犬瘟熱的臨床診斷技術(shù)與疫苗研究進(jìn)展

劉天宇 ，王 丞 ，金海林 ，趙麗娟 ，趙 權(quán) ，2

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，吉林 長春 130118；2.長春科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，吉林 長春 130600）

犬瘟熱的臨床診斷技術(shù)與疫苗研究進(jìn)展

劉天宇1，王 丞1，金海林1，趙麗娟1，趙 權(quán)1，2

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，吉林 長春 130118；2.長春科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，吉林 長春 130600）

犬瘟熱是由犬瘟熱病毒引起的犬科、鼬科和浣熊科等動(dòng)物的一種高度接觸性烈性傳染病。該病在臨床上可根據(jù)臨床癥狀和流行特點(diǎn)作出初步診斷，結(jié)合病原學(xué)檢查和血清學(xué)診斷即可確診。目前一直缺少治療犬瘟熱的有效藥物，所以犬瘟熱的預(yù)防主要依靠接種疫苗。結(jié)合已有研究報(bào)道，總結(jié)了犬瘟熱的臨床診斷技術(shù)和犬瘟熱疫苗方面的研究進(jìn)展，以期為獸醫(yī)同仁提供參考。

犬瘟熱；臨床診斷；疫苗；研究進(jìn)展

犬瘟熱病毒（canine distemper virus，CDV）屬副黏病毒科麻疹病毒屬成員，目前食肉目各科動(dòng)物均有感染報(bào)道，但主要感染犬、狼、貂、狐等動(dòng)物，其發(fā)病率、死亡率都較高，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失［1］。近20年來，隨著動(dòng)植物資源的變化，加上病毒自身的不斷演變，CDV最初只感染犬科動(dòng)物，到現(xiàn)在可以感染貓科、鼬科、熊貓科等動(dòng)物［2］。甚至已經(jīng)感染非人靈長類動(dòng)物了，比如已有我國的獼猴和日本的食蟹猴感染該病毒的報(bào)道［3-4］，并且在人的變形性骨炎患者中也檢測到了CDV的核酸［5］。這些都提示著犬瘟熱的防控形勢(shì)變得越來越復(fù)雜，該文就當(dāng)前犬瘟熱臨床診斷技術(shù)和疫苗研究進(jìn)展進(jìn)行介紹。

1 犬瘟熱的診斷技術(shù)

通常根據(jù)臨床癥狀和流行病學(xué)特點(diǎn)，即可以對(duì)犬瘟熱作出初步判斷。但犬瘟熱有時(shí)會(huì)有混合感染，所以只有臨床檢查和實(shí)驗(yàn)室檢查相結(jié)合才能確診該病。

1.1 常規(guī)檢測與診斷 犬瘟熱常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室檢測方法主要有病原學(xué)檢查和血清學(xué)檢測診斷。其中，血清學(xué)檢查在實(shí)驗(yàn)室中比較可靠，主要包括補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)、微量血清中和實(shí)驗(yàn)、免疫熒光試驗(yàn)等。特別是免疫熒光試驗(yàn)，目前是國際通用的犬瘟熱診斷方法。

1.2 分子生物學(xué)檢測與診斷 犬瘟熱診斷比較困難，尤其是早期確診更困難，加之CDV發(fā)生變異等都加大了診斷的難度。但隨著我國的分子生物學(xué)的發(fā)展，先后建立了核酸雜交技術(shù)等診斷技術(shù)，這些方法要比免疫學(xué)方法的敏感性和特異性高很多，尤其是在早期，臨床癥狀不明顯，尚未產(chǎn)生免疫應(yīng)答的情況下，用分子生物學(xué)檢查可以很早地給出診斷結(jié)果。

1.2.1 核酸雜交：核酸雜交是一種現(xiàn)代分子生物學(xué)的檢測技術(shù)，用放射性或非放射性物質(zhì)標(biāo)記已知序列的單鏈DNA或RNA片段（探針），利用已知片段檢測樣品中的DNA或RNA分子的特定序列（靶序列），之后再經(jīng)過放射自顯影或顯色反應(yīng)將與探針特異性結(jié)合的靶序列顯示出來，其敏感性高、特異性強(qiáng)。該方法的關(guān)鍵是要制備敏感、穩(wěn)定、特異的核酸探針，最近幾年并沒有專門的相關(guān)報(bào)道。張永霞等［6］人，采用半點(diǎn)雜交技術(shù)對(duì)CDV N基因進(jìn)行了地高辛（DIG）標(biāo)記，制備了cDNA探針，并用該探針檢測疑似病犬，結(jié)果表明該方法比膠體金技術(shù)診斷檢測率高，且摸索出脾臟是該方法最好的檢測樣本。

1.2.2 熒光定量PCR：熒光定量PCR技術(shù)是一種可以快速、實(shí)時(shí)、敏感、準(zhǔn)確地檢測病毒的方法。付運(yùn)星［7］等人，根據(jù) CDV 核衣殼蛋白（NP）基因序列，設(shè)計(jì)合成2對(duì)通用引物和1條通用探針，通過體外轉(zhuǎn)錄構(gòu)建絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)品RNA。對(duì)熒光定量PCR優(yōu)化，建立起一步法熒光定量PCR檢測方法，該方法的敏感性比普通RT-PCR高2個(gè)數(shù)量級(jí)，重復(fù)性良好，不同時(shí)期批間和同一時(shí)期批內(nèi)的變異系數(shù)均在2.0%以下。為犬瘟熱早期診斷提供了新的檢測方法。

1.2.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP））技術(shù)是由日本學(xué)者開發(fā)的，已經(jīng)在許多細(xì)菌性、病毒性和寄生蟲性疾病檢測中得到了廣泛的應(yīng)用。該技術(shù)是一種新的核酸擴(kuò)增方法，可以在等溫條件下短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行核酸擴(kuò)增，具有快速、簡單、高效的特點(diǎn)。與普通PCR相比，不需要模板的變熱，溫度循環(huán)等過程，且不需要任何專門設(shè)備就可以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場的高通量快速檢測，便于在小型醫(yī)院、實(shí)驗(yàn)室、臨床上推廣，因此建立RT-LAMP檢測CDV的方法具有很高的實(shí)用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。胡嘉欣等［8］人采用環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴(kuò)增技術(shù)，針對(duì)犬瘟熱病毒N基因保守區(qū)的8個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)了6條引物進(jìn)行RT-LAMP一步法擴(kuò)增，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化，最終證明，該方法特異性強(qiáng)、敏感度高，操作簡便、快速、便于觀察，適用于門診和現(xiàn)場檢測。

整體而言，隨著最近幾年分子生物學(xué)和免疫學(xué)的發(fā)展和進(jìn)步，犬瘟熱檢測變得越來越準(zhǔn)確、簡單、易行。但每種技術(shù)都有其自己的優(yōu)點(diǎn)、缺點(diǎn)和許多限制因素，所以在進(jìn)行犬瘟檢測時(shí)最好結(jié)合實(shí)際情況，多種方法結(jié)合進(jìn)行，最大提高檢測的準(zhǔn)確和敏感度［9］。

2 犬瘟熱疫苗

預(yù)防犬瘟熱的主要辦法還是接種疫苗，目前用于預(yù)防該病的疫苗主要有甲醛滅活疫苗、減毒活疫苗、基因工程疫苗。

2.1 滅活疫苗 最早的犬瘟熱疫苗就是Puntoni利用福爾馬林滅活感染CDV犬的腦組織，制備的組織滅活疫苗，但采用該疫苗接種犬后，其體內(nèi)中和抗體滴度太小，以致不能有效抵抗強(qiáng)病毒的攻擊。我國的夏咸柱等［10］人，用靜水壓高壓滅活的方法對(duì)CDV進(jìn)行滅活，并加入蜂膠佐劑制備犬瘟熱病毒高壓滅活疫苗。將該疫苗免疫接種CDV易感犬，同時(shí)以用福爾馬林滅活的犬瘟熱病毒滅活疫苗為對(duì)照，進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明：犬瘟熱病毒高壓滅活疫苗安全、可靠，其誘導(dǎo)試驗(yàn)犬所產(chǎn)生中和抗體的能力明顯高于該病毒的福爾馬林滅活苗，臨床應(yīng)用該疫苗對(duì)犬的保護(hù)率達(dá)89%，但由于該疫苗激發(fā)產(chǎn)生的抗體水平下降快，所以現(xiàn)在基本很少使用。

2.2 弱毒疫苗 弱毒活疫苗（modified live vaccine，MLV）是將自然分離的犬源、貂源CDV經(jīng)雞胚、細(xì)胞多次傳代適應(yīng)而致弱，能刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答，且可以誘導(dǎo)免疫記憶和有良好的免疫原性。19世紀(jì)50—60年代，該疫苗研制成功，在當(dāng)時(shí)廣泛應(yīng)用，極大地減少了犬瘟熱的發(fā)生和流行。但該疫苗對(duì)野生動(dòng)物保護(hù)力很低。有研究表明，我國的商業(yè)用疫苗毒株和野毒株在抗原蛋白中存在較大的差異［11］。

隨著我國的分子生物學(xué)和免疫學(xué)的進(jìn)步，出現(xiàn)了許多新型的疫苗，比如基因疫苗、亞單位疫苗、病毒載體疫苗等新型疫苗，都可以刺激機(jī)體產(chǎn)生較高的抵抗力和穩(wěn)定性，但存在著研發(fā)成本高、重復(fù)性差等問題，嚴(yán)重制約疫苗的實(shí)際應(yīng)用，需要進(jìn)一步完善和深入研究。當(dāng)前，流浪犬及寵物犬的數(shù)量急劇增加，且與人類的接觸越來越密切，給自然界中循環(huán)的CDV提供了一個(gè)足夠大的種群以及跨種間傳播的空間［12］。作為國家規(guī)定的二類動(dòng)物傳染病，犬瘟熱很有可能成為繼狂犬病之后重要的傳播給人的疾病，因此，相關(guān)部門、科研工作者和臨床獸醫(yī)應(yīng)高度關(guān)注該病的防控，以促進(jìn)新型疫苗和診斷技術(shù)的開發(fā)與應(yīng)用。

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Research Progress on Clinical Diagnostic Technique and Vaccine Development of Canine Distemper

LIU Tian-yu1，WANG Cheng1，JIN Hai-lin1，ZHAO Li-juan1，ZHAO Quan1，2
（1.College of Animal Science and Technology，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China；2.College of Animal Science and Technology，Changchun Sci-tech University，Changchun 130600，China）

Canine distemper is a highly contagious infectious disease caused by canine distemper virus （CDV）.Animals in Canidae,Mustelidae and Procyonidae are susceptible to CDV.This disease can be preliminary diagnosed by clinical symptoms and epidemiological features and confirmed diagnosed by etiology examination and serodiagnosis.Currently,due to the lack of effective drugs for cure of canine distemper the prevention of this disease mainly dependents on vaccination.We summarized the clinical diagnosis technique of canine distemper disease and the research progress on canine distemper vaccine,so as to provide some references for the veterinarians.

canine distemper；clinical diagnosis；vaccine；research progress

S858.292

A文章順序編號(hào)：1672-5190（2016）12-0103-02

2016－11－28

劉天宇（1990—），男，碩士研究生，主要研究方向?yàn)楝F(xiàn)代獸醫(yī)臨床診斷技術(shù)。

趙權(quán)（1964—），男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)閯?dòng)物寄生蟲病免疫防治。

（責(zé)任編輯：錢英紅）