)果的準確性。

（3）重復性。影響重復性的因素有很多。①儀器間的差異。要及時對儀器進行維護、保養(yǎng)。②輔助儀器如離心機、移液器等，對于微量的實驗比較重要。③實驗室環(huán)境包括空間環(huán)境和結(jié)構(gòu)環(huán)境。為了防止污染，盡可能做一個物理的分割，也就是核酸的提取、擴增和試劑配制要通過物理分割的方式分開。

1.2.2質(zhì)量環(huán)節(jié)

（1）核酸提取方法（核酸丟失）的影響。目前，核酸提取的方法有很多，傳統(tǒng)的核酸抽提方法主要包括異硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法、堿抽提法、溴化十六烷基三甲銨（CTAB）抽提法、溴化乙啶-氯化艷（EtBr-CsCl）梯度離心法、寡聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸[Oligo（dT）]-纖維素層析法、核酸固相抽提法、多效生物分子抽提法及自動化抽提系統(tǒng)等，目前最常用的是熱裂解的方法。

（2）其他影響因素。當然對試驗結(jié)果的影響還有包括儀器的差異、不同采光的原理、光源的強度。這里要強調(diào)光源的強度，因為熒光PCR儀器是通過光源照射以后來激發(fā)檢測的，那么該光源是有一定壽命的，如果光源使用時間比較長，光亮度不夠，那么檢測的信號也相應會比較弱一些。

1.2.3污染與防污染措施

實驗室防污染主要是：①防止核酸提取過程的外泄；②在試劑配制的過程中防止標準品的污染；③防止產(chǎn)物的外泄。實驗室要嚴格分區(qū)管理，就是物理隔離、核酸提取和試劑配制不能在一起，試劑配制要盡可能在核酸提取之前，不要把核酸提取的物品帶到試劑配制室中。

其次，要嚴格進行實驗室通風，一定要有對流風。一些實驗室為了達到通風目的，可以安裝排風扇。實驗室的通風是防污染非常重要的方法。不要指望把污染物質(zhì)給清掉，而是應該把它從實驗室趕走。通過通風的方式把實驗室中的污染物質(zhì)帶走是最有效的方法。對于實驗室設計，最早的設計是一個閉風的狀態(tài)，現(xiàn)在已成為一種通風的狀態(tài)。

2　實時熒光定量PCR技術(shù)對轉(zhuǎn)基因食品檢測的應用

當前，國際社會對轉(zhuǎn)基因食品檢測技術(shù)路線主要有2條：一是對外源基因表達產(chǎn)物蛋白質(zhì)進行檢測；二是直接檢測外源基因DNA。隨檢測手段不斷提高，對食品轉(zhuǎn)基因檢測已從定性提高到定量水平。

近年來，有許多利用RT-PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因食品文獻報道，陳穎等采用實時熒光定量PCR技術(shù)，通過使用特異引物和探針，對玉米中內(nèi)源基因lnvertase、轉(zhuǎn)基因玉米Mon810、Event176外源基因進行定量檢測，由此建立商業(yè)化轉(zhuǎn)基因玉米Mon 810（YieldGard）和Event176（Maximizer）定量PCR檢測方法。該法檢測靈敏度可達0.O1%，是國際上設定轉(zhuǎn)基因最低限量100倍。Hagen等研究表明，熒光定量PCR法可檢測出包括豆腐等在內(nèi)豆制品中轉(zhuǎn)基因成分含量；鄧鴻鈴等針對食用油脂中DNA含量極低、DNA序列片段短、破壞嚴重等特點，建立食用油脂DNA提取方法，通過實時熒光PCR檢測出大豆內(nèi)源基因及外源抗除草劑基因，為食用油脂進行核酸類生物性檢測提供一種快捷有效方法。

3　展望

PCR技術(shù)在食品檢測的實際應用中，表現(xiàn)出靈敏度高、速度快、特異性強、簡便和高效等特點，為食品檢測技術(shù)的發(fā)展提供了有力的技術(shù)支持，在食品致病菌、食品中有效成分、食品成分種類和轉(zhuǎn)基因食品等方面的檢測中具有重要的作用。但PCR技術(shù)在實際應用中也表現(xiàn)出一些缺陷，但相信隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展，各項新技術(shù)與PCR技術(shù)的有機結(jié)合，以及PCR技術(shù)的進一步完善和發(fā)展，其必將會得到更加普遍的推廣和發(fā)揮更大的效用，并在食品檢測和研究領(lǐng)域開辟一個新的應用時代。

[1]翁文川，焦 紅，王方金，等.食品中副溶血弧菌熒光定量PCR方法快速檢測[J].中國公共衛(wèi)生，2005，21（11）：1359-1362.

[2張 霞，高旗利，羅茂凰，等.實時熒光PCR 對奶粉中坂崎腸桿菌的檢測[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2006，16（2）：214-216.

Application and Quality Control of Real-time Fluorescent Quantitative PCR for Detection Microbes in Foods

Mo Yichong
（Shanwei City Center for Disease Control and Prevention， Shanwei 516600， China）

The principles and characteristics of real-time fluorescence quantitative PCR technology，and its application and quality control statu of food microbiology detection， genetically modified food were reviewed， in order to provide the basis for food safety monitoring.

Real-time fluorescence quantitative PCR； Quantitative detection； Food microbe； Quality control

TS207.4

10.16736/j.cnki.cn41-1434/ts.2016.08.033