典型城市屠宰及銷售豬肉中弓形蟲的分子檢測研究

詹婷婷，米榮升，黃 燕，陸 珂，程 龍，賈海燕，胡 盼，宋 悅，韓先干，趙 權(quán)，陳兆國

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春 130118；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動物產(chǎn)品質(zhì)量安全生物性危害因子風(fēng)險評估實驗室（上海） 農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學(xué)重點實驗室，上海200241；3.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州 225009）

·研究論文·

典型城市屠宰及銷售豬肉中弓形蟲的分子檢測研究

詹婷婷1,2，米榮升2,3，黃 燕2,3，陸 珂2,3，程 龍2，賈海燕2，胡 盼2，宋 悅1,2，韓先干2，趙 權(quán)1，陳兆國2,3

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春 130118；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動物產(chǎn)品質(zhì)量安全生物性危害因子風(fēng)險評估實驗室（上海） 農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學(xué)重點實驗室，上海200241；3.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州 225009）

為了解我國重慶市、廣州市和上海市3個典型城市屠宰環(huán)節(jié)和銷售環(huán)節(jié)豬肉中弓形蟲的攜帶情況，在這3個城市共采集豬膈肌樣品393份，分別進行胃蛋白酶消化并提取基因組DNA，以弓形蟲529 bp重復(fù)序列為目的基因，進行PCR擴增。結(jié)果顯示，3個城市豬膈肌肉中弓形蟲的陽性率為5.34%，其中重慶市的陽性率最高，達9.83%；其次是上海市，為3.17%；而廣州市則未檢出陽性樣品。夏季和秋季間、屠宰環(huán)節(jié)和銷售環(huán)節(jié)間的陽性率差異均不具備顯著統(tǒng)計學(xué)意義。本研究結(jié)果為減少弓形蟲對上述地區(qū)人群的危害，預(yù)防和控制弓形蟲病流行，指導(dǎo)豬群的飼養(yǎng)管理以及提高畜牧業(yè)經(jīng)濟效益提供了有益指導(dǎo)。

弓形蟲； PCR；膈肌；豬

剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）是隸屬于孢子蟲綱、弓形蟲屬的一種世界性分布的食源性寄生原蟲，可感染包括人在內(nèi)的大多數(shù)哺乳動物[1]。豬感染弓形蟲后，體溫升高，食欲減退，呼吸困難甚至死亡[2]。近年來，該病在豬場廣泛流行，但是絕大部分呈隱性感染。據(jù)報道，全球豬弓形蟲感染率為0～92.7%[2]，我國豬弓形蟲感染率高達10.4%～75.95%[2、3]。通過生食或食用未煮熟的豬肉等途徑，人類也可感染弓形蟲[1]。調(diào)查顯示，全球約30%的人感染弓形蟲[4]，我國人弓形蟲感染率為7.88%[5]。豬肉在我國居民食物構(gòu)成中占據(jù)重要地位，是肉類消費的主體[6]，豬肉中存在的弓形蟲對人類健康構(gòu)成很大威脅，保證豬肉食品的安全尤為重要。

豬的弓形蟲感染檢測以血清學(xué)方法為主[7]。然而，血清學(xué)檢測方法不能區(qū)分既往感染和現(xiàn)癥感染，也無法對豬肉進行檢測。近年來發(fā)展起來的分子生物學(xué)檢測方法，能夠檢測豬肉等組織中存在的弓形蟲，具有良好的敏感性和特異性[7,8]。分子生物學(xué)檢測方法包括常規(guī)PCR[7]、套式PCR[9]、實時熒光定量PCR[10]等，檢測對象包括SAG2[9]、529 bp重復(fù)序列[8,10]、B1基因[11]等，其中后兩者最常使用[7]。研究人員選取不同基因?qū)ωi肉中的弓形蟲感染情況進行檢測，發(fā)現(xiàn)弓形蟲529 bp重復(fù)序列的敏感性最高[8、12]。在我國，利用分子生物學(xué)技術(shù)檢測豬肉中弓形蟲感染的應(yīng)用還非常少，僅有極少數(shù)報道[13]。本研究利用分子生物學(xué)檢測方法，以弓形蟲529 bp重復(fù)序列作為目的基因，檢測重慶、廣州和上海市部分地區(qū)銷售環(huán)節(jié)和屠宰環(huán)節(jié)豬膈肌中弓形蟲攜帶情況，為減少弓形蟲對上述地區(qū)人群的危害，預(yù)防和控制弓形蟲病流行；同時，對指導(dǎo)豬群的飼養(yǎng)管理，減少豬群弓形蟲感染，奠定堅實的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 弓形蟲蟲株及試劑 弓形蟲PRU株由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所動物源性病原生物學(xué)及食品安全團隊傳代保存；EX Taq酶、dNTP Mixture、動物組織基因組提取試劑盒TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0、DL2 000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、pMD18-T載體、T4 DNA連接酶為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒為Axygen公司產(chǎn)品；Trans1-T1 Phage Resistant化學(xué)感受態(tài)細胞購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；胃蛋白酶1∶3000為生工生物工程（上海）股份有限公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 樣品采集 2015年夏季和秋季，在重慶、廣州和上海3個城市的8個區(qū)進行豬膈肌樣品采集。其中重慶市3個區(qū)，包括大渡口區(qū)、九龍坡區(qū)、渝北區(qū)；廣州市2個區(qū)：白云區(qū)和花都區(qū)；上海市3個區(qū)：奉賢區(qū)、嘉定區(qū)和松江區(qū)。采樣環(huán)節(jié)包括屠宰環(huán)節(jié)和銷售環(huán)節(jié)，每份樣品約100 g。共采集豬膈肌樣品393份，樣品來源于3個市的12個屠宰場、6個農(nóng)貿(mào)市場和5個超市。每份樣品分別裝在無菌的密封袋中，置于低溫保存箱中，帶回實驗室4℃保存。

1.3 樣品處理 所有樣品均先進行胃蛋白酶消化，具體方法如下：取樣品10 g，用均質(zhì)儀研碎，按照1∶10的比例加入胃蛋白酶消化液（胃蛋白酶25 g、36%濃鹽酸 8 mL、生理鹽水1 L），37℃消化過夜，中間混勻數(shù)次。將消化后的溶液用40目銅篩網(wǎng)過濾，然后加蒸餾水混勻，靜置30 min，倒掉部分上清，重新加蒸餾水混勻靜置，重復(fù)2～3次。將最后一次靜置的溶液500×g離心10 min，棄上清，收集沉淀，-20℃保存，用于DNA提取。

1.4 樣品DNA提取 取胃蛋白酶處理好的樣品，用動物組織基因組提取試劑盒TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0 進行DNA提取，提取后的DNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 引物合成 根據(jù)文獻[15]，選取弓形蟲529 bp重復(fù)序列（Toxo-529）作為檢測的目的基因，上游：5'-CTGCAGGGAGGAAGACGAAAGTTG-3'；下游：5'-CTGCAGACACAGTGCATCTGGATT-3'。引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

1.6 樣品檢測 以提取的樣品DNA為模板，進行PCR擴增，反應(yīng)體系：ddH2O 37 μL、10×PCR Buffer 5 μL、2.5 mmol/L dNTP mixture 4 μL、TaKaRa Ex Taq 1 μL、100 μmol/mL上下游引物各0.5 μL、樣品DNA 2 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性7 min；94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min， 35個循環(huán)；72℃再延伸10 min。擴增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1.7 陽性樣品序列分析 將擴增的PCR產(chǎn)物用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒進行回收，與pMD18-T載體進行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入Trans1-T1 Phage Resistant化學(xué)感受態(tài)細胞，經(jīng)PCR鑒定為陽性的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化菌液被送至英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司進行重復(fù)測序。用BLAST軟件（http∶//blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi）在GenBank數(shù)據(jù)庫上進行同源性搜索，用DNAMAN version 5.2.2軟件進行序列相似性分析。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析 利用Microsoft Excel 2007、SPSS 21.0軟件對獲得的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用χ2檢驗分析差異的顯著性，當(dāng)P≤0.05時，判定為差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義；當(dāng)P≤0.01時，判定為差異具有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 樣品PCR擴增結(jié)果 以提取的豬膈肌樣品DNA為模板，進行弓形蟲529 bp重復(fù)序列擴增，結(jié)果陽性對照組和部分樣品成功地擴增出了特異性片段，約為530 bp，與預(yù)期大小相符（圖1）。

圖1 弓形蟲529 bp重復(fù)序列基因PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplif cation of 529 bp repetitive fragment of T. gondii

2.2 3個典型城市豬膈肌弓形蟲攜帶情況 對來自重慶、廣州和上海3個城市393份豬膈肌樣品進行弓形蟲檢測，結(jié)果顯示，共有21份樣品陽性，陽性率為5.34%。其中重慶市的陽性率最高，為9.83%（17/173）；其次是上海市，為3.17%（4/126）；而廣州市則未檢出（表1）。顯著性分析結(jié)果顯示，不同城市間屠宰和市售豬肉中弓形蟲陽性率差異具有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=13.35，P＜0.01）。

在調(diào)查的8個區(qū)中，有3個區(qū)豬膈肌樣品存在弓形蟲攜帶。其中重慶市九龍坡區(qū)陽性率最高，達到27.27%（12/44），其次是重慶市大渡口區(qū)和上海市奉賢區(qū)，分別為11.63%（5/43）和11.76%（4/34），其余5個區(qū)則未檢出陽性樣品（表1），不同區(qū)之間的攜帶情況差異具有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=64.11，P＜0.01）。

表1 不同城市和地區(qū)豬膈肌弓形蟲檢測Table 1 Detection of T. gondii in pig diaphragmatic muscles collected from different cities and districts

從不同季節(jié)看，夏季和秋季豬膈肌樣品中均檢出弓形蟲陽性樣品，其中夏季的陽性率為4.17%（4/96），秋季的陽性率為5.72%（17/297），夏季和秋季的陽性率差異不具備顯著統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.35，P＞0.05）（表2）。

從采樣環(huán)節(jié)看，3個城市在銷售環(huán)節(jié)（超市與農(nóng)貿(mào)市場）、屠宰環(huán)節(jié)采集的樣品均檢出弓形蟲，其中銷售環(huán)節(jié)的陽性率為7.81%（5/64），屠宰環(huán)節(jié)的陽性率為4.86%（16/329），不同的采樣環(huán)節(jié)陽性率差異不具備顯著統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.92，P＞0.05）（表3）。

2.3 陽性樣品弓形蟲529 bp重復(fù)片段序列同源性和系統(tǒng)發(fā)育分析 隨機選擇其中 16個陽性樣品PCR產(chǎn)物進行測序，獲得的序列與GenBank公布的弓形蟲529 bp重復(fù)序列（登錄號：KC607824）進行核苷酸比對。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所獲得序列與GenBank登錄序列同源性為98.0%～100.0%（圖2），系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，3個城市豬膈肌中攜帶的弓形蟲序列與GenBank中序列在同一個分枝上。

3 討論

弓形蟲是一種世界流行的人獸共患寄生蟲，豬、牛、羊等多種家畜都是其中間宿主。對國內(nèi)家畜弓形蟲的感染情況調(diào)查發(fā)現(xiàn)，豬的感染率最高[14]，但是這些報道絕大多數(shù)是基于血清學(xué)檢測方法，對于豬肉中弓形蟲感染情況報道的比較少。白明強等[15]用間接血凝試驗（infect hemagglutination test，IHA）對重慶市14個區(qū)縣674份豬血清進行檢測，陽性率為55.34%。譚其軍等[16]從重慶市合川、萬州、北碚等17 個區(qū)縣采集豬血樣，檢出率為60.42%（171/283）；徐斌等[3,17]2004～2011年從重慶市巴南、榮昌等39個區(qū)縣采集11 700份豬血清樣品，檢測結(jié)果為75.95%，其中2011年分3個季節(jié)進行檢測，陽性率為71.85%（2522/3510）。Wu等[18]對重慶市8個區(qū)縣的豬血清樣品進行檢測，感染率為30.6%（278/908）。薛霞等[19]于2002～2007年對上海8個區(qū)縣的規(guī)模化豬場進行了跟蹤監(jiān)測，共采集1377份血清樣本，每年的感染率變化差異非常大，變化規(guī)律也不明顯，檢出率最高的年份達到66.7%，檢出率最低的年份為零感染。Yan等[20]對廣州市3個地區(qū)豬血清進行的檢測，陽性率為6.98%（9/129）。

分子生物學(xué)檢測方法具有敏感、特異等優(yōu)點，目前已經(jīng)逐漸在豬的弓形蟲感染檢測方面得到應(yīng)用[7,13,21]。李亞麗等[13]從河南省漯河地區(qū)6個不同規(guī)模菜市場采集200份豬后腿瘦肉樣品，PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)豬肉弓形蟲的總陽性率為4.0%。邵曉冬等[21]對采自河南科技大學(xué)動物醫(yī)院接診的54頭病死豬，以及洛陽某食品公司的105頭屠宰豬肺門淋巴結(jié)進行了PCR檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)病死豬弓形蟲的檢測陽性率為18.5%，屠宰豬的陽性率為6.7%。本試驗采用針對弓形蟲529 bp重復(fù)序列設(shè)計的特異性引物建立的PCR方法，首次對重慶、廣州和上海3個城市部分地區(qū)的豬膈肌進行了檢測。共檢測樣品393份，總的感染率為5.34%，其中重慶市的感染率最高，為9.83%，其次為上海市3.17%，而廣州市未檢出陽性樣品。這可能與廣州市采集的樣品數(shù)量較少有關(guān)，有待進一步檢測證實。這些陽性率數(shù)據(jù)盡管普遍低于血清學(xué)檢測結(jié)果，但兩者的變化趨勢完全一致。重慶市豬弓形蟲陽性率較高，需要引起人們的高度重視，平時要注意飲食習(xí)慣，不生食或食用未煮熟的豬肉，砧板生熟分開；同時養(yǎng)殖場應(yīng)該加強管理，盡量杜絕嚙齒類和貓接觸飼料及飲水，減少弓形蟲感染的可能性。上海市也存在一定陽性率，亦應(yīng)引起注意。

圖2 3 城市豬膈肌弓形蟲529 bp重復(fù)序列核苷酸相似性分析Fig.2 Nucleotide sequence similarity analysis of 529 bp repetitive fragment of T. gondii in pig diaphragmatic muscles collected from 3 cities

從不同季節(jié)采集樣本的檢測結(jié)果來看，秋季的感染率（5.72%）高于夏季（4.17%），但是差異不具備顯著統(tǒng)計學(xué)意義，這與徐斌等[19]報道夏季是豬弓形蟲高發(fā)季節(jié)不一致，可能與本次調(diào)查采取的檢測方法不同有關(guān)。對銷售環(huán)節(jié)和屠宰環(huán)節(jié)的取樣結(jié)果表明，豬肉中存在的弓形蟲在貯存、運輸環(huán)節(jié)中污染的可能性比較小。

本研究采用分子生物學(xué)檢測方法，首次對我國城市人口比較密集的3個城市進行了豬肉中弓形蟲的檢測，發(fā)現(xiàn)重慶市和上海市豬肉存在弓形蟲感染，而廣州市未發(fā)現(xiàn)弓形蟲感染。調(diào)查結(jié)果對減少弓形蟲對上述地區(qū)人群的危害，預(yù)防和控制弓形蟲病流行有重要意義。同時，也為指導(dǎo)豬群合理地進行飼養(yǎng)管理，減少豬群弓形蟲感染奠定堅實理論基礎(chǔ)。

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MOLECULAR DETECTION OF TOXOPLASMA GONDII INFECTION IN SLAUGHTERED AND MARKETING PORK PRODUCTS IN LARGE CITIES

ZHAN Ting-ting1,2, MI Rong-sheng2,3, HUANG Yan2,3, LU Ke2,3, CHENG Long2, JIA Hai-yan2, HU Pan2, SONG Yue1,2, HAN Xian-gan2, ZHAO Quan1, CHEN Zhao-guo2,3
(1. Animal Science and Technology College, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China; 2. Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Animal Products on Biohazards (Shanghai) of Ministry of Agriculture, Key Laboratory of Animal Parasitology of Ministry of Agriculture, Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 3. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, China)

Abstract: In order to investigate the presence of Toxoplasma gondii infection in pork products in slaughter houses and markets in large cities Chongqing, Guangzhou and Shanghai, 393 pig diaphragmatic muscle samples were collected and treated with pepsin digestion. Genomic DNA of the treated samples were extracted and detected in PCR using a pair of specif c primers based on a 529 bp repetitive fragment gene of T. gondii. The results showed that the overall positive rate of T. gondii in these 3 cities was 5.34% with the highest in Chongqing (9.83%), followed by Shanghai (3.17%) but no positive samples in Guangzhou. There was no signif cant difference in positive rates between summer and autumn, or slaughter houses and markets. These results indicated that T. gondii infection occured in pigs in Chongqing and Shanghai. Therefore, comprehensive measures should be implemented to reduce Toxoplasma infection in human and pigs and increase prof t of animal industry.
Key words:Toxoplasma gondii; PCR; pig; diaphragmatic muscle

S852.723

A

1674-6422（2016）06-0030-06

2016-02-24

國家自然科學(xué)基金項目（31302083）；國家農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估重大專項（GJFP201600703）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費（2016JB13）；閔行區(qū)高層次人才科研項目團隊資助

詹婷婷，女，碩士研究生，臨床獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

趙權(quán), E-mail∶ zhaoquan0825@163.com；陳兆國, E-mail∶ zhaoguochen@shvri.ac.cn