柴胡加龍骨牡蠣湯對(duì)創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙模型大鼠行為學(xué)的調(diào)節(jié)作用

陳光耀　吳卓耘　張新寧　陳瑩瑩　劉燕　丁雷　周清緣　宋月晗

100029　北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

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·論著·

柴胡加龍骨牡蠣湯對(duì)創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙模型大鼠行為學(xué)的調(diào)節(jié)作用

陳光耀吳卓耘張新寧陳瑩瑩劉燕丁雷周清緣宋月晗

100029北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

【摘要】目的觀察柴胡加龍骨牡蠣湯對(duì)單次延長(zhǎng)應(yīng)激(single-prolonged stress，SPS)建立的創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(post traumatic stress disorder，PTSD)模型大鼠行為學(xué)的調(diào)節(jié)作用。 方法采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)以及強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)，對(duì)不同組大鼠的行為學(xué)改變情況進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果(1)與正常組大鼠進(jìn)行比較，模型組大鼠游泳試驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)、次數(shù)增多，曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)直立時(shí)間減少、運(yùn)動(dòng)總距離縮短(P<0.05)。(2)與模型組比較，柴胡桂枝龍骨牡蠣湯以及阿普唑侖均能夠降低大鼠游泳試驗(yàn)不動(dòng)次數(shù)、時(shí)間以及增加曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)直立時(shí)間、運(yùn)動(dòng)總距離(P<0.05)，且兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)成功復(fù)制了PTSD樣大鼠模型，柴胡加龍骨牡蠣湯能夠改善改變SPS建立的PTSD大鼠的情緒行為變化，能夠從總體方面改善PTSD樣大鼠的癥狀。

【關(guān)鍵詞】創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙；柴胡加龍骨牡蠣湯；單次延長(zhǎng)應(yīng)激；行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(post traumatic stress disorder，PTSD)是指由嚴(yán)重的突發(fā)性、威脅性或?yàn)?zāi)難性生活事件導(dǎo)致長(zhǎng)期持續(xù)存在的精神障礙[1]，其癥狀主要包括對(duì)創(chuàng)傷事件的病理性重現(xiàn)、對(duì)創(chuàng)傷相關(guān)線索的回避、持續(xù)性的高喚醒，以及對(duì)創(chuàng)傷經(jīng)歷的選擇性遺忘和情感麻木[2]。由于PTSD在災(zāi)難后普遍發(fā)生，發(fā)病率高、病程長(zhǎng)、療效差，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量[3]。因此針對(duì)PTSD治療手段的增加以及相關(guān)藥物的研發(fā)成為當(dāng)務(wù)之急。

柴胡加龍骨牡蠣湯出自《傷寒論·辨太陽(yáng)病脈證并治》第一百零七條，主治“胸滿煩驚，小便不利，譫語(yǔ)，一身盡重,不可轉(zhuǎn)側(cè)”。研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)各種神志類(lèi)疾病如失眠、更年期綜合征、自閉癥、抑郁癥、焦慮癥、癲癇等有著良好的效果[4]。一項(xiàng)以汶川地震幸存者中PTSD患者為研究對(duì)象、以柴胡加龍骨牡蠣湯為主方配制的藥物作為變量的隨機(jī)安慰劑對(duì)照試驗(yàn)顯示出其對(duì)PTSD癥狀有著良好的改善作用[5]。

在涉及到藥物對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的作用研究上，行為學(xué)試驗(yàn)發(fā)揮著重要的作用，它能夠反映出實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的整體狀態(tài)，因而較之其他指標(biāo)具有更為重要的意義，是評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)成功與否的最重要的標(biāo)準(zhǔn)，能夠?yàn)檫M(jìn)一步實(shí)驗(yàn)提供相對(duì)合理的依據(jù)[6]。因而通過(guò)柴胡加龍骨牡蠣湯對(duì)單次延長(zhǎng)應(yīng)激(single-prolonged stress,SPS)建立的PTSD樣大鼠行為學(xué)的調(diào)節(jié)作用的研究，能夠?yàn)檫M(jìn)一步的相關(guān)生理、生化實(shí)驗(yàn)研究提供思路。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康成年雄性SD大鼠 48 只，體質(zhì)量(180±20)g，提前一周購(gòu)入并進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)自斯貝福(北京)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司；許可證號(hào):SCXK(京)2011-0004。

1.2實(shí)驗(yàn)藥品

柴胡加龍骨牡蠣湯(藥物組成：《傷寒論》所記載的柴胡加龍骨牡蠣湯去鉛丹，由柴胡、半夏、桂枝、茯苓、黃芩、大棗、人參、牡蠣、龍骨、生姜組成，各藥用量按照原方比例)由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院提供并制備成顆粒劑，顆粒劑用蒸餾水配制成懸濁液，每毫升含生藥1 g；陽(yáng)性對(duì)照組實(shí)驗(yàn)藥物為阿普唑侖，用蒸餾水配置成0.01 mg/mL的溶液。藥物放在4℃冰箱中備用。

1.3儀器設(shè)備

大鼠固定器、木質(zhì)曠場(chǎng)箱由北京中醫(yī)藥大學(xué)神經(jīng)免疫實(shí)驗(yàn)室提供。行為學(xué)自動(dòng)觀察分析系統(tǒng)采用Nodule公司行為學(xué)研究設(shè)備，含計(jì)算機(jī)、攝像監(jiān)控以及 observior、ethevision 分析軟件。

1.4實(shí)驗(yàn)分組

將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為 4組，分別為正常對(duì)照組、模型組、柴胡加龍骨牡蠣湯組、阿普唑侖組，每組12只。在造模束縛過(guò)程中共10只大鼠死亡，為保證實(shí)驗(yàn)組大鼠數(shù)量，將正常對(duì)照組4只大鼠造模后分配進(jìn)入實(shí)驗(yàn)組，其中柴胡加龍骨牡蠣湯組在給藥第7天死亡一只。

1.5造模

采用SPS法建立 PTSD 大鼠模型，包括先將大鼠進(jìn)行2小時(shí)束縛，隨后將大鼠置于水箱中進(jìn)行20分鐘的強(qiáng)迫游泳，游泳結(jié)束15分鐘后將大鼠置于密閉容器中進(jìn)行乙醚麻醉，待大鼠昏迷后放在通風(fēng)處，待意識(shí)恢復(fù)后再放回鼠籠靜養(yǎng)。

1.6給藥

造模后每天早 7:00 對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃，正常對(duì)照組和模型組按體重給予1 mL/100 g生理鹽水；柴胡桂枝龍骨牡蠣湯組給予1 mL/100 g的柴胡加龍骨牡蠣湯懸濁液；阿普唑侖組給予1 mL/100 g的阿普唑侖溶液。連續(xù)灌胃14天后進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)。

1.7實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1.7.1曠場(chǎng)試驗(yàn)采用立方形灰色木質(zhì)曠場(chǎng)箱，其底面為灰色，用黑線劃分為 25個(gè)正方形格(20 cm ×20 cm)，分為沿側(cè)壁的16個(gè)外周格，其余為中心9個(gè)中央格，攝像頭置于中央格正上方。實(shí)驗(yàn)時(shí)將動(dòng)物放入箱內(nèi)底面中心，實(shí)驗(yàn)人員遠(yuǎn)離曠場(chǎng)箱，同時(shí)進(jìn)行攝像5分鐘。每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用酒精清洗方箱內(nèi)部，以免影響下次測(cè)試，最后采用計(jì)算機(jī)軟件對(duì)錄像進(jìn)行分析。

1.7.2強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將大鼠放入有水的水箱中，測(cè)量大鼠5分鐘內(nèi)放棄逃跑而保持靜止不動(dòng)(僅前肢輕微運(yùn)動(dòng)以保持頭部露出水面)的時(shí)間作為指標(biāo)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果

2.1對(duì)大鼠游泳試驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間及次數(shù)影響

對(duì)大鼠游泳試驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間及次數(shù)兩項(xiàng)指標(biāo)，模型組與正常對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，阿普唑侖組、柴胡加龍骨牡蠣湯組分別與模型組相比在游泳試驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間以及次數(shù)，均有差異(P<0.05)；柴胡加龍骨牡蠣湯與阿普唑侖組在游泳試驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間以及次數(shù)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1　大鼠游泳試驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間表±s)

注： 與正常組相比較，aP<0.05；與模型組相比較，bP<0.05。

2.2曠場(chǎng)試驗(yàn)

大鼠曠場(chǎng)試驗(yàn)大鼠直立時(shí)間與運(yùn)動(dòng)總距離兩項(xiàng)指標(biāo)，模型組與正常對(duì)照組相比均有差異(P<0.05)，阿普唑侖組、柴胡加龍骨牡蠣湯組分別與模型組相比均有差異(P<0.05)；柴胡加龍骨牡蠣湯與阿普唑侖組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2　大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)直立時(shí)間以及運(yùn)動(dòng)總距離表±s)

注： 與正常組相比較，aP<0.05；與模型組相比較，bP<0.05。

3討論

單次延長(zhǎng)應(yīng)激(single-prolonged stress，SPS)是一種短時(shí)高強(qiáng)度的應(yīng)激刺激，因其重復(fù)性良好以及能夠較好的模擬出PTSD所表現(xiàn)出的臨床癥狀，被廣泛應(yīng)用于PTSD的實(shí)驗(yàn)研究中，已成為一種國(guó)際通用的PTSD成熟的造模手段，其相關(guān)的生理、生化研究亦成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)之一[7-9]。

強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)?zāi)茌^好的模擬當(dāng)PTSD患者再次處于災(zāi)難性事件發(fā)生的環(huán)境中時(shí)所表現(xiàn)出的強(qiáng)烈的恐懼感和無(wú)助感。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，以四肢僅作輕微擺動(dòng)、保持頭部漂浮在水面以上，為放棄掙扎的標(biāo)準(zhǔn)并記錄游泳試驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間，反映出PTSD大鼠再次處于SPS模型應(yīng)激條件下所表現(xiàn)出的絕望[10]。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蜉^好的評(píng)價(jià)嚙齒類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自主運(yùn)動(dòng)行為、探究行為與緊張度，從而反映出動(dòng)物的整體的認(rèn)知情況和焦慮狀態(tài)，是用來(lái)評(píng)價(jià)動(dòng)物模型行為學(xué)變化的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)之一[11]。相對(duì)于正常組，模型組大鼠在經(jīng)歷SPS應(yīng)激之后，游泳試驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)、次數(shù)增多以及曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)直立次數(shù)減少、運(yùn)動(dòng)總距離縮短，說(shuō)明SPS應(yīng)激能夠增加大鼠的恐懼行為以及抑制自發(fā)性活動(dòng)，較好的模擬了臨床PTSD患者的無(wú)助感、反應(yīng)性麻木以及探索能力下降的表現(xiàn)。

近代有中醫(yī)研究認(rèn)為PTSD是在各種先后天因素所致心虛膽怯、肝郁不舒的基礎(chǔ)上，由“驚”而發(fā)，損傷人體氣機(jī)，引起臟腑、氣血津液失調(diào)，進(jìn)而引起氣郁生火，心神被擾，神機(jī)失藏[12]。柴胡加龍骨牡蠣湯作為經(jīng)方中治療神志類(lèi)疾病的代表方劑，原方由柴胡、黃芩、生姜、鉛丹、人參、桂枝、茯苓、半夏、大黃、牡蠣、龍骨、大棗十二味藥物所組成，因鉛丹毒副作用較大，現(xiàn)代一般不使用。該方龍骨、牡蠣鎮(zhèn)驚安神，柴胡、桂枝升發(fā)宣散；黃芩、大黃清熱瀉火，茯苓、半夏健脾化痰；人參、大棗補(bǔ)虛，可調(diào)寒熱并調(diào)、升降并用、補(bǔ)虛泄實(shí)，共同發(fā)揮解郁瀉熱，鎮(zhèn)靜安神的功效，與PTSD病因病機(jī)不謀而合。

本實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照藥物阿普唑侖，是目前治療PTSD最常用的藥物，研究表明應(yīng)激后早期及時(shí)給予阿普唑侖干預(yù)可明顯減輕創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙大鼠的恐懼反應(yīng)，能夠起到良好的對(duì)照作用[13-14]。在連續(xù)給藥14天后，柴胡加龍骨牡蠣湯組以及阿普唑侖組相對(duì)于模型組均表現(xiàn)出在游泳試驗(yàn)中不動(dòng)時(shí)間以及次數(shù)減少、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)總運(yùn)動(dòng)距離增加，且兩組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，表明柴胡加龍骨牡蠣湯對(duì)SPS建立的PTSD樣大鼠行為學(xué)具有調(diào)節(jié)作用，其作用效果與阿普唑侖無(wú)顯著差異。

綜上所述，柴胡加龍骨牡蠣湯對(duì)SPS模型建立的 PTSD 樣大鼠的行為學(xué)異常具有良好的調(diào)節(jié)作用，將柴胡加龍骨牡蠣湯運(yùn)用于PTSD的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以進(jìn)一步研究其調(diào)節(jié)機(jī)制，將對(duì)以PTSD的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]American Psychiatric Association. Diagnostic and statistical manual of mental disorders[M]. Fourth Edition (DSM-IV)，Washington DC,1994.

[2]段妮,馮玉芳,劉彩興,等.創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙研究進(jìn)展[J].四川精神衛(wèi)生,2014,(6):575-577.

[3]張婭玲,白艷秋,彭正午,等.創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(PTSD)的生物學(xué)研究概述[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2011,11(1):172-175,168.

[4]林珍臣. 柴胡加龍骨牡蠣湯治療情志類(lèi)疾病128例之文獻(xiàn)研究[D].廣州：廣州中醫(yī)藥大學(xué),2012.

[5]Xian-Ze Meng, Feng Wu, Pin-Kang Wei, et al.A Chinese Herbal Formula to Improve General PsychologicalStatus in Posttraumatic Stress Disorder: A RandomizedPlacebo-Controlled Trial on Sichuan Earthquake Survivors[J].Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2012，2012(1)：691258.

[6]林曉春,李云鵬,卞艷芳,等. 大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測(cè)及參考值的探討[J]. 毒理學(xué)雜志,2010,3:224-225.

[7]Bing Xiao, Bo Yu, Dong-Juan Liu,et al.Single prolonged stress induces dysfunction of endoplasmic reticulum in a rat model of post-traumatic stress disorder[J].Mol Med Rep,2015,12(2):2015-2020.

[8]Keller SM, Schreiber WB, Staib JM, et al.Sex differences in the single prolonged stress model[J].Behav Brain Res, 2015,286(1):29-32.

[9]劉俊麗,夏亮,王莉穎,等. 單次延長(zhǎng)應(yīng)激導(dǎo)致的創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙行為伴隨乳頭體神經(jīng)元活化[J]. 神經(jīng)解剖學(xué)雜志,2012,28(4):397-400.

[10]韓明飛,高東,孫學(xué)禮，等.兩種慢性強(qiáng)迫游泳應(yīng)激抑郁模型的行為學(xué)比較[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2010,41(1):137-139,152.

[11]周波,文敏,李宏偉，等.Matlab在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)行為視頻分析中的運(yùn)用[J].貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2013,38(2):164-165,168.

[12]宋月晗,李峰,劉燕,等. 從“驚”探析創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙的中醫(yī)病機(jī)[J]. 環(huán)球中醫(yī)藥,2011,4(4):284-286.

[13]毛萌,宋月晗,李峰，等.SPS建立PTSD樣大鼠曠場(chǎng)行為的改變及十味溫膽湯的調(diào)節(jié)作用[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2013,13(17):3214-3216,3224.

[14]黨少康,羅曉星,張振,等.阿普唑侖對(duì)創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙的預(yù)防作用[J]. 神經(jīng)解剖學(xué)雜志,2010,26(3):245-248.

(本文編輯： 韓虹娟)

The regulating effect ofChaihujiaLongguMulidecoction (CLMD) on behavior responds of PTSD rats established by SPSCHENGuang-yao,WUZhuo-yun,ZHANGXin-ning,etal.BeijingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Beijing100029,China

【Abstact】ObjectiveTo investigate the behavior changes and the influence of traditional Chinese prescriptionChaihujiaLongguMulidecoction (CLMD) on post traumatic stress disorder (PTSD) rats.MethodsThe open field test and forced swimming test was used to detect the change of the behavior of rats in different groups.Results(1)Compared with the normal group, the duration and the times of immobility of model group in forced swimming test were significantly higher (P<0.05). The vertical activity and total distance movement in the open fields of model group were significantly lower (P<0.05). (2)The vertical activity and total distance movement in Xanax group and CLMD group were both significantly higher than those of the model group (P<0.05). And the duration and the times of immobility in forced swimming test were significantly reduced in both Xanax group and CLMD group (P<0.05). All the parameters of CLMD group and Xanax group had no significant difference(P>0.05).ConclusionsThe PTSD model in rat is established successfully, and CLMD can significantly improve the abnormal behavior changes of the PTSD rats established by SPS model.

【Keywords】Post traumatic stress disorder；Chaihu jia Longgu Muli decoction；Single prolonged stress；Behavioral experiment

(收稿日期：2015-09-14)

Corresponding author:SONG Yue-han,E-mail：songyuehan1981@126.com

【中圖分類(lèi)號(hào)】R285

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi：10.3969/j.issn.1674-1749.2016.02.003

作者簡(jiǎn)介：陳光耀(1994- )，2012級(jí)本碩連讀本科階段在讀。研究方向：神經(jīng)精神疾病病證結(jié)合研究。E-mail：chenguangyao1994@163.com通訊作者： 宋月晗(1981- )，女，副教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向：神經(jīng)精神疾病病證結(jié)合研究。E-mail：songyuehan1981@126.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃(201410026055)；教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專(zhuān)項(xiàng)科研基金(20100013120005)