徐帥兵，黃 兵,3，趙其平，董 輝，朱順海，崔曉霞，謝雨翔，唐 敏,2，楊志遠(yuǎn),2，韓紅玉

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲(chóng)學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，上海 200241；2. 上海師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200234；3. 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009）

·研究論文·

柔嫩艾美耳球蟲(chóng)子孢子酵母雙雜交cDNA文庫(kù)的構(gòu)建

徐帥兵1，黃 兵1,3，趙其平1，董 輝1，朱順海1，崔曉霞1，謝雨翔1，唐 敏1,2，楊志遠(yuǎn)1,2，韓紅玉1

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲(chóng)學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，上海 200241；2. 上海師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200234；3. 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009）

為了篩選柔嫩艾美耳球蟲(chóng)子孢子入侵相關(guān)的蛋白，利用酵母雙雜交體系構(gòu)建了柔嫩艾美耳球蟲(chóng)子孢子酵母雙雜交cDNA文庫(kù)。提取純化的子孢子總RNA，經(jīng)MMLV-RT反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈后，利用LD-PCR擴(kuò)增合成雙鏈cDNA(ds cDNA)，dscDNA經(jīng)純化柱CHROMA SPINT+TE-400 Columns 純化剔除小于200 bp的片段。將純化后dscDNA、pGADT7-Rec及CarrierDNA共轉(zhuǎn)化到已經(jīng)制備好的酵母感受態(tài)細(xì)胞Y187中，dscDNA與pGADT7-Rec以同源重組的方式在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行連接，經(jīng)過(guò)缺陷性培養(yǎng)基（SD/-Leu）的篩選得到酵母雙雜交cDNA文庫(kù)。結(jié)果顯示，構(gòu)建的柔嫩艾美耳球蟲(chóng)子孢子酵母雙雜交cDNA文庫(kù)的轉(zhuǎn)化率為4.33×105/μg pGADT7-Rec，文庫(kù)滴度為3.62×107cfu/mL。隨機(jī)挑取32個(gè)單克隆進(jìn)行PCR檢測(cè)，插入片段大小為200～2000 bp，重組率為93.75%，并以該文庫(kù)作為模板，用柔嫩艾美耳球蟲(chóng)5對(duì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了這5個(gè)基因片段。結(jié)果表明成功構(gòu)建了柔嫩艾美耳球蟲(chóng)子孢子酵母雙雜交cDNA文庫(kù)，為進(jìn)一步篩選和研究球蟲(chóng)入侵互作蛋白奠定了基礎(chǔ)。

柔嫩艾美耳球蟲(chóng)；子孢子；酵母雙雜交cDNA文庫(kù)；同源重組

雞球蟲(chóng)病是由幾種艾美耳球蟲(chóng)（Eimeria）寄生于雞腸道并在繁殖過(guò)程中嚴(yán)重?fù)p害腸道組織細(xì)胞而引起的一種全球性寄生蟲(chóng)病，給養(yǎng)雞業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。集約化養(yǎng)雞場(chǎng)尤其為雞球蟲(chóng)的生存和傳播提供了更多的便利條件[1]。據(jù)報(bào)道在我國(guó)雞群中流行的雞球蟲(chóng)有9種[2]，其中柔嫩艾美耳球蟲(chóng)（E. tenella）和毒害艾美耳球蟲(chóng)（E. necatrix）毒力較強(qiáng)，危害較大，常引起雞死亡。柔嫩艾美耳球蟲(chóng)作為頂復(fù)器門原蟲(chóng)的成員之一，屬于專性細(xì)胞內(nèi)寄生蟲(chóng)，它們有共同的入侵機(jī)制。這類寄生蟲(chóng)入侵宿主細(xì)胞的過(guò)程十分復(fù)雜，目前已知是由3種細(xì)胞器（微線體、棒狀體、致密顆粒）分泌的一系列蛋白的相互作用來(lái)完成[3]，但是這些相互作用蛋白之間的聯(lián)系以及蛋白的分泌是由什么信號(hào)介導(dǎo)的，至今尚不清楚。所以，研究這些蛋白之間的相互作用機(jī)制，可以為尋找新的藥物靶標(biāo)及控制球蟲(chóng)入侵提供有效途徑。

由Fields等[4,5]建立的酵母雙雜交系統(tǒng)是研究蛋白互作的經(jīng)典方法，現(xiàn)在已被廣泛用于互作蛋白的篩選與鑒定，不僅可以尋找蛋白發(fā)揮作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域[6]，還能建立蛋白質(zhì)互作圖譜[7]等。傳統(tǒng)的研究蛋白互作的方法，如Pull-down、Co-IP、免疫共沉淀等，僅能篩選到少量蛋白。酵母雙雜交是模擬體內(nèi)環(huán)境在核酸水平上進(jìn)行，不受環(huán)境和試驗(yàn)條件的限制，可以用某個(gè)關(guān)鍵的蛋白作為誘餌，對(duì)酵母雙雜交cDNA文庫(kù)進(jìn)行大規(guī)模的蛋白篩選，在短時(shí)間內(nèi)即可獲得大量的互作蛋白，進(jìn)而研究蛋白互作的意義及其功能[8]。

國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者為了研究已知蛋白的功能和作用位點(diǎn)，構(gòu)建了不同的酵母雙雜交cDNA文庫(kù)。Mahajan等[9]構(gòu)建了來(lái)自豬腎細(xì)胞LFBK細(xì)胞系的酵母雙雜交cDNA文庫(kù)。Xue等[10]構(gòu)建了柔嫩艾美球蟲(chóng)第二代裂殖子酵母雙雜交cDNA文庫(kù)。程子英等[11]構(gòu)建了弓形蟲(chóng)RH株酵母雙雜交cDNA文庫(kù)。由于在球蟲(chóng)的整個(gè)生活史中，子孢子是球蟲(chóng)入侵雞腸道組織細(xì)胞的第一階段，在整個(gè)入侵過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。因此，本研究成功利用酵母雙雜交方法構(gòu)建了柔嫩艾美耳球蟲(chóng)子孢子酵母cDNA文庫(kù)，為進(jìn)一步篩選子孢子階段入侵相關(guān)的蛋白及功能基因奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 Trizol試劑盒購(gòu)于TaKaRa公司；Make Your Own“Mate & PlateTM”Library System User Manual、YPD Medium、YPD Agar Medium、Minimal SD Agar Base、-Leu DO Supplement、Matchmaker Insert Check PCR Mix 2均購(gòu)自Clontech公司。

1.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期的相關(guān)研究，用Primer Primier 5.0軟件設(shè)計(jì)了5個(gè)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)基因的特異性引物，引物由上海賽百盛公司合成。

表1 本研究所用引物Table1 Primers used in this study

1.3 柔嫩艾美耳球蟲(chóng)子孢子的收集與純化 柔嫩艾美耳球蟲(chóng)上海株保存于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所動(dòng)物原蟲(chóng)病創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)。首先將5×104個(gè)孢子化卵囊/只接種于2周齡無(wú)球蟲(chóng)感染的三黃雞，感染后收集d 6～8糞便中的卵囊，27℃條件下在2.5%重鉻酸鉀溶液中28℃進(jìn)行孢子化，至孢子化率達(dá)到80%以上，收集卵囊。然后用飽和食鹽水漂浮法對(duì)孢子化卵囊進(jìn)行漂浮純化，收集絮狀物，10倍稀釋后離心棄上清，沉淀用2倍體積的次氯酸鈉懸浮，氧化30 min。按1∶1比例加入蒸餾水稀釋，使次氯酸鈉含量約為50%，轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中離心，收集白色絮狀物即為孢子化卵囊。收集的孢子化卵囊經(jīng)玻璃珠震蕩破碎其細(xì)胞壁，用滅菌HBBS洗滌以去除部分卵囊壁碎片，然后離心收集孢子囊，經(jīng)6%雞膽汁和0.5%胰蛋白酶37℃消化至90%子孢子自孢子囊中溢出。離心，HBBS洗滌2次去除絕大部分孢子囊碎片，沉淀用HBBS懸浮，然后經(jīng)G4砂芯漏斗過(guò)濾，收取濾液，離心棄上清，獲得的沉淀即為柔嫩艾美耳球蟲(chóng)子孢子，保存于液氮中備用。

1.4 總RNA的提取 按照子孢子50～100 mg/mL RNAiso Plus比例懸浮子孢子，充分混勻，室溫靜置5 min。根據(jù)Trizol試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，最后將得到的總RNA溶解于20μL DEPC水中，紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA純度及濃度，用瓊脂糖凝膠電泳分析其完整性。

1.5 第一鏈的合成 按照Make Your Own“Mate & PlateTM”Library System User Manual說(shuō)明書(shū)步驟，取2 μL總RNA、1.0 μL CDS Ⅲ、1.0 μL ddH2O于無(wú)RNase離心管中，離心混勻，72℃孵育2 min，冰上冷卻2 min，向離心管中依次加入2.0 μL 5×firststrand buffer、1.0 μL dNTP Mix、1.0 μL DTT、1.0 μL SMART MMLV reverse transcriptase，手指輕彈，離心混勻，42℃孵育10 min。接著加入1 μL SMERT Ⅲ-modified oligo混勻，42℃孵育1 h后，再以75℃孵育10 min終止反應(yīng)。最后室溫冷卻，加入1 μL RNase H，37℃孵育20 min，快速離心，使液體聚集管底，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 雙鏈的合成及純化 將PCR儀預(yù)熱至95℃，在PCR管中依次加入2 μL first-strant cDNA、10 μL 10×advantage 2 PCR buffer、2 μL 50×dNTP Mix、上下游PCR 引物各2 μL、10 μL 10×melting solution、2 μL 50×advantage 2 polymerase mix、70 μL deionized H2O，總體積為100 μL，離心混勻，分裝2管，放到預(yù)熱的PCR儀中。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性10 s，68℃退火延伸6 min，21個(gè)循環(huán)；68℃延伸5 min。取4 μL PCR產(chǎn)物保存?zhèn)溆谩Ｈ〕鯟hroma Spin TE-400柱子，上下顛倒使柱內(nèi)基質(zhì)懸浮，去掉上下端蓋子，置于1個(gè)2 mL收集管中，室溫605×g，離心5 min，將柱子置于一個(gè)新的收集管中。將上述剩余的PCR產(chǎn)物加入柱中間基質(zhì)上，室溫605×g離心5 min，保留收集管。向收集管中加入預(yù)冷的1/10體積的NaAc、2.5倍體積的95%乙醇，上下顛倒使之混勻，-20℃冰箱內(nèi)放置1 h。室溫20598×g離心20 min，小心吸去上清，室溫干燥10 min，最后用20 μL ddH2O懸浮沉淀并混勻。dscDNA純化前后各取4 μL進(jìn)行凝膠電泳，檢驗(yàn)純化效果，其余-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 酵母感受態(tài)的制備 在YPDA固體培養(yǎng)基上用三區(qū)劃線法對(duì)Y187酵母菌劃板，30℃培養(yǎng)3～4 d。挑取4個(gè)直徑2～4 mm的酵母菌于離心管中，30℃、245 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)11 h，測(cè)定其OD600值，選取生長(zhǎng)速度最快的繼續(xù)培養(yǎng)。取酵母菌液5 μL于500 mL錐形瓶中（含有50 mL YPDA液體培養(yǎng)基），30℃、245 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)18～20 h，直至OD600值達(dá)到0.15～0.3，946×g離心 5 min，去上清。再用100 mL YPDA液體培養(yǎng)基重懸酵母細(xì)胞，30℃、245 r/min震蕩培養(yǎng)3～5 h，離心去上清，用無(wú)菌ddH2O重懸沉淀，再離心去上清。用TE/LiAc重懸酵母細(xì)胞，瞬時(shí)離心15 s，去上清，再用TE/LiAc重懸酵母細(xì)胞，置于冰上。

1.8 cDNA文庫(kù)的構(gòu)建 根據(jù)說(shuō)明書(shū)制備好Y187酵母感受態(tài)細(xì)胞，然后將Carrier DNA、dsDNA、pGADT7-Rec質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化到Y(jié)187酵母感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物用0.9% NaCl重懸后均勻涂布于SD/-Leu缺陷性培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)3～5 d。平板上有大量的酵母長(zhǎng)出時(shí)，開(kāi)始收集文庫(kù)。先將平板在4℃冰箱中預(yù)冷3～4 h，向每個(gè)平板上滴加4℃預(yù)冷的含25%甘油的YPDA液體培養(yǎng)基4 mL，用無(wú)菌細(xì)胞刮將酵母從培養(yǎng)基上刮下來(lái)，收集至錐形瓶中混勻。檢測(cè)轉(zhuǎn)化子密度大于2×107cfu/mL，若小于該密度，可通過(guò)離心濃縮，然后分裝于50 mL和1 mL離心管中，-70℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.9 文庫(kù)質(zhì)量的鑒定

1.9.1 轉(zhuǎn)化效率的檢測(cè) 篩選轉(zhuǎn)化子時(shí)，取100 μL轉(zhuǎn)化混合物按1∶10、1∶102、1∶103稀釋。每個(gè)稀釋度取50 μL涂布于100 mm的SD/-Leu缺陷性培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3～5 d，統(tǒng)計(jì)生長(zhǎng)出的菌落數(shù)量，計(jì)算轉(zhuǎn)化效率（轉(zhuǎn)化率=N×稀釋倍數(shù)×轉(zhuǎn)化混合物總體積/鋪板體積）。

1.9.2 文庫(kù)容量檢測(cè) 文庫(kù)菌液按1∶10、1∶102、1∶103、1∶104、1∶105稀釋，每個(gè)稀釋度取50 μL涂布于100 mm的SD/-Leu缺陷性培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3～5 d，統(tǒng)計(jì)生長(zhǎng)出的菌落數(shù)量，再計(jì)算文庫(kù)滴度（文庫(kù)滴度=N×稀釋倍數(shù)/鋪板體積）。

1.9.3 插入片段大小檢測(cè) 用牙簽從文庫(kù)滴度檢測(cè)的SD/-Leu平板上分別挑取32個(gè)單克隆，溶于50 μL ddH2O中，再用Matchmaker Insert Check PCR Mix 2進(jìn)行PCR鑒定。反應(yīng)體系：PCR Mix 45μL、模板5μL。PCR程序：94℃預(yù)變性1 min；98℃變性10 s，68℃退火延伸3 min，30個(gè)循環(huán)。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分析文庫(kù)插入片段的大小以及重組率。

1.9.4 用柔嫩艾美耳球蟲(chóng)特異性引物從文庫(kù)中釣取基因 取1 mL cDNA文庫(kù)，于液氮和沸水中反復(fù)凍融5次，破壞酵母細(xì)胞壁，3783×g離心5 min，取上清作為模板，用柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：模板3 μL、上下游引物各1 μL、2×PCR Mix 12.5 μL、ddH2O 7.5 μL。PCR程序：95℃預(yù)變性2 min；95℃變性40 s, 50℃～60℃退火40 s（根據(jù)各個(gè)引物Tm值有所改變），72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸5 min；4℃結(jié)束。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將與原序列大小相近的單一條帶切下，膠回收PCR產(chǎn)物，并與pGEMT-easy Vector連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞TOP10中，37℃培養(yǎng)10～12 h。挑取單克隆搖菌，取1 mL送去測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果與原序列進(jìn)行Blast比對(duì)。

2 結(jié)果

2.1 柔嫩艾美耳球蟲(chóng)孢子化卵囊及子孢子的純化 用純種柔嫩艾美耳球蟲(chóng)接種2周齡無(wú)球蟲(chóng)雞，收集感染后6～8 d的卵囊，在2.5%重鉻酸鉀溶液中于 28℃培養(yǎng)后獲得孢子化卵囊，經(jīng)飽和食鹽水漂浮和次氯酸鈉純化后獲得純化的孢子化卵囊（圖1A）。孢子化卵囊經(jīng)玻璃珠破碎后，經(jīng)胰酶和膽汁消化，子孢子從孢子囊逸出，再經(jīng)G4漏斗過(guò)濾純化后獲得純化的子孢子（圖1B）。

圖1 孢子化卵囊(A)和子孢子(B)的純化Fig.1 Purif cation of the sporulated oocysts(A) and sporozoite(B)

2.2 子孢子總RNA的提取 提取子孢子總RNA后，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度為1077.7 ng/μL，OD260/OD280為1.98。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后可以看到3條較亮的條帶，分別是28S、18S和5S（圖2）。結(jié)果說(shuō)明提取的柔嫩艾美耳球蟲(chóng)子孢子總RNA的純度和質(zhì)量較高，可用于后續(xù)子孢子酵母cDNA文庫(kù)的構(gòu)建。

圖2 子孢子總RNA電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of total RNA from sporozoite

2.3 雙鏈cDNA的擴(kuò)增及純化 分別取純化前后的dscDNA 4 μL進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果表明，純化后的dscDNA較純化前剔除掉了小于200 bp的片段，且純化后的dscDNA主要集中在200～2000 bp之間，表明分布比較完整（圖3）。

圖3 柔嫩艾美耳球蟲(chóng)子孢子雙鏈cDNA純化前后電泳結(jié)果Fig.3 Electrophoretogram of unpurif ed and purif ed double-stranded cDNA of sporozoite of Eimeria tenella

圖4 柔嫩艾美耳球蟲(chóng)子孢子文庫(kù)插入片段cDNA的 PCR鑒定Fig.4 PCR identif cation of the inserted fragments size ofcDNA lbrary from sporozoite of Eimeria tenella

2.4 文庫(kù)質(zhì)量的鑒定 通過(guò)對(duì)SD/-Leu平板上的菌落計(jì)數(shù)，經(jīng)公式計(jì)算得到子孢子cDNA文庫(kù)轉(zhuǎn)化效率為4.33×105/μg pGADT7-Rec，文庫(kù)滴度為3.62×107cfu/mL。隨機(jī)挑取32個(gè)單克隆進(jìn)行PCR，PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳，結(jié)果顯示條帶主要集中在400～2 000 bp之間，平均長(zhǎng)度約為1000 bp，有2個(gè)單克隆沒(méi)有轉(zhuǎn)化成功，表明文庫(kù)重組率為93.75%（圖4）。2.5 特異性引物擴(kuò)增獲得球蟲(chóng)基因 以柔嫩艾美耳球蟲(chóng)子孢子酵母雙雜交cDNA文庫(kù)反復(fù)凍融離心獲得的上清作為模板，用柔嫩艾美耳球蟲(chóng)5個(gè)特異基因的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。電泳檢測(cè)結(jié)果表明，擴(kuò)增出了5個(gè)特異性基因（ETH_00007915、ETH_00008865、EtCHP317、EtMIC2 、EtADF）（圖5），測(cè)序后進(jìn)行比對(duì)，與原序列100%同源，表明所構(gòu)建的柔嫩艾美耳球蟲(chóng)子孢子酵母雙雜交cDNA文庫(kù)質(zhì)量較好，包含有該階段所表達(dá)的特異性基因，可用于后續(xù)的研究。

M: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000); 1: ETH_00007915; 2: ETH_00008865; 3: EtCHP317; 4: EtMIC2; 5: EtADFM: DNA Marker(DL2000); 1: ETH_00007915; 2: ETH_00008865; 3: EtCHP317; 4: EtMIC2; 5: EtADF

3 討論

構(gòu)建一個(gè)高質(zhì)量的酵母cDNA文庫(kù)是在真核細(xì)胞體內(nèi)高效、大量地篩選與已知蛋白有互作關(guān)系的蛋白以及研究蛋白間功能的前提。本研究分離純化獲得柔嫩艾美耳球蟲(chóng)子孢子，提取總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)得OD260/OD280為1.97，28S、18S和5S條帶清晰，說(shuō)明提取的總RNA質(zhì)量良好，能用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。直接用總RNA反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈，避免了mRNA在分離過(guò)程中被污染和降解，再用LD-PCR合成dscDNA，經(jīng)過(guò)柱純化后的dscDNA較純化之前，剔除了200 bp以下的小片段，避免了其在后期篩選過(guò)程中的干擾，可減少假陽(yáng)性。能用于酵母雙雜交系統(tǒng)的高質(zhì)量cDNA文庫(kù)須滿足以下條件，文庫(kù)的轉(zhuǎn)化率大于3.3×105/μg pGADT7-Rec，文庫(kù)容量大于2.0×107cfu/mL，重組率大于90%。經(jīng)過(guò)鑒定，本研究構(gòu)建的柔嫩艾美耳球蟲(chóng)子孢子cDNA文庫(kù)的轉(zhuǎn)化效率為4.33×105/μg pGADT7-Rec，文庫(kù)容量為3.62×107cfu/mL，重組率為93.75%。同時(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期已研究的柔嫩艾美耳球蟲(chóng)特異性基因，以該文庫(kù)為模板，成功克隆出了長(zhǎng)度不同的5個(gè)球蟲(chóng)特異性基因，說(shuō)明本研究構(gòu)建的子孢子酵母cDNA文庫(kù)可用于后續(xù)的相互作用蛋白的篩選。

本文庫(kù)在構(gòu)建時(shí)選用的引物是CDS Ⅲ（OligodT），較Random Primer有一定的優(yōu)勢(shì)。利用Oligo-dT擴(kuò)增時(shí)，逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV-RT通過(guò)OligodT Primer與mRNA的PolyA結(jié)合而延伸，當(dāng)延伸到mRNA的5' 端遇到“帽子結(jié)構(gòu)”時(shí)，會(huì)在已合成的cDNA 3' 端加上幾個(gè)C堿基。這時(shí)Oligo（dG）會(huì)與cDNA末端突出的C堿基進(jìn)行配對(duì)，逆轉(zhuǎn)錄酶自動(dòng)轉(zhuǎn)換模板，以SMART引物為模板繼續(xù)延伸至末端，獲得的cDNA一端有Oligo-dG，另一端有Oligo-dT已知序列。根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)上、下游引物進(jìn)行LDPCR就會(huì)擴(kuò)增出大量的全長(zhǎng)雙鏈cDNA，保證了基因的完整性[12,13]。而Rondom Primer上的6個(gè)隨機(jī)堿基是自由結(jié)合在mRNA的任何部位，由于該引物的特異性不強(qiáng)，擴(kuò)增得到的大部分是一些片段基因，很少能得到全長(zhǎng)基因。這樣就有可能導(dǎo)致一些基因重要結(jié)構(gòu)域的不完整或者缺失，不利于后期的篩選。

酵母雙雜交cDNA文庫(kù)的構(gòu)建在球蟲(chóng)研究中已有應(yīng)用。薛璞等[14]構(gòu)建了柔嫩艾美耳球蟲(chóng)子孢子cDNA文庫(kù)，且利用該文庫(kù)篩選了柔嫩艾美耳球蟲(chóng)頂膜抗原1（EtAMA1）可能的相互作用蛋白。本研究構(gòu)建的子孢子酵母雙雜交cDNA文庫(kù)選用的酵母菌株是Y187，因此在篩選文庫(kù)時(shí)所用誘餌菌株應(yīng)為Y2HGold。薛璞等[14]構(gòu)建的子孢子酵母雙雜交cDNA文庫(kù)的酵母菌株是AH109，誘餌菌株是Y187。酵母菌株Y2HGold與AH109兩者的區(qū)別在于，Y2HGold菌株中的AUR1基因某個(gè)堿基發(fā)生了突變，即AUR1-C，突變后的菌株能夠?qū)饟?dān)子素A（aureobasidin A，AbA）產(chǎn)生抗性，而AH109不包含這個(gè)突變基因，對(duì)AbA敏感[15]。所以在后期文庫(kù)篩選中AUR1-C作為一個(gè)報(bào)告基因，使得篩選條件更加的嚴(yán)格，減少了假陽(yáng)性產(chǎn)生的幾率。

近年來(lái)，隨著cDNA文庫(kù)技術(shù)的不斷改進(jìn)和完善，使得酵母雙雜交方法的應(yīng)用更加廣泛。Li等[16]利用酵母雙雜交方法獲得了與日本血吸蟲(chóng)抱雌溝蛋白互作的5個(gè)蛋白的ESTs序列。Wang等[17]利用酵母雙雜交篩選獲得了與MIC2整合素A樣結(jié)構(gòu)相互作用的2個(gè)宿主蛋白LAMTOR1、RNaseH2B。Leneghan等[18]將親免素（PfFKBP）作為誘餌，用酵母雙雜交的方法從瘧原蟲(chóng)cDNA文庫(kù)中篩選到了11個(gè)可能與免疫抑制有關(guān)的基因。這些研究為以后利用酵母雙雜交cDNA文庫(kù)篩選寄生蟲(chóng)功能基因提供了新的思路和方法。本研究成功構(gòu)建了柔嫩艾美耳球蟲(chóng)子孢子酵母雙雜交cDNA文庫(kù)，為進(jìn)一步篩選與球蟲(chóng)入侵相關(guān)的蛋白及功能基因奠定了基礎(chǔ)。

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CONSTRUCTION OF A YEAST TWO-HYBRID CDNA LIBRARY FROM SPOROZOITES OF EIMERIA TENELLA

XU Shuai-bing1, HUANG Bing1,3, ZHAO Qi-ping1, DONG Hui1, ZHU Shun-hai1, CUI Xiao-xia1, XIE Yu-xiang1, TANG Min1,2, YANG Zhi-yuan1,2, HAN Hong-yu1

(1. Key Laboratory of Animal Parasitolgy of Ministry of Agriculture, Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2. College of Life and Environment Sciences, Shanghai Normal University, Shanghai 200234, China; 3. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, China)

In order to screen the proteins related to the invasion of Eimeria tenella sporozoites, the yeast two-hybrid cDNA library of E. tenella sporozoites was constructed in the present study. The total RNA was isolated from the sporozoites and used as the template to synthesize the f rst-strand cDNAs. The dscDNAs were acquired by long-distance polymerase chain reaction (LD-PCR) using the f rststrand cDNAs as the template and purified with Chroma Spin TE-400 Column to remove less than 200 bp fragments. The dscDNA,pGADT7-Rec and CarrierDNA were co-transformed into Y187 yeast competent cells. The dscDNA were then connected with pGADT7-Rec by homologous recombination reaction to construct the yeast two-hybrid cDNA library of E. tenella sporozoites. The results showed that the conversion ratio and titer of the cDNA library were 4.33×105/μg pGADT7-Rec and 3.62×107cfu/mL, respectively. As demonstrated in PCR amplif cation, the cDNA library contained approximately 93.75% recombinant clones and the inserted cDNA fragments were between 200 bp and 2000 bp. Furthermore, 5 gene fragments were obtained by PCR amplication using the cDNA library as template and 5 specif c pairs of primers of E. tenella. Therefore, it concluded that a yeast two-hybrid cDNA library of the sporozoites was constructed for screening invasion-related interaction proteins of the sporozoites of E. tenella.

Eimeria tenella; sporozoite; yeast two-hybrid cDNA library; homologous recombination

S852.723

A

1674-6422（2016）06-0036-07

2016-09-08

國(guó)家自然科學(xué)基金（31272557，31572266）；農(nóng)業(yè)部中央級(jí)公益性科研院所項(xiàng)目（2015JB10）

徐帥兵，男，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

韓紅玉，E-mail∶ hhysh@shvri.ac.cn