楊曉軍，李 強(qiáng)△，莊 翔，何金濤，周紅艷，朱 江，謝天鵬，肖 平，榮 昊

（1.四川省腫瘤醫(yī)院胸外科，成都610041；2.四川省腫瘤醫(yī)院科教部，成都610041）

VEGFR基因表達(dá)與接受恩度治療的Ⅲa期非小細(xì)胞肺癌療效相關(guān)性研究*

楊曉軍1，李 強(qiáng)1△，莊 翔1，何金濤1，周紅艷2，朱 江1，謝天鵬1，肖 平1，榮 昊1

（1.四川省腫瘤醫(yī)院胸外科，成都610041；2.四川省腫瘤醫(yī)院科教部，成都610041）

目的：探討Ⅲa期非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者腫瘤組織中血管內(nèi)皮生長因子受體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）mRNA表達(dá)水平與重組人血管內(nèi)皮抑制素注射液（商品名恩度，Endostar）輔助治療療效的相關(guān)性。方法：通過分支DNA－液相芯片法檢測(cè)29例Ⅲa期NSCLC患者組織中VEGFR mRNA表達(dá)水平，分析VEGFR1和VEGFR2基因mRNA表達(dá)水平與手術(shù)后接受恩度聯(lián)合GP方案化療患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。結(jié)果：以1年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率為本研究終點(diǎn)，VEGFR1在復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)范圍4.0%～86.0%，中位表達(dá)48.9%；無復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)范圍16.1%～73.5%，中位表達(dá)52.6%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z＝2.225，P＝0.013）。VEGFR2在無復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)范圍1.0%～93.0%，中位表達(dá)46.9%；復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)范圍11.7%～72.6%，中位表達(dá)36.2%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z＝2.12，P＝0.017）。結(jié)論：Ⅲa期NSCLC腫瘤組織中VEGFR mRNA高表達(dá)的患者在接受恩度輔助治療后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率更低，提示VEGFR mRNA表達(dá)水平可作為恩度的療效預(yù)測(cè)因子，可作為篩選恩度輔助治療獲益人群的指標(biāo)。

非小細(xì)胞肺癌；Ⅲa期；血管內(nèi)皮生長因子受體1；血管內(nèi)皮生長因子受體2；血管內(nèi)皮抑制素

肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占全部肺癌的80%左右，大約30%的NSCLC患者在最初診斷時(shí)已經(jīng)處于局部晚期（Ⅲa期/Ⅲb期），而Ⅲ期NSCLC切除術(shù)后的5年生存率僅為13%～36%，所以Ⅲ期肺癌的治療一直是肺癌治療領(lǐng)域的難點(diǎn)［1－2］。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）被公認(rèn)是最重要的促進(jìn)血管新生的因子之一，其受體VEGFR1、VEGFR2與血管的生成關(guān)系密切，是目前抗血管生成抑制劑的主要靶點(diǎn)［3］。常見的血管抑制劑類藥物有單抗類的貝伐單抗和多靶點(diǎn)的小分子抑制劑索拉菲尼等。重組人血管內(nèi)皮抑制素（恩度）是中國自主研發(fā)的一類新藥，其作用機(jī)理是通過抑制形成血管的內(nèi)皮細(xì)胞遷移來達(dá)到抑制腫瘤新生血管的生成，從而阻斷了腫瘤的營養(yǎng)供給，達(dá)到抑制腫瘤增殖或轉(zhuǎn)移目的。作為一種血管抑制類新生物制品，該藥已經(jīng)作為聯(lián)合化療用藥廣泛應(yīng)用于晚期肺癌的綜合治療，也為Ⅲa期肺癌的輔助治療帶來了一定的進(jìn)展。

恩度通過誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，細(xì)胞周期阻滯等來破壞腫瘤中的血管結(jié)構(gòu)，抑制腫瘤血管的生成，從而切斷腫瘤的血液供應(yīng)來達(dá)到抑制腫瘤的目的。所以恩度潛在的療效預(yù)測(cè)因子可能與血管內(nèi)皮生長因子受體相關(guān)，即VEGFR基因mRNA表達(dá)也許能預(yù)測(cè)恩度的療效。因此，本研究擬對(duì)接受含恩度治療的Ⅲa期非小細(xì)胞肺癌患者進(jìn)行VEGFR基因mRNA表達(dá)水平的研究，以1年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率為終點(diǎn)評(píng)價(jià)指標(biāo)［3］，探尋VEGFR基因mRNA表達(dá)水平與恩度治療療效的相關(guān)性，為Ⅲa期肺癌患者的個(gè)性化輔助治療提供幫助。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2011年11月至2013年3月就診于四川省腫瘤醫(yī)院胸外科，經(jīng)過病理學(xué)及影像學(xué)確診為Ⅲa期的NSCLC患者29例，年齡42～80歲，中位年齡60歲。腺癌18例，鱗癌9例，腺鱗癌2例；男性19例，女性10例。所有患者行根治性手術(shù)，患者身體狀況評(píng)分ECOG 0～1，既往未接受過放化療，術(shù)后輔助治療前檢查結(jié)果證實(shí)患者的血常規(guī)、肝功能、腎功能及心臟功能等均在正常范圍值內(nèi)。術(shù)后采用吉西他濱（1 250mg/m2，d1）+順鉑（80～120mg/m2，d1）+恩度（7.5mg/m2，d1－14d）方案化療。化療方案的周期間隔21天，共進(jìn)行4個(gè)周期化療。

1.2 方法

1.2.1 檢測(cè)腫瘤組織中VEGFR mRNA表達(dá)水平

采用分支DNA－液相芯片技術(shù)。所有患者獲取的腫瘤石蠟塊組織進(jìn)行VEGFR mRNA表達(dá)檢測(cè)：1）標(biāo)本用75%乙醇固定，取適量樣本加入裂解液，56℃下裂解反應(yīng)2小時(shí)；2）將樣本裂解液轉(zhuǎn)移至孵育板上，加入支持探針－微球、支持延伸探針、緩沖液，55℃震蕩孵育過夜；3）次日將孵育板放在磁力架上1分鐘，此時(shí)磁性微球聚集在底部，吸取棄去上清；4）加入洗滌液，震蕩洗滌1分鐘，孵育板放在磁力架上1分鐘，吸取棄去上清，重復(fù)洗3次；5）加入擴(kuò)增延伸探針和標(biāo)記探針，50℃震蕩反應(yīng)1小時(shí)；6）孵育板放在磁力架上1分鐘，吸取棄去上清，用洗滌液洗2次；7）加入鏈霉親和素－藻紅蛋白，50℃震蕩反應(yīng)30分鐘；8）孵育板放在磁力架上1分鐘，吸取棄去上清，用洗滌液洗2次；9）加入洗滌液，震蕩5分鐘，于Luminex閱讀儀上讀取數(shù)據(jù)；10）數(shù)據(jù)分析，得出檢測(cè)結(jié)果。

1.2.2 檢測(cè)結(jié)果的表現(xiàn)形式及判定 患者的基因表達(dá)水平檢測(cè)數(shù)據(jù)顯示的百分比為患者該基因表達(dá)水平在同類癌種人群中所處的位置，即所得的數(shù)值是患者基因表達(dá)水平在整個(gè)肺癌人群中的分布情況，以表明該患者在整個(gè)肺癌人群中處于怎樣的水平，可劃分為低、中、高三個(gè)表達(dá)水平，采用四分位法且合并，＜37.5%為低表達(dá)；37.5%～62.5%為中表達(dá)；＞62.5%為高表達(dá)，參考益善生物檢測(cè)人群數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)庫為數(shù)千例的中國肺癌人群數(shù)據(jù)庫。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

以1年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率為研究終點(diǎn)，出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的患者稱為復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組，而無復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的患者稱為無復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組，用非參數(shù)檢驗(yàn)法比較VEGFR1和VEGFR2在復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組與非復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組的表達(dá)差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即采用計(jì)數(shù)資料t檢驗(yàn)，應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)P＜0.05，均為雙側(cè)檢驗(yàn)有意義。

2 結(jié) 果

2.1 VEGFR1和VEGFR2基因m RNA表達(dá)水平

在29例Ⅲa期NSCLC患者腫瘤組織樣本檢測(cè)了VEGFR1和VEGFR2基因的mRNA表達(dá)水平。VEGFR1低表達(dá)11例（37.9%），中表達(dá)8例（27.6%），高表達(dá)10例（34.5%）。VEGFR2低表達(dá)13例（44.8%），中表達(dá)10例（34.5%），高表達(dá)6例（20.7%）。

2.2 VEGFR1和VEGFR2基因mRNA表達(dá)與恩度療效的相關(guān)性

以1年復(fù)發(fā)率為療效評(píng)估指標(biāo)，隨訪期內(nèi)，有7例（24.1%）出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，其中復(fù)發(fā)4例，腦轉(zhuǎn)移2例，骨轉(zhuǎn)移1例。VEGFR1在復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)范圍4.0%～86.0%，中位表達(dá)48.9%；無復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)范圍16.1%～73.5%，中位表達(dá)52.6%，VEGFR1在復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組和無復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組中表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z＝2.225，P＝0.013）。VEGFR2在復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)范圍11.7%～72.6%，中位表達(dá)36.2%；無復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)范圍1.0%～93.0%，中位表達(dá)46.9%；VEGFR2在復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組和無復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組中表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z＝2.12，P＝0.017）。

圖1 VEGFR1 mRNA在無復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)水平

圖2 VEGFR2 mRNA在無復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)水平

3 討 論

雖然輔助治療可能消滅殘存的微小轉(zhuǎn)移病灶，減少腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的機(jī)會(huì)，但是根據(jù)臨床結(jié)果顯示，術(shù)后接受輔助治療的腫瘤患者的治療有效率仍然有限，多數(shù)患者接受的化療療效甚微，而且有時(shí)毒副作用對(duì)患者會(huì)產(chǎn)生不良影響。所以，尋找藥物療效預(yù)測(cè)的生物標(biāo)記從而選擇患者接受合適的治療，在提高治療有效率的同時(shí)，盡量減少不必要的化療毒副作用的困擾是十分有意義的。近年來，藥物遺傳學(xué)和藥物基因組學(xué)在化療藥物作用機(jī)制等方面的研究取得了突破性進(jìn)展，相關(guān)的臨床研究也不斷深入。先通過相關(guān)基因的檢測(cè)，再根據(jù)檢測(cè)結(jié)果選擇合適的藥物進(jìn)行個(gè)體化治療，或?qū)⒊蔀槟[瘤治療的一種發(fā)展趨勢(shì)。

腫瘤生長需要依賴腫瘤血管的生成，所以通過抑制腫瘤新生血管可以達(dá)到控制腫瘤的目的。VEGF是腫瘤新生血管形成的最有效和最特異的因子，它可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖，增加微靜脈和小靜脈的通透性，VEGF表達(dá)在腫瘤生長和轉(zhuǎn)移中具有十分重要的作用。VEGFR是VEGF的受體，VEGF和VEGFR結(jié)合后可引發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞的一系列變化，促進(jìn)腫瘤血管生成、浸潤和轉(zhuǎn)移。療效預(yù)測(cè)方面，VEGFR1 mRNA表達(dá)水平檢測(cè)對(duì)結(jié)直腸癌患者接受抗血管生成抑制劑治療具有明顯的指導(dǎo)意義。Dan等［4］一項(xiàng)對(duì)接受貝伐單抗聯(lián)合化療治療的局部直腸癌患者的研究中，發(fā)現(xiàn)血漿可溶性VEGFR1水平（sVEGFR1）與接受貝伐單抗聯(lián)合放化療的新輔助治療后的原發(fā)灶縮小和副作用的發(fā)展相關(guān)，推測(cè)血漿中sVEGFR1的表達(dá)水平是貝伐單抗和/或新輔助治療中細(xì)胞毒副作用的生物標(biāo)志物。該研究表明，VEGFR基因表達(dá)與抗血管生成抑制劑的療效呈現(xiàn)相關(guān)關(guān)系。而在肺癌中VEGFR2的過表達(dá)會(huì)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，導(dǎo)致更差的預(yù)后［5］。本研究報(bào)道了VEGFR基因表達(dá)與含恩度的Ⅲa期肺癌輔助治療療效的相關(guān)性。研究結(jié)果顯示VEGFR1和VEGFR2基因高表達(dá)的患者在接受恩度輔助治療后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率更低，樣示VEGFRmRNA表達(dá)水平可能是血管內(nèi)皮抑素恩度潛在的療效預(yù)測(cè)因子，其表達(dá)量的高低影響患者術(shù)后接受恩度聯(lián)合GP輔助治療后1年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率?；诒狙芯康挠^察結(jié)果，表明VEGFR基因表達(dá)與血管抑制劑的療效具有一定相關(guān)性，為恩度等血管抑制劑的敏感人群篩選提供了一個(gè)新的思路和方向。

本文采用的實(shí)驗(yàn)方法為分支DNA－液相芯片技術(shù)，它是一種廣泛應(yīng)用于臨床的基因表達(dá)檢測(cè)技術(shù)，在基因檢測(cè)方面與傳統(tǒng)方法無論是RT－PCR還是固相芯片比較都有明顯優(yōu)勢(shì)。樣本無論是新鮮組織還是石蠟包埋塊組織都可以進(jìn)行mRNA表達(dá)水平檢測(cè)，整個(gè)過程中無需進(jìn)行RNA抽提、純化和逆轉(zhuǎn)錄等步驟即可實(shí)現(xiàn)對(duì)mRNA表達(dá)水平的直接檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果基本不受樣品中RNA降解等因素的影響，相比于傳統(tǒng)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR，更保證了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性［6］。

鑒于本研究樣本量少，且為回顧性研究，入組患者隨訪時(shí)間較短，無法就患者生存預(yù)后狀況做出有力的統(tǒng)計(jì)學(xué)證明。因此有必要進(jìn)行長期的隨訪研究比較不同VEGFR表達(dá)水平的患者的臨床療效差異。

作者聲明：本文第一作者對(duì)于研究和撰寫的論文出現(xiàn)的不端行為承擔(dān)相應(yīng)責(zé)任。

利益沖突：本文全部作者均認(rèn)同文章無相關(guān)利益沖突。

學(xué)術(shù)不端：本文在初審、返修及出版前均通過中國知網(wǎng)（CNKI）科技期刊學(xué)術(shù)不端文獻(xiàn)檢測(cè)系統(tǒng)學(xué)術(shù)不端檢測(cè)。

同行評(píng)議：經(jīng)同行專家雙盲外審，達(dá)到刊發(fā)要求。

［1］ NK Veeramachaneni，RH Feins，BJ Stephenson，et al.Management of stage ⅢA non-small cell lung cancer by thoracic surgeons in north america［J］.Ann Thorac Surg，2012，94（3）：922－926.

［2］ 劉慧慧，王孟昭，胡 克，等.Ⅲ期非小細(xì)胞肺癌手術(shù)是否有價(jià)值［J］.中國肺癌雜志，2013，16（12）：639－645.

［3］ 李春鳴，余更生.肺癌術(shù)后局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)因素的差異性分析［J］.當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2013，19（24）：9－10.

［4］ Dan GD，Willett CG，Ancukiewicz M，et al.Plasma soluble VEGFR－1 is a potential dual biomarker of response and toxicity for bevacizumab with chemoradiation in locally advanced rectal cancer［J］.Oncologist，2010，15（6）：577－583.

［5］ 蔣曉東，戴 鵬，宋大安，等.HIF－1a、VEGF、VEGFR2在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及臨床意義［J］.臨床肺科雜志，2011，16（3）：386－388.

［6］ 胡艷正，王 偉，尚立群，等.液相芯片與免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌ERCC1和RRM1表達(dá)的比較研究［J］.中國腫瘤臨床，2013，12（6）：349－353.

R734.2；R730.5

B

10.3969/j.issn.1674-0904.2016.06.005

2015-05-14

2016-11-17

*四川省科技支撐計(jì)劃（編號(hào)：2011FZ0069）

楊曉軍（1969－），男，四川人，本科，副主任醫(yī)師，主要研究方向：肺癌的綜合治療。

△李 強(qiáng)，主任醫(yī)師，E-mail：liqiang201320＠163.com