謝辛慈，劉璐，袁松華，張曉燕，徐建青

復旦大學附屬公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508

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廣譜流感疫苗的研究進展

謝辛慈，劉璐，袁松華，張曉燕，徐建青

復旦大學附屬公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508

摘要：流行性感冒(簡稱流感)的頻頻暴發(fā)嚴重危害人類健康和公共衛(wèi)生，已引起全球范圍內(nèi)的高度關(guān)注。預防流感最有效和經(jīng)濟的措施是接種疫苗，但流感病毒的持續(xù)變異可逃逸人群已有的免疫應答，目前使用的季節(jié)性流感疫苗僅對亞型內(nèi)抗原匹配較好的毒株產(chǎn)生免疫保護作用，難以有效應對因抗原漂移或抗原轉(zhuǎn)換而產(chǎn)生的無法預料的流感大流行。因此，研發(fā)對流感病毒不同亞型均具有交叉免疫保護作用的廣譜流感疫苗具有重要意義。近年來，流感病毒廣譜中和抗體的發(fā)現(xiàn)、對流感病毒抗原保守區(qū)域及細胞免疫機制的深入研究、疫苗免疫策略的優(yōu)化等都為廣譜流感疫苗的研發(fā)提供了新思路。本文簡述了近幾年基于血凝素、基質(zhì)蛋白、核蛋白等多種流感靶抗原的廣譜流感疫苗的研究進展。

關(guān)鍵詞：A型流感病毒；廣譜流感疫苗；免疫原策略；血凝素；基質(zhì)蛋白2

流行性感冒(簡稱流感)是由流感病毒引起的嚴重危害人類健康和公共衛(wèi)生的急性呼吸道傳染病，是全球重點監(jiān)測和造成死亡人數(shù)最多的傳染病之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO)統(tǒng)計，在世界范圍內(nèi)，每年有300萬~500萬人嚴重感染，25萬~50萬人死亡[1-2]。流感病毒屬于正黏病毒科，為反義單鏈RNA病毒。根據(jù)其核蛋白(nucleoprotein, NP)及基質(zhì)蛋白(matrix, M)的抗原性不同，可分為A、B和C型，其中B型和C型流感病毒變異相對較少[3]，未曾造成顯著危害。而A型流感病毒對人類和多種動物具有致病力，曾引起4次世界大流行。1918—1919年西班牙暴發(fā)的H1N1流感大流行造成全球約5 000萬人死亡，隨后還有1957—1958年亞洲pN2流感、1968—1969年中國香港地區(qū)pN2流感及2009年豬來源的H1N1流感[4-5]。

A型流感病毒表面血凝素(haemagglutinin, HA)有18種類型，神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase, NA)有9種亞型，在進化和傳播過程中易發(fā)生頻繁且不可預測的突變，變異重組的病毒可能具有新的抗原性和致病性，可逃逸人群中已形成的免疫屏障，引起季節(jié)性或大規(guī)模的流感暴發(fā)[6-7]。接種疫苗是預防流感最有效的方法，然而目前已有的季節(jié)性疫苗只對亞型內(nèi)抗原匹配較好的毒株產(chǎn)生免疫保護，對抗原預測的準確率不高，且疫苗生產(chǎn)周期長、成本高[8]。因此，不管是針對每年都在變化的季節(jié)性流感還是未知的流感大流行，廣譜流感疫苗的開發(fā)都具有重要的意義。

1傳統(tǒng)流感疫苗使用現(xiàn)狀及存在問題

目前世界上獲得批準使用的流感疫苗均為季節(jié)性流感疫苗[9]，其中最為廣泛使用的為三價滅活疫苗[10]，包含兩種危害較大的A型流感病毒(H1N1和pN2)和一種B型流感病毒，疫苗的保護效果取決于實際流行毒株與疫苗病毒的一致性。2013—2014年，WHO開始推薦四價疫苗[11]，在傳統(tǒng)的三價疫苗中增加了一種B型流感病毒。少數(shù)歐美國家使用的減毒活疫苗[12]包含兩種A型和兩種B型流感病毒，以鼻腔噴霧方式接種，具有溫度敏感性，毒株只能在鼻腔和上呼吸道復制，無法在溫度較高的呼吸道下部進行復制，對2~8歲兒童有較好的保護作用，但對老人和免疫缺陷及免疫功能低下人群存在潛在危害。

WHO每年對流感進行全球性監(jiān)測，預測可能流行的幾種代表性病毒類型，每半年更新一次對季節(jié)性疫苗組合的建議[13]。但流感病毒在不斷變化，WHO的監(jiān)測與預測費時、費力，且準確率不高，為了保證當季的疫苗供應，需至少提前七八個月進行生產(chǎn)，這大大增加了疫苗預測的不確定性，且季節(jié)性疫苗對可能發(fā)生的大流行流感也基本無效。目前的疫苗生產(chǎn)主要依賴于雞胚，其生產(chǎn)周期過長，工藝復雜，費時費力，成本相對較高，對雞蛋過敏者無法接種[14]。當新型流感病毒已開始肆虐時，雞胚顯然跟不上日益嚴峻的市場需求，且像H5N1這樣高致病性的禽流感病毒可能導致雞胚死亡[15]。

近幾年出現(xiàn)了采用皮下接種的疫苗，可通過減少疫苗使用劑量來緩解生產(chǎn)壓力[16]。2012年美國食品藥品管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準采用動物細胞代替雞胚生產(chǎn)三價疫苗Flucelvax，適用于18歲以上人群。2013年批準了FluBlok疫苗[17]，為昆蟲細胞系表達的三價重組蛋白疫苗，適用于18~49歲人群。這類疫苗的優(yōu)點是生產(chǎn)周期相對短，對雞蛋過敏者也可接種，但不適用于老人、兒童和慢性疾病患者，且生產(chǎn)后期步驟類同雞胚法，仍不具備替代能力。2014—2015年推出了針對65歲以上老人的Fluzone高劑量疫苗[18]，用于應對老年人免疫系統(tǒng)退化帶來的抗原免疫原性降低的問題，但其安全性仍需考慮，對疫苗的生產(chǎn)也提出了挑戰(zhàn)。

除以上提到的病毒變異、疫苗廣譜性、預測準確率、生產(chǎn)方式、接種人群等因素，獲批使用的疫苗大多通過針對HA誘導具有中和作用的抗體以阻止病毒體內(nèi)感染，具有較強的毒株特異性，缺乏廣譜性。因此，如何更全面、有效、持久地激發(fā)免疫系統(tǒng)，提供更廣泛有效的保護作用，也是目前廣譜流感疫苗面臨的嚴峻挑戰(zhàn)。

2基于靶抗原的廣譜流感疫苗研究進展

2.1基于HA的廣譜流感疫苗

HA是流感病毒包膜上的跨膜糖蛋白三聚體，包括頭部和桿部，具有高度變異性。頭部由HA1結(jié)構(gòu)域組成，介導HA與細胞表面唾液酸受體結(jié)合；桿部介導病毒與細胞膜融合，由HA2和小部分HA1結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，是相對保守區(qū)域，特別是HA2亞單位N端前面的11個氨基酸，在所有已知的流感病毒中高度保守[19-20]。值得一提的是，只有針對HA的特異性抗體可通過中和作用阻止病毒體內(nèi)感染。

中和抗體識別的優(yōu)勢抗原表位主要位于HA頭部，此部位最易發(fā)生抗原漂變(antigen drift)，因此針對HA頭部的中和抗體具有較強的毒株特異性，且病毒會選擇性地向逃逸中和抗體方向突變，抗體很難實現(xiàn)交叉保護效果。HA桿部抗原性較弱，在進化過程中高度保守，桿部中和抗體可抑制低pH引起的HA2構(gòu)象變化，從而阻止病毒在細胞內(nèi)釋放核衣殼。HA頭部較多的優(yōu)勢表位會阻礙桿部的次優(yōu)勢表位被免疫系統(tǒng)識別，且針對HA桿部的抗體主要識別HA近膜端保守的構(gòu)象表位，由于空間位阻，HA桿部中和抗體較難接近其所識別的表位，因此自然感染狀態(tài)下針對HA桿部的抗體數(shù)量及中和能力均遠弱于針對HA頭部的抗體[21]。

在自然感染狀態(tài)下，雖然HA頭部在誘導中和抗體產(chǎn)生時具有顯著的免疫優(yōu)勢，但頭部的改變大多并不影響流感病毒的基本功能，只是改變病毒的致病性和病原性。針對HA桿部的抗體介導的抗體依賴細胞介導的細胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)較強，且HA桿部保守性高，此處受到攻擊會使流感病毒不能存活[22]。因此，不管是針對HA頭部還是桿部的疫苗研究均具有重要意義。

2.1.1靶向HA頭部的廣譜中和抗體

針對HA頭部的廣譜中和抗體大多靶向頭部受體結(jié)合槽。受體結(jié)合槽是HA頭部唯一的保守結(jié)構(gòu)，但其周圍的氨基酸殘基易突變，限制了靶向受體結(jié)合槽抗體的廣譜性；且結(jié)合槽內(nèi)部雖然高度保守，但相對分子質(zhì)量太小。因此，這類中和抗體極少[21]。大多數(shù)針對HA頭部廣譜中和抗體的產(chǎn)生與針對桿部廣譜中和抗體的產(chǎn)生類似，可能是個體在很長一段時間內(nèi)暴露和識別多種不同HA頭部而產(chǎn)生的。2010年，Corti等[23]從一名接種季節(jié)性流感疫苗的個體中分離到FE17抗體，能中和H1和H5流感病毒；2011年，Schlütter等[24]從一名2007年流感疫情中接種疫苗的志愿者體內(nèi)分離出針對HA受體結(jié)合槽的CH65抗體，可抵御36株H1流感病毒中的30種，證明以受體結(jié)合槽為靶點的疫苗研發(fā)是可行的。但目前看來，靶向HA頭部的中和抗體不如靶向桿部的中和抗體更為廣譜。

2.1.2靶向HA桿部的廣譜中和抗體

近年來發(fā)現(xiàn)的流感廣譜中和抗體大多靶向HA桿部。第1個桿部廣譜中和抗體是1992年的鼠源單克隆抗體C179[25]，可識別H1、p、H5亞型毒株。最早的人源桿部廣譜中和抗體是2008和2009年采用噬菌體展示文庫篩選分離到的CR6261[26]和F10抗體[20]。這類廣譜中和抗體并不能改變HA三聚體的結(jié)構(gòu)，但能阻止低pH誘導的HA2蛋白結(jié)構(gòu)化，目前克魯塞爾公司已將CR6261抗體進行Ⅰ期臨床試驗。之后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一些此類廣譜中和抗體，這些抗體除能直接中和病毒外，還可通過ADCC和補體依賴的細胞毒作用(complement-dependent cytotoxicity, CDC)來抵制流感病毒[27]。但桿部廣譜中和抗體基本只對流感病毒Ⅰ類(H1、p、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、H16、H17、H18)或Ⅱ類(p、H4、H7、H10、H14、H15)內(nèi)部具有廣譜保護作用，在兩類之間幾乎沒有交叉保護作用[28]。2015年高福等[29]發(fā)現(xiàn)了桿部廣譜中和抗體CT149，對Ⅱ類流感病毒和部分Ⅰ類流感病毒有交叉保護作用。由于自然感染狀態(tài)下HA桿部為免疫次優(yōu)勢部位，因此如何誘導針對免疫原性較弱的HA桿部廣譜中和抗體的產(chǎn)生以充分發(fā)揮其作用至關(guān)重要。

2.1.3基于廣譜中和抗體的疫苗設(shè)計

有研究顯示，在H5N1感染幸存者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的桿部廣譜中和抗體在2009年的H1N1毒株刺激下，抗體水平顯著增加，因此猜測機體被具有不同HA頭部的流感疫苗免疫后可增加桿部的抗體效價[30]。有研究利用H5N1、H7N1和豬來源的H1N1毒株構(gòu)建了疫苗，免疫結(jié)果顯示其更傾向于活化桿部抗體，也支持了這種假說[31]。目前認為流感廣譜中和抗體的產(chǎn)生與個體對流感病毒的暴露史密切相關(guān)，第1次暴露的病毒類型可能非常重要，清楚暴露史對疫苗的設(shè)計具有重要意義[28]。受益于這種假說的幾種疫苗策略已在許多研究中顯示了較好的免疫保護效果。

為活化HA桿部廣譜中和抗體，諸多研究根據(jù)預測的HA桿部廣譜中和抗體表位或HA0酶切位點等設(shè)計多肽疫苗[32-33]。有研究以缺失頭部的p蛋白作為免疫原構(gòu)建疫苗，結(jié)果顯示能保護小鼠免受p亞型病毒的攻擊，保護部分小鼠免受不同亞型病毒的攻擊[34]；有研究基于H1N1和pN2構(gòu)建了缺失HA頭部的DNA疫苗和病毒樣顆粒(virus-like particle, VLP)疫苗，共同免疫小鼠后顯示了較弱的免疫保護效果[35]；基于p亞型病毒高度保守的HA2 α-螺旋合成肽疫苗，能誘導小鼠產(chǎn)生不同水平的針對H5和H1亞型病毒的免疫保護反應[36]。

目前，更多研究致力于削弱占免疫優(yōu)勢的HA頭部免疫反應，同時增強HA桿部的免疫反應。如采用初免-加強免疫策略，即用DNA疫苗進行初免，蛋白疫苗或病毒載體疫苗等進行加強免疫。有研究以H5N1 HA桿部作為DNA疫苗進行初免，用H5N1滅活疫苗進行加強免疫，顯示小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了高效價的針對HA桿部的廣譜中和抗體[37]。為更好地刺激HA桿部廣譜中和抗體產(chǎn)生，許多研究將不同種的HA頭部與同種HA桿部組合成多個新的嵌合HA(chimeric haemagglutinin, cHA)進行多次免疫，由此擺脫HA頭部的免疫優(yōu)勢，充分活化針對桿部的抗體；且多個不同的HA頭部在一定程度上模擬了自然狀態(tài)下機體被多種流感病毒感染的過程，也有助于機體產(chǎn)生廣譜免疫反應[38]。但在H5N1疫苗研究中發(fā)現(xiàn)，首先接種能活化高水平桿部抗體的疫苗，其后若接種同樣的疫苗則主要產(chǎn)生了針對頭部的抗體應答[38]。這一現(xiàn)象暗示免疫的cHA頭部一旦與機體免疫系統(tǒng)曾接觸的流感病毒一樣或類似，頭部會迅速重新獲得免疫優(yōu)勢，無法充分活化桿部抗體。許多研究中，cHA策略在體內(nèi)實驗中顯示了較好的免疫保護效果，但仍具有優(yōu)化空間。

2.2基于M2的廣譜流感疫苗

M2是A型流感病毒的3種表面抗原之一，是流感病毒囊膜上的一種四聚體通道蛋白，稀疏地分布在病毒顆粒表面，但大量分布在感染細胞表面。在病毒感染過程中，可通過降低pH使HA產(chǎn)生構(gòu)象變化，促使膜融合而釋放病毒核酸。M2的保守程度較高，其N端的24個氨基酸組成M2的胞外區(qū)(M2e)，是流感病毒中最保守的部分，被認為是廣譜流感疫苗研發(fā)的重要靶蛋白。目前已有多個基于M2的疫苗進入臨床試驗階段[39-40]。

針對M2的抗體不能中和、清除病毒，很可能是通過ADCC發(fā)揮作用。研究顯示，針對M2e的單克隆抗體14C2雖不顯示血凝抑制活性，但過繼14C2抗體的小鼠在攻毒后，與對照小鼠相比，肺部病毒滴度降低了100倍左右，肺部損傷相對減輕。此項研究證實，基于流感病毒M2e的抗體可產(chǎn)生一定的免疫保護作用[41]；表達M2的昆蟲桿狀病毒顆粒與全病毒滅活疫苗組合，可保護小鼠抵抗多種流感病毒的攻擊[42]。

目前研究均顯示，基于M2的廣譜流感疫苗的設(shè)計安全性高，免疫原性和耐受性良好，沒有顯著不良反應。M2相對分子質(zhì)量小，引起的免疫反應弱而短暫，且這種免疫保護作用僅僅針對A型流感病毒，因此目前有很多策略來增強M2的免疫原性，如添加佐劑、將M2或M2e進行多聚體表達、與免疫原性較強的大分子蛋白融合表達、通過腺病毒載體表達構(gòu)建VLP等[41]。中國科學院上海巴斯德研究所周東明等[43]采用VR1區(qū)缺失的腺病毒載體構(gòu)建了M2e流感疫苗，顯示了較好的免疫保護效果。

2.3基于NP的廣譜流感疫苗

流感病毒NP蛋白是與病毒遺傳物質(zhì)RNA結(jié)合的主要成分，其氨基酸序列高度保守，在所有A型流感病毒株中保守性達90%左右[44]。NP為病毒內(nèi)部蛋白，并不暴露于病毒表面，也不表達于感染細胞表面，因此主要誘導機體產(chǎn)生細胞反應，特別是細胞毒性T細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)反應[45]。針對NP的特異性抗體在降低病毒載量、加快病毒清除及交叉免疫保護中發(fā)揮重要作用，可通過ADCC途徑發(fā)揮效應[46]。在免疫三價流感疫苗的研究中發(fā)現(xiàn)，人體內(nèi)NP抗體很難被活化，且抗體水平個體差異很大，因此NP抗體介導的ADCC在人體中能否發(fā)揮廣譜保護作用仍有待進一步研究[47]。

Lillie等[48]構(gòu)建了基于H1N1流感病毒NP蛋白的痘病毒載體疫苗，實驗結(jié)果顯示免疫后小鼠不僅能抵御人流感病毒pN2的攻擊，還能有效抵御禽流感病毒H5N2的攻擊。Dynavax公司[49]利用昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)表達了流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的NP蛋白，將NP蛋白和CpG寡核苷酸佐劑——免疫刺激DNA 序列(immuno-stimulatory DNA sequence, ISS)以混合或偶聯(lián)等不同方式免疫小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NP-ISS偶聯(lián)疫苗對不同亞型pN2流感病毒的交叉保護率達80%左右。這些研究均為基于NP的通用流感疫苗的研發(fā)提供了參考。

3結(jié)語

近年來流感頻頻肆虐，嚴重危害人類健康和公共衛(wèi)生，流感的防治仍是一個亟待解決的難題。一方面，流感病毒對目前用于治療的抗病毒藥物極易產(chǎn)生耐藥性；另一方面，目前獲得批準使用的流感疫苗均為季節(jié)性流感疫苗，僅對亞型內(nèi)抗原匹配較好的毒株具有免疫保護作用，疫苗毒株依賴于WHO每年的監(jiān)測與預測，且生產(chǎn)周期長、成本高，難以應對流感大流行。近年來流感病毒廣譜中和抗體的發(fā)現(xiàn)、對流感病毒抗原保守區(qū)域及細胞免疫機制的深入研究、疫苗免疫策略的優(yōu)化等均為廣譜流感疫苗的研發(fā)提供了新思路。目前，基于誘導流感病毒HA廣譜中和抗體為目標的疫苗設(shè)計初步取得了一些成果，基于NP、M2等內(nèi)部保守抗原，基于誘發(fā)T細胞免疫反應及ADCC效應等策略的疫苗設(shè)計也取得了相當大的進展，均在動物實驗中顯示了一定的交叉保護效果。

上述研究為廣譜流感疫苗的研發(fā)提供了大量實驗資料，但仍存在諸多挑戰(zhàn)。流感病毒HA的免疫優(yōu)勢與其高度變異性之間的矛盾仍是疫苗研發(fā)中需解決的關(guān)鍵問題?；趶V譜中和抗體的疫苗設(shè)計還應考慮如何使免疫系統(tǒng)得到更全面、有效、持久的激發(fā)；流感病毒內(nèi)部保守的NP、M2等非中和性抗原屬于弱保護性抗原，其誘發(fā)的免疫保護效果仍需進一步增強和穩(wěn)定；聯(lián)合疫苗采用不同類型的疫苗進行初免和加強，在動物實驗中顯示了較好效果，但其機制研究需更深入；開發(fā)新型生產(chǎn)方式替代雞胚和添加能提高保護性免疫應答反應的佐劑，也是改進疫苗生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)，需不斷完善。

不管是針對季節(jié)性流感還是大流行流感的疫苗，其設(shè)計、研發(fā)與生產(chǎn)進程都處在快速發(fā)展階段，廣譜流感疫苗的研發(fā)又一次成為研究熱點。隨著流感病毒學研究的深入、生物信息學技術(shù)的發(fā)展、疫苗生產(chǎn)方式的變革，如何將這些研究進展轉(zhuǎn)化為可行的疫苗設(shè)計和生產(chǎn)策略，開發(fā)對A、B型流感病毒所有亞型均具有交叉保護作用的廣譜流感疫苗勢在必行。

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Corresponding author. XU Jianqing，E-mail：xujianqing2014@126.com

·綜述·

Progress and perspectives of universal influenza vaccine

XIE Xinci, LIU Lu, YUAN Songhua, ZHANG Xiaoyan, XU Jianqing

Shanghai Public Health Clinical Center Affiliated to Fudan University, Shanghai 201508, China

Abstract:Influenza virus infections are a major public health concern and cause significant morbidity and mortality worldwide. Prevention of influenza through vaccine development is the most effective management strategy, but it is challenged by the evolution of influenza virus variants that could help viruses evade human immunity. Furthermore, the licensed influenza vaccines only induce strain-specific immunity and cannot provide reliable protection against unexpected pandemics and epidemics caused by antigen drift or shift variants. Therefore, research and development of universal vaccines which induce broad-spectrum immune responses has become a hotspot. The discovery of broadly neutralizing antibodies has provided new insights into vaccine development for the past years, and the lucubration of conserved antigenic regions and the study of cellular immunity and the optimization of vaccine immunization strategy also promote the development of universal influenza vaccine. This review summarizes the encouraging scientific advances in the field with a focus on novel epitope-based approaches in vaccine design.

Key words:Influenza A virus; Universal influenza vaccine; Epitope-based approach; Haemagglutinin; Matrix protein 2

收稿日期：(2015-11-01)

通信作者：徐建青

基金項目：國家自然科學基金(81470094)