楊清柏 陳志忠 黃玉平 陳 紅 張慧敏

(解放軍第九五醫(yī)院,莆田,351100)

尿毒癥患者微炎狀態(tài)及FGF23的表達(dá)及其百令膠囊對(duì)其的影響

楊清柏 陳志忠 黃玉平 陳 紅 張慧敏

(解放軍第九五醫(yī)院,莆田,351100)

目的:觀察尿毒癥患者微炎狀態(tài)及FGF23的表達(dá)及百令膠囊對(duì)其的影響。方法:將本院100例尿毒癥患者納入研究,隨機(jī)分為對(duì)照組和觀察,同時(shí)將同期健康體檢50例設(shè)為健康組,觀察3組臨床生化指標(biāo)、IL-6、FGF23水平的變化。結(jié)果:1)治療前尿毒癥患者平均動(dòng)脈壓、BUN,SCr,EsR、血磷水平較健康對(duì)照組患者明顯升高(P<0.05),紅細(xì)胞、血紅蛋白及轉(zhuǎn)鐵蛋白明顯低于健康對(duì)照組(P<0.05)。而上述指標(biāo)在2組尿毒癥患者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。經(jīng)過(guò)一階段治療后2組患者臨床生化指標(biāo)均有不同程度的改善,其中使用百令膠囊的觀察組患者改善的幅度較對(duì)照組明顯,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。2)2組患者治療前IL-6、FGF23均高于正常水平,治療后上述2種指標(biāo)水平均有所下降,而其中百令膠囊組下降的趨勢(shì)更明顯。3)FGF23水平和IL-6濃度關(guān)系呈正相關(guān)性(r=0.242,P<0.01),FGF23與ALB及HDL水平均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r1=-0.342,P1=0.01)及(r=-0.425,P<0.01)。結(jié)論:尿毒癥患者外周血清FGF和IL-6表達(dá)水平明顯上調(diào);百令膠囊可能通過(guò)抑制IL-6表達(dá)改善尿毒癥透析患者炎性反應(yīng)狀態(tài);FGF23有可能成為尿毒癥透析患者炎性反應(yīng)狀態(tài)早期診斷及干預(yù)的新靶點(diǎn)。

尿毒癥;微炎狀態(tài);FGF23;百令膠囊

隨著腎功能進(jìn)行性衰竭,尿毒癥機(jī)體逐漸發(fā)生一系列復(fù)雜的細(xì)胞水平的生物化學(xué)反應(yīng),同時(shí)其還屬于全身性的慢性微炎性反應(yīng),而此慢性微炎性反應(yīng)狀態(tài)是以細(xì)胞因子驅(qū)動(dòng)為特征，大量文獻(xiàn)研究證實(shí)電解質(zhì)紊亂尤其是鈣磷代謝失衡可嚴(yán)重影響尿毒癥患者的生活質(zhì)量,隨著研究的深入,我們得知成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子23(FGF23)作為新型的調(diào)磷因子與血磷代謝關(guān)系密切,一項(xiàng)多中心大樣本調(diào)查研究結(jié)果顯示FGF23水平上調(diào)可能是尿毒癥患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因子[1-2],故我們認(rèn)為如果某種干預(yù)手段可改變微炎狀態(tài)及降低FGF23水平,則可發(fā)揮治療尿毒癥的作用。長(zhǎng)期的臨床觀察,我們發(fā)現(xiàn)百令膠囊可明顯改善尿毒癥患者的腎功能,因此我們?cè)O(shè)想:百令膠囊治療尿毒癥是否以炎性反應(yīng)因子及FGF23進(jìn)行橋接？為了證實(shí)這一觀點(diǎn),我們對(duì)100例尿毒癥患者進(jìn)行治療及觀察,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011年1月至2015年1月我院腎內(nèi)科收治100例尿毒癥患者,所有入組患者診斷均符合2002年美國(guó)腎有關(guān)臟病學(xué)會(huì)(ASN)制定的腎臟病/透析臨床實(shí)踐指南(KDOQI)CKDS期標(biāo)準(zhǔn)。其中男57例,女43例,年齡49～62歲,平均年齡(53.4±1.2)歲。原發(fā)病:慢性腎炎29例,高血壓性腎病48例,糖尿病性腎病23例。所有患者腎小球?yàn)V過(guò)率均<15 mL/min。100例患者中非臥床腹膜透析67例,維持性血液透析33例。100例患者隨機(jī)分為對(duì)照組及觀察組各50例。2組患者在年齡、原發(fā)病等一般情況方面比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本研究得到本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 1)3個(gè)月內(nèi)使用過(guò)糖皮質(zhì)激素或其他免疫抑制劑患者;2)合并嚴(yán)重心、腦、肝等重大臟器疾病或血液性疾病患者;3)自身免疫性腎損害患者;4)并發(fā)活動(dòng)性結(jié)核、消化道出血、重度感染等。

1.3 治療方法 2組尿毒癥患者均采用常規(guī)血液灌流+血液透析,血液透析采用聚砜膜透析器,透析器膜面積為1.4～1.6 m2,透析液為碳酸氫鹽,使用的血液灌流器購(gòu)自珠海健帆生物科技股份有限公司,血液灌流時(shí)血流量保持200～250 mL/min,血液灌流時(shí)長(zhǎng)2 h,灌流后再進(jìn)行常規(guī)透析2 h。觀察組在上述治療基礎(chǔ)上口服百令膠囊(杭州中美東華制藥有限公司生產(chǎn),批號(hào):C14000180754,規(guī)格:0.5 g/粒),3粒/次,3次/d。

1.4 血標(biāo)本的采集及PBMC的分離及培養(yǎng)

1.4.1 主要試劑與儀器 RPMI 1640和胎牛血清(美國(guó)Gibco公司);人淋巴細(xì)胞分離液(美國(guó)Sigma公司)。CRP ELISA試劑盒(美國(guó)eBioscience公司);兔來(lái)源FGF23抗體(美國(guó)CST公司)。

1.4.2 生化指標(biāo)檢測(cè) 所有入組患者均檢測(cè)血壓,查血常規(guī)、膽固醇、TG、BUN、SCr、ESR、血清鐵、鐵轉(zhuǎn)蛋白、CRP。囑患者抽血前一天晚上10點(diǎn)始禁食,次日清晨空腹抽取肘靜脈血10 mL,置于血清管中,30 min內(nèi)在4 ℃條件下以1 000 g轉(zhuǎn)速離心10 min,吸取上清液置于-80 ℃冰箱中備用。所有指標(biāo)采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA),應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀(日立7180型)取待測(cè)血液,根據(jù)購(gòu)自上海谷研實(shí)業(yè)有限公司ELISA試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。

1.4.3 PBMC的分離與培養(yǎng) 將采集的外周血3 mL置于肝素管內(nèi),用于PBMC的分離,用人淋巴細(xì)胞分離液提取外周血單核細(xì)胞(PBMC,1×106/mL)200 μL,置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中,加入刺激劑佛波醇乙酯(PMA)及離子霉素、莫能霉素等工作液并混勻,置于37 ℃,5% CO2。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h。用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗,離心收集細(xì)胞。

1.4.4 Western blotting檢測(cè)FGF23濃度 收集上述步驟提取的單核細(xì)胞,然后加入細(xì)胞裂解液,充分裂解后置于4 ℃ 12 000 r/min離心機(jī)離心10 min。取上清液獲取總蛋白,再根據(jù)DAB方法對(duì)所提蛋白液進(jìn)行濃度測(cè)定,之后以100 μL蛋白液中加入25 μL的上樣緩沖液于100 ℃金屬浴中變性,接著可按照每泳道上樣量為50 μg蛋白,計(jì)算上樣量,電泳(4%濃縮膠,12%分離膠,120 V,50 mA,1.5 h)結(jié)束后將凝膠取出,用PVDF膜轉(zhuǎn)印,遵循膠在負(fù)極,膜在正極的原則,50 V,100 mA,2 h,5%脫脂奶粉液的封閉2 h,TBS洗3次,5 min/次,分別加入5%脫脂奶粉按1∶1 000稀釋的抗FGF23和β-actin抗體(1∶1 000),4 ℃孵育過(guò)夜,TBS洗3次,5 min/次,加入堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶2 000)室溫2 h,TBS洗3次,5 min/次。將濾膜放人配好的顯色液中顯色15～30 min,計(jì)算機(jī)掃描圖像,并由生物圖像分析系統(tǒng)(Bio-Rad公司,Model Gel Doc 2000,美國(guó))分析處理。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,計(jì)量資料以(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示,組間比較當(dāng)方差齊時(shí)采用方差分析或t檢驗(yàn),不齊采用秩和檢驗(yàn);組內(nèi)用配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行組間分析。計(jì)數(shù)資料采用非參數(shù)卡方等檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組患者臨床生化指標(biāo)的比較 治療前尿毒癥患者平均動(dòng)脈壓、BUN,SCr,EsR、血磷水平較健康對(duì)照組患者明顯升高(P<0.05),紅細(xì)胞、血紅蛋白及轉(zhuǎn)鐵蛋白明顯低于健康對(duì)照組(P<0.05)。而上述指標(biāo)在2組尿毒癥患者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。經(jīng)過(guò)一階段治療后2組患者臨床生化指標(biāo)均有不同程度的改善,其中使用百令膠囊的觀察組患者改善的幅度較對(duì)照組明顯,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1、表2。

2.2 百令膠囊可改善尿毒癥患者的微炎狀態(tài) 2組尿毒癥患者外周血IL-6水平明顯高于健康對(duì)照組(P<0.05),2組尿毒癥患者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),治療后發(fā)現(xiàn)百令膠囊可更明顯降低尿毒癥患者IL-6水平(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 2組治療前后IL-6濃度的變化

2.3 百令膠囊可明顯清除尿毒癥患者FGF23水平

2組尿毒癥患者外周血FGF23水平明顯高于健康對(duì)照組(P<0.05),FGF232組尿毒癥患者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),治療后發(fā)現(xiàn)百令膠囊可更明顯清除尿毒癥患者FGF23水平(P<0.05)。見(jiàn)表3。

2.4 FGF23及其他生化指標(biāo)的相關(guān)分析 FGF23水平和IL-6濃度關(guān)系呈正相關(guān)性(r=0.242,P<0.01),FGF23與ALB及HDL水平均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r1=-0.342,P1=0.01)及(r=-0.425,P<0.01)。見(jiàn)圖2～4。

表1 3組生化指標(biāo)指標(biāo)的比較±s)

注:與健康對(duì)照組比較*P<0.05,組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P>0.05。

表2 2組尿毒癥患者治療前后生化指標(biāo)變化±s)

注:與治療前比較*P<0.05,與對(duì)照組比較△P<0.05。

表3 2組尿毒癥患者治療前后FGF23灰度值變化

注:與治療前比較*P<0.05,與對(duì)照組比較△P<0.05。

3 討論

尿毒癥嚴(yán)重威脅人類生命安全,感染、代謝綜合征、貧血等嚴(yán)重并發(fā)癥是尿毒癥死亡的重要因素。有數(shù)據(jù)顯示約有90%終末期腎病患者同時(shí)合并系統(tǒng)性炎性反應(yīng),從而增加了慢性腎病患者感染的風(fēng)險(xiǎn),造成不良預(yù)后。微炎程度目前已被視為評(píng)估終末期腎病的有力指標(biāo),臨床上尿毒癥患者在規(guī)律透析幫助下可排除體內(nèi)大量毒素,但是仍有大量的中小分子毒素累積于機(jī)體內(nèi),導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)環(huán)境紊亂,腎素-血管緊張素系統(tǒng)在毒素的刺激下被激活[3-5],另一方面,晚期糖基化終產(chǎn)物不斷刺激單核細(xì)胞,使之釋放了大量的炎性反應(yīng)遞質(zhì),從而進(jìn)一步加劇機(jī)體炎性反應(yīng),因此“微炎狀態(tài)學(xué)說(shuō)”已然成為評(píng)估尿毒素患者的疾病的手段,在此基礎(chǔ)及時(shí)干預(yù)將是改善患者預(yù)后的重要策略[6-7]。本研究對(duì)100例尿毒癥患者進(jìn)行治療觀察,結(jié)果顯示尿毒癥患者大部分生化指標(biāo)均較健康體檢者明顯改變,而此種改變?cè)诮?jīng)過(guò)規(guī)律透析后可一定程度就糾正,其中使用百令膠囊的觀察組患者改善的趨勢(shì)較對(duì)照組明顯,因此我們有理由相信百令膠囊對(duì)尿毒癥有理想療效。

圖2 IL-6與FGF23相關(guān)性分析

圖3 ALB與FGF23相關(guān)性分析

圖4 HDL與FGF23相關(guān)性分析

尿毒癥屬于中醫(yī)“癃閉”“關(guān)格”等范疇,在尿毒癥的臨床表現(xiàn)中可見(jiàn)嘔吐、水腫、少尿、面黃、頭暈、氣促、失眠、便秘等,與古代文獻(xiàn)中“關(guān)格”極為相似。《證治匯補(bǔ)·癃閉附關(guān)格篇》一書(shū)中描述:“既關(guān)且格,必小便不通,旦夕之間,陡增嘔惡,此因濁邪壅塞三焦,不得升降。所以關(guān)應(yīng)下而便閉,格應(yīng)上而生嘔吐,陰陽(yáng)閉絕,一旦即死,最為危候”。從大量臨床文獻(xiàn)研究中我們發(fā)現(xiàn)肺腎兩虛是尿毒癥最常見(jiàn)的證型,因此益肺補(bǔ)腎是治療尿毒癥的主要治療原則。冬蟲(chóng)夏草是我國(guó)廣泛運(yùn)用的中藥,其性味甘平,可保肺腎,補(bǔ)精髓,對(duì)于肺腎兩虛及精血不足的病癥有理想的治療作用。而百令膠囊是由冬蟲(chóng)夏草菌種經(jīng)低溫發(fā)酵制成,因此百令膠囊具有明顯補(bǔ)肺腎,益精氣之功效[8-13],在本研究中我們發(fā)現(xiàn)百令膠囊可明顯改善尿毒癥患者的病情,在進(jìn)一步觀察中我們發(fā)現(xiàn)尿毒癥患者血清中IL-6濃度明顯高于健康者,這也證實(shí)了尿毒癥患者處于明顯的炎性狀態(tài),而這種狀態(tài)在患者接受百令膠囊中可在一定程度上被糾正,這說(shuō)明百令膠囊可明顯改變尿毒癥患者的微炎狀態(tài)。

本研究首次觀察了尿毒癥患者外周血單核細(xì)胞FGF23的濃度變化,并將其與IL-6、ALB及HDL水平進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果顯示FGF23與IL-6具有正相關(guān)關(guān)系,IL-6是公認(rèn)的炎性反應(yīng)因子,因此我們相信FGF23可能也參與了尿毒癥患者炎性反應(yīng)的病理環(huán)節(jié),而這一過(guò)程可能通過(guò)IL-6介導(dǎo)完成。研究中我們還發(fā)現(xiàn)尿毒癥患者FGF23的表達(dá)水平與ALB及HDL呈負(fù)相關(guān)性,因此FGF23與不良臨床生化指標(biāo)亦有緊密的聯(lián)系,其可能成為衡量尿毒癥患者炎性狀態(tài)及內(nèi)環(huán)境紊亂的穩(wěn)定性生物學(xué)標(biāo)志物,百令膠囊可顯著降低尿毒癥患者的FGF濃度,從而達(dá)到治療的目的。血磷代謝紊亂是慢性腎病患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因子,終末期腎病患者腎臟排磷功能嚴(yán)重受損,此外患者飲食中攝入部分磷,導(dǎo)致血磷的潴留。另一方面,血磷屬于機(jī)體小分子毒素,尿毒癥患者透析時(shí)血磷以分子擴(kuò)散的形式越過(guò)透析膜向透析液一側(cè)移動(dòng),不易排出體外,從而引起高磷血癥,增加了死亡的風(fēng)險(xiǎn)。FGF23是有氨基酸組成的信號(hào)肽,由骨細(xì)胞分泌,腎臟是其靶器官,有明顯的抑制磷重吸收的作用,是重要的調(diào)磷因子。生理狀態(tài)下,血磷濃度的上調(diào)可刺激FGF23分泌,而尿毒癥患者腎功能持續(xù)性下降,盡管血磷潴留明顯,但FGF23已失去調(diào)磷作用,故無(wú)法緩解此種狀態(tài)。研究中我們發(fā)現(xiàn)尿毒癥患者血磷濃度的確高于健康組,而百令膠囊可在一定程度降低尿毒癥患者的血磷水平,故我們認(rèn)為通過(guò)抑制FGF23的分泌可調(diào)節(jié)尿毒癥患者血磷狀態(tài),從而達(dá)到治療的目的。

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(2016-09-26收稿 責(zé)任編輯：王明)

Mild Inflammation Status, Expression of FGF23 in Patients with Uremia and Bailing capsule′s impact on it

Yang Qingbo,Chen Zhizhong,Huang Yuping,Chen Hong,Zhang Huimin

(The95thHospitalofChinesePeople,sLiberationArmy,Putian351100,China)

Objective:To observe the mild inflammation status and the expression of FGF23 in patients with uremia and Bailing capsule′s impact on it.Methods:Totally 100 cases of patients with uremia in our hospital were included into the study, randomly divided into the control group and the observation group. And 50 cases of healthy check-up in the same period were the healthy group. The clinical biochemical index, CRP, FGF23 levels changes of the three groups were observed. Results:1) Before the treatment, mean arterial pressure, BUN, SCr and EsR levels of the uremic patients increased significantly comparing to the healthy and control groups (P<0.05), erythrocyte, hemoglobin and transferrin significantly lower than healthy and controls groups (P<0.05). And the above indexes were with no statistically significant difference between the two groups of patients with uremia (P>0.05). After a period of treatment, the clinical biochemical indicators of patients in the two groups had different degrees of improvement. The observation group, which took Bailing capsules, had more obvious improvement than the control group, and the differences were statistically significant (P<0.05); 2) The IL-6 and FGF23 level of both groups before treatment were higher than normal levels, and both of the 2 levels decreased after treatment, but the downward trend of Bailing capsule group was more obvious. 3) The relationship between the concentration of FGF23 and IL-6 levels had positive correlation (r=0.242,P<0.01). FGF23 and ALB and HDL levels had negative correlation (r1=-0.342P<0.01) and (r=-0.425,P<0.01) .Conclusion:The expression level of peripheral blood FGF and IL-6 in patients with uremia increased obviously; Bailing capsule may inhibit the expression of IL-6 to improve the status of inflammation in patients with uremia hemodialysis; FGF23 may become a new target for early diagnosis and intervention of inflammation in patients with uremia hemodialysis.

Uremia； Mild inflammation status； FGF23； Bailing capsule

國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(編號(hào):30600795)

楊清柏(1986.01—),男,本科,住院醫(yī)師,研究方向:腎臟疾病的治療,E-mail:330347999@qq.com

R256.2

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.12.039