金姍，何涌泉，楊瑜, 張曉燕

復(fù)旦大學(xué)附屬公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508

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人類免疫缺陷病毒潛伏庫(kù)定量檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展

金姍，何涌泉，楊瑜, 張曉燕

復(fù)旦大學(xué)附屬公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508

摘要：以靜息CD4+T細(xì)胞為主的人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)潛伏庫(kù)的清除已成為治愈HIV-1感染的主要障礙，人們迫切需要建立一種高通量、可靠的、高靈敏度的方法來定量檢測(cè)病毒潛伏庫(kù)的真實(shí)大小。本文就目前關(guān)于HIV潛伏庫(kù)的多種定量檢測(cè)方法進(jìn)行綜述。

關(guān)鍵詞：人類免疫缺陷病毒；潛伏庫(kù)；定量檢測(cè)

盡管高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療(highly active antiretroviral therapy，HAART)能有效阻斷人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染患者體內(nèi)的病毒復(fù)制，使血漿中病毒載量控制在極低水平(<50拷貝/ml)，然而在治療中斷后的2~8周內(nèi)，多數(shù)患者會(huì)出現(xiàn)血漿病毒載量反彈[1]。原因是HIV在感染急性期就形成了以靜息記憶CD4+T細(xì)胞為主的病毒潛伏庫(kù)(viral reservoir)。病毒潛伏庫(kù)的細(xì)胞包括效應(yīng)記憶T細(xì)胞(effective memory T cell，TEM)[2]、中心記憶T細(xì)胞(central memory T cell，TCM)、過渡型記憶T細(xì)胞(transitional memory T cell)[3]和記憶性干細(xì)胞樣T細(xì)胞(memory stem cell-like T cell)[4]。此外，對(duì)血漿中殘余HIV序列的研究發(fā)現(xiàn)[2-3]，巨噬細(xì)胞、濾泡樹突細(xì)胞、小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞等也可能成為潛伏庫(kù)的組成部分。這些病毒潛伏庫(kù)細(xì)胞的半衰期較長(zhǎng)(44個(gè)月)，在治療中斷后成為感染復(fù)發(fā)的主要源頭[5]。目前有多種HIV潛伏庫(kù)的清除策略，如引蛇出洞療法(shock and kill)[6]、基因修飾技術(shù)[7]、基因打靶技術(shù)[8]等，但主要問題是如何評(píng)價(jià)這些干預(yù)措施的有效性。因此，人們迫切需要建立一種高通量、可靠的、高靈敏度的方法來定量檢測(cè)病毒潛伏庫(kù)的真實(shí)大小，從而用于臨床藥物動(dòng)力學(xué)效果的評(píng)價(jià)和完全治愈的判定[9]。本文主要綜述目前HIV潛伏庫(kù)的多種定量檢測(cè)方法。

1基于體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的HIV潛伏庫(kù)定量檢測(cè)技術(shù)

1.1病毒擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)

VOA法(viral outgrowth assay)目前被認(rèn)為是測(cè)量潛伏狀態(tài)下攜帶復(fù)制型前病毒的靜息CD4+T細(xì)胞拷貝數(shù)的金標(biāo)準(zhǔn)[10]。從接受HAART的患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中分選的靜息CD4+T細(xì)胞在無外界刺激時(shí)不產(chǎn)生病毒顆粒。將稀釋后的靜息CD4+T細(xì)胞與經(jīng)γ線照射的健康人PBMC按比例混合，再加入一種很強(qiáng)的促細(xì)胞分裂素——植物凝集素(phytohemagglutinin，PHA)共培養(yǎng)，經(jīng)γ線照射后的PBMC可增強(qiáng)高濃度PHA下CD4+T細(xì)胞的激活效率[11]，在共培養(yǎng)過程中PBMC逐漸死亡，僅CD4+T細(xì)胞存活。在上述存活的CD4+T細(xì)胞中加入淋巴母細(xì)胞或持續(xù)增殖的細(xì)胞系MOLT-4/ CCR5共培養(yǎng)2~3周，CD4+T細(xì)胞內(nèi)病毒不斷復(fù)制并釋放，使培養(yǎng)上清液中病毒含量達(dá)到可檢測(cè)水平。取培養(yǎng)上清液，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)最快7 d便可檢測(cè)到病毒顆粒，或通過高靈敏度的反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測(cè)具有復(fù)制能力的子代病毒。VOA法也有局限性，例如不能檢測(cè)出有缺陷的前病毒、需大量血液(120~180 mL)、需在生物安全三級(jí)(biosafety level 3，BSL-3)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行、只能檢測(cè)一輪刺激后的病毒載量而低估了潛伏庫(kù)的實(shí)際大小[12]。

1.2以病毒RNA為指標(biāo)的定量檢測(cè)

在HIV-1復(fù)制早期，HIV前病毒基因的主要存在形式為多剪接mRNA轉(zhuǎn)錄子，在轉(zhuǎn)錄過程中多剪接mRNA轉(zhuǎn)錄子轉(zhuǎn)化為未剪接或單剪接的mRNA 片段。一些mRNA轉(zhuǎn)錄子翻譯成為病毒蛋白，還有一些全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄子被組裝入新的病毒顆粒[13]?；隗w外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HIV潛伏庫(kù)，將患者CD4+T細(xì)胞在板上進(jìn)行有限稀釋，使每孔至多有一個(gè)產(chǎn)毒細(xì)胞，T細(xì)胞經(jīng)最大程度活化后，用定量PCR(quantitative PCR，qPCR)檢測(cè)細(xì)胞產(chǎn)生病毒RNA的頻率，可檢測(cè)到的mRNA包括病毒復(fù)制過程中的未剪接mRNA、多剪接mRNA及培養(yǎng)上清液中的HIV-1 mRNA。培養(yǎng)上清液中的mRNA反映細(xì)胞釋放可復(fù)制型病毒的頻率，使定量檢測(cè)HIV潛伏庫(kù)的效果更精確[14]。最新研究表明，平均1.5%的HIV-1前病毒可重新活化產(chǎn)生病毒顆粒，但來源不同的兩例患者分別有6.8%和8.2%的前病毒可重新活化產(chǎn)生未剪接的HIV-1 RNA[10,13]。這類定量檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn)在于縮短了細(xì)胞培養(yǎng)所需時(shí)間，與VOA法類似的是只檢測(cè)出一輪T細(xì)胞活化下的病毒RNA，且能檢測(cè)出一些有缺陷但產(chǎn)生非感染性病毒顆粒的前病毒。這些方法可能混淆假陰性和假陽(yáng)性結(jié)果，不能準(zhǔn)確定量HIV潛伏庫(kù)的大小[13]。

2基于PCR的HIV潛伏庫(kù)定量檢測(cè)技術(shù)

2.1qPCR檢測(cè)前病毒DNA

PCR已普遍應(yīng)用于定量檢測(cè)靜息狀態(tài)下的HIV，為VOA法提供了一種補(bǔ)充途徑。其中qPCR廣泛用于定量檢測(cè)PBMC[14-15]中的前病毒DNA。以外周血目的細(xì)胞群的總DNA為模板，以HIV-1基因上的一段保守序列為探針，進(jìn)行qPCR檢測(cè)，與已知拷貝數(shù)的前病毒DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比對(duì)，估算感染細(xì)胞數(shù)量。通過qPCR檢測(cè)每個(gè)細(xì)胞中基因組的兩個(gè)拷貝來反映樣本中的總細(xì)胞數(shù)目，采用前病毒DNA拷貝數(shù)目結(jié)合總細(xì)胞數(shù)目可估算藏匿HIV-1 DNA的細(xì)胞頻率。該方法同樣適用于檢測(cè)腸相關(guān)淋巴組織(gut-associated lymphoid tissue，GALT)中的前病毒DNA[16-17]。

2.2微滴數(shù)字PCR檢測(cè)前病毒DNA

新一代PCR——微滴數(shù)字PCR(ddPCRTM)[18]可將反應(yīng)體系無限稀釋至1 000萬份，其中每個(gè)微滴或不含待檢核酸靶病毒分子，或只含一個(gè)待檢靶病毒分子[19]。經(jīng)PCR擴(kuò)增后，對(duì)每個(gè)微滴逐個(gè)進(jìn)行檢測(cè)，有熒光信號(hào)的微滴判為1，沒有熒光信號(hào)的微滴判為0，根據(jù)泊松分布原理及陽(yáng)性微滴的比例即可計(jì)算出靶病毒分子的起始拷貝數(shù)或濃度。與傳統(tǒng)qPCR相比，ddPCRTM測(cè)量HIV前病毒DNA的精確率更高[20-21]，可檢測(cè)外周血中含量極低的病毒序列[19,22]，且無需標(biāo)準(zhǔn)品即可檢測(cè)出靶病毒分子的啟始拷貝數(shù)或濃度[19]。

2.3Alu-PCR檢測(cè)整合形式的前病毒DNA

Alu-PCR用于區(qū)分PBMC和CD4+T細(xì)胞中整合的病毒基因與線性未整合的病毒基因[22]。以外周血目的細(xì)胞群的總DNA為模板，以基因組中普遍存在的Alu重復(fù)序列和HIV-1gag基因?yàn)殡p引物，采用Alu-PCR放大整合狀態(tài)的HIV-1基因，隨后以HIV的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(long terminal repeat，LTR)為引物用套式PCR檢測(cè)。對(duì)于不同的感染細(xì)胞，整合位點(diǎn)與Alu序列的距離不相同，導(dǎo)致對(duì)前病毒DNA的一輪PCR放大效果也不相同。為解決這個(gè)問題，以細(xì)胞不同的HIV-1整合位點(diǎn)與Alu序列的不同距離作整合位點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)曲線，除去距離 Alu序列太遠(yuǎn)的前病毒[22]。此外，還可用linker ligation PCR[23]和反向PCR[24]檢測(cè)整合形式的前病毒DNA。

2.4qPCR和ddPCRTM檢測(cè)2-LTR HIV環(huán)

潛伏形成后，HIV將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，形成整合前復(fù)合體(preintegration complex，PIC)。部分PIC進(jìn)入細(xì)胞核，沒有整合入人基因組，而是在核內(nèi)呈游離狀態(tài)，形成兩種形式：1-LTR環(huán)和2-LTR環(huán)[25-26]。這兩種形式不能整合入人類基因組，也不能產(chǎn)生感染性病毒顆粒，不是潛伏庫(kù)的一部分。但2-LTR環(huán)仍被用于近期感染情況和病毒復(fù)制情況的研究。以2-LTR交叉處側(cè)翼序列為引物，可用ddPCRTM、qPCR對(duì)PBMC中2-LTR環(huán)進(jìn)行測(cè)量[10,27]，但目前對(duì)2-LTR環(huán)的穩(wěn)定性還存在極大爭(zhēng)議[28]。

3單拷貝實(shí)驗(yàn)檢測(cè)血中HIV載量

盡管HAART能將血漿中的HIV載量控制在低至檢測(cè)線以下，但仍能在低病毒載量血漿中檢測(cè)到HIV-1 RNA，表明血漿中存在低水平持續(xù)復(fù)制的HIV。Palmer及其同事研究出了高靈敏度的單拷貝實(shí)驗(yàn)(single-copy assay，SCA)，用以定量檢測(cè)血漿中的殘留HIV，監(jiān)測(cè)患者血漿中的HIV-1 反彈[29]。取患者血液(至少7 mL血漿)，進(jìn)行連續(xù)稀釋，直至最終理論上HIV RNA<1 拷貝/mL。樣本中加入RCAS(一種禽流感反轉(zhuǎn)錄病毒)作為標(biāo)準(zhǔn)。從病毒顆粒中提取RNA，以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，HIV-1gag區(qū)為探針，行RT-PCR檢測(cè)。樣本中HIV-1水平由已知RNA拷貝數(shù)的HIV-1標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定。

研究表明，血漿中的殘留HIV對(duì)目前HAART藥物極其敏感[30]，且主要來源于穩(wěn)定的病毒潛伏庫(kù)而非正在復(fù)制的病毒。因此，血漿中的殘留病毒反映HAART前潛伏庫(kù)細(xì)胞的病毒產(chǎn)量。然而，能產(chǎn)生血漿病毒的細(xì)胞類型還不清楚，血漿病毒與潛伏庫(kù)之間的關(guān)系也尚未明了。SCA是一個(gè)非常好的能檢測(cè)血漿中持續(xù)存在病毒的工具，但在臨床清除實(shí)驗(yàn)中不能精確定量患者潛伏庫(kù)的動(dòng)態(tài)改變[29-30]。

4基于反彈時(shí)間的HIV潛伏庫(kù)定量檢測(cè)

最初認(rèn)為經(jīng)過幾年HAART即可完全治愈HIV-1感染，然而穩(wěn)定存在的病毒潛伏庫(kù)的發(fā)現(xiàn)表明患者必須一直接受HAART，以防止血漿病毒反彈[1]。例如，兩例“柏林患者”因淋巴癌接受骨髓移植而停藥，停藥后12周和32周分別出現(xiàn)了病毒反彈[31]。又如“密西西比嬰兒”在出生后30 h使用了3種抗反轉(zhuǎn)錄藥物治療，1個(gè)月后血漿病毒降低至檢測(cè)線以下[31]；停止治療后，超過2年未在體內(nèi)檢測(cè)到病毒；然后在停止治療后27個(gè)月時(shí)出現(xiàn)了病毒反彈。這3例患者都不存在HIV-1特異性免疫應(yīng)答，證明小部分HIV潛伏庫(kù)由于移植或早期治療而顯著推遲了反彈時(shí)間。

盡管中斷治療是判斷患者是否痊愈的唯一方法，但以HIV反彈時(shí)間來定量檢測(cè)潛伏庫(kù)大小仍受到倫理問題和停藥后不可預(yù)測(cè)因素的限制。相比于持續(xù)接受HAART的患者，中斷治療的患者有更高的發(fā)病率，惡性腫瘤疾病的發(fā)生率增加，且無法預(yù)測(cè)停藥后數(shù)月或數(shù)年可能發(fā)生的病變[32-33]。因此，以中斷HAART來評(píng)估HIV潛伏庫(kù)的縮減仍困難重重。

5HIV潛伏庫(kù)定量檢測(cè)技術(shù)面臨的挑戰(zhàn)

關(guān)于定量檢測(cè)HIV潛伏庫(kù)的挑戰(zhàn)主要來源于兩個(gè)方面。第一是生物性，定量HIV潛伏庫(kù)均基于臨床樣本，而臨床樣本無法代表個(gè)體內(nèi)HIV潛伏庫(kù)的情況；第二是技術(shù)性，臨床測(cè)量HIV潛伏庫(kù)都是尋找一種可靠的高精確性、可靠性、特異性、重復(fù)性技術(shù)來判斷經(jīng)過干預(yù)策略后潛伏庫(kù)的變化[34]。目前為止，還沒有一種方法能準(zhǔn)確定量HIV潛伏庫(kù)實(shí)際大小。作為定量檢測(cè)HIV潛伏庫(kù)的金標(biāo)準(zhǔn)，VOA法能估計(jì)出HIV潛伏庫(kù)的最小范圍，但不能檢測(cè)出所有可復(fù)制型病毒的潛伏感染細(xì)胞[35]，低估了HIV潛伏庫(kù)的實(shí)際大小，可能誤導(dǎo)臨床停止用藥，而一旦停止用藥，最終將引起病毒反彈。除VOA法外，還有很多基于PCR的技術(shù)可測(cè)量HIV-1前病毒DNA。例如，qPCR被廣泛用來測(cè)量未分離的PBMC[14-15]中整合或未整合形式的HIV前病毒DNA，但不能區(qū)分復(fù)制型病毒與有缺陷的前病毒，高估了HIV潛伏庫(kù)大小，不能判斷HIV潛伏庫(kù)何時(shí)已清除干凈，何時(shí)可停止用藥。而新的ddPCRTM技術(shù)[18]被應(yīng)用于定量總HIV DNA和2-LTR環(huán)，但其費(fèi)用高，效率較低。對(duì)于整合形式的HIV DNA，最好的測(cè)量方法就是Alu-PCR；但由于gag探針缺乏特異性，一個(gè)樣本需42個(gè)PCR，過程過于繁瑣[22]。對(duì)于細(xì)胞內(nèi)的HIV RNA，常采用如組蛋白去乙酰酶抑制劑等藥物活化潛伏感染細(xì)胞，產(chǎn)生病毒轉(zhuǎn)錄子；但目前尚無法區(qū)分一些轉(zhuǎn)錄子是持續(xù)保持潛伏狀態(tài)還是進(jìn)行低水平復(fù)制，也不能準(zhǔn)確量化HIV潛伏庫(kù)。對(duì)于血漿中的殘留病毒，一般采用高靈敏度的SCA進(jìn)行檢測(cè)；但血漿病毒與潛伏庫(kù)之間的關(guān)系仍未明了。而基于反彈時(shí)間測(cè)量HIV潛伏庫(kù)大小，則需考慮到停藥風(fēng)險(xiǎn)與疾病進(jìn)程相關(guān)問題。雖然以上實(shí)驗(yàn)均提供了一些新的視角來定量HIV潛伏庫(kù)，但缺乏標(biāo)準(zhǔn)來比較各實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，尚沒有一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)可真正準(zhǔn)確量化HIV潛伏庫(kù)的實(shí)際大小。

6結(jié)語

目前關(guān)于HIV潛伏庫(kù)的定量檢測(cè)研究主要集中在對(duì)外周血的探索，然而外周血中真正被感染的CD4+T細(xì)胞并不多，不能代表整個(gè)HIV潛伏庫(kù)的情況，且殘留病毒血中的病毒序列也不來源于穩(wěn)定的CD4+T細(xì)胞潛伏庫(kù)[36]，這使得量化HIV潛伏庫(kù)充滿不確定性。雖然已有研究表明在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)[37]、GALT[38]和淋巴組織(lymphoid organ)[39]中HIV保持低水平持續(xù)復(fù)制，但關(guān)于組織區(qū)域化與外周血之間的病毒進(jìn)化關(guān)系尚未明了，因此要精確量化HIV潛伏庫(kù)的大小，還需在潛伏庫(kù)建立和調(diào)控機(jī)制方面進(jìn)一步探索。

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為了促進(jìn)及幫助本刊讀者提高專業(yè)英語寫作水平，本期刊出1句英文科技詞句，下一期將刊出其對(duì)應(yīng)的中文詞句，供讀者對(duì)比學(xué)習(xí)。

Malaria is the most important parasitic disease in people, and a major cause of morbidity and mortality in tropical regions. WHO has declared malaria control a global development priority and has changed its focus from containment and control to elimination. Drug resistance inPlasmodiumspecies poses a major obstacle. Resistance inPlasmodiumfalciparum, the main cause of malarial death, has rendered several first-line antimalarial drugs (first chloroquine, then sulfadoxine-pyrimethamine, and in some areas amodiaquine) largely ineffective.

Corresponding author. ZHANG Xiaoyan, E-mail:zhang_xycn2002@yahoo.com.cn

·綜述·

Research progress on measuring the latent reservoir of human immunodeficiency virus

JIN Shan, HE Yongquan, YANG Yu, ZHANG Xiaoyan

Shanghai Public Health Clinical Center Affiliated to Fudan University, Shanghai 201508, China

Abstract:The latent viral reservoir in resting CD4+T cells is widely recognized as a major barrier to cure human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection. A high-throughput, reliable and sensitive assay that can accurately measure the true size of the viral reservoir is urgently needed. In this review, multiple measurement methods of HIV latent reservoir are summarized.

Key words:Human immunodeficiency virus; Reservoir; Quantitative detection

收稿日期：(2015-11-02)

通信作者：張曉燕

基金項(xiàng)目：“十二五”國(guó)家科技重大專項(xiàng)(2013ZX10001-002)