何知廣 胡海平 伍敏生

三水白虎湯含藥血清抑制類風濕關節(jié)炎滑膜成纖維細胞遷移的臨床研究

何知廣 胡海平 伍敏生

目的探討三水白虎湯(SSBH)含藥血清抑制類風濕關節(jié)炎(RA)滑膜成纖維細胞(FLS)遷移的臨床研究。方法利用組織塊培養(yǎng)法來收集RA滑膜FLS,并進行體外傳代培養(yǎng),將20只大鼠隨機分為對照組與研究組,各10只。選取3-6代細胞分別加入對照組(生理鹽水制備的血清培養(yǎng))與研究組(SSBH含藥血清培養(yǎng)),在培養(yǎng)72 h后,提取細胞總蛋白,通過雙向凝膠電泳(2-DE)將細胞總蛋白進行分離,利用凝膠經銀染顯色與圖像數據來識別差異細胞蛋白的位點,隨后對差異細胞蛋白的位點進行鑒別。結果兩組滑膜成纖維細胞蛋白的雙向凝膠電泳圖譜都出現差異細胞蛋白質點,在差異蛋白表達量超過3倍的中蛋白質點中選擇26個差異細胞蛋白質點實施質譜分析,總共鑒定出24種上升的白細胞介素-1(IL-1)受體拮抗蛋白。研究組SSBH 含藥血清對 RA-FLS 分泌 IL-1、白細胞介素-2(IL-2)影響優(yōu)于對照組(P＜0.05)。結論SSBH可以通過類風濕關節(jié)炎患者FLS中的IL-1受體拮抗蛋白來抑制滑膜增生,同時也是治療類風濕關節(jié)炎的一種藥理機制。

三水白虎湯；類風濕關節(jié)炎；滑膜成纖維細胞

RA是一種常見的慢性疼痛性疾病,呈侵蝕性、進行性發(fā)展,對類風濕關節(jié)炎若不及時治療,極易造成患者關節(jié)囊破損、關節(jié)軟骨,嚴重時還會導致關節(jié)畸形,甚至出現關節(jié)功能障礙［1］。本文主要通過2-DE與質譜技術有效分析SSBH含藥血清體外培養(yǎng)類風濕關節(jié)炎患者的關節(jié)滑膜成纖維細胞蛋白表達圖譜,尋找抑制FLS增生的靶點,為類風濕關節(jié)炎治療提供有效的參考依據。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取20只SPF級SD雄性大鼠為研究對象,平均體重(200±20)g,主要由醫(yī)科大實驗中心提供(許可證號SCXK：2012-0017)。滑膜組織主要來自南方醫(yī)院確診類風濕關節(jié)炎患者的膝關節(jié)。SSBH則由醫(yī)科大中醫(yī)院藥房提供［2］。

1.2 方法

1.2.1 SSBH含藥血清設備與老鼠分組 應先進行2次水煎SSBH,混合2次水煎進行取液濃縮,濃度為含生藥2 g/ml,將大老鼠隨機分為對照組(生理鹽水制備的血清培養(yǎng))與研究組(SSBH含藥血清培養(yǎng)),各10只。研究組給予2ml的SSBH灌胃,對照組給予等量的生理鹽水,持續(xù)給藥1周左右［3］。在進行采血時,前1 d晚上應給大鼠禁食,不禁水,次日清晨末進行給藥90min,隨后進行動脈采血,取血清。在56°的溫水中水浴30min滅活,0.22 μm除菌濾膜抽濾除菌,在-20℃溫度下進行保存。

1.2.2 培養(yǎng)滑膜細胞原代 先將滑膜組織剪成1 mm3左右,將其平均排列在培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)面,隨后翻轉培養(yǎng)瓶,并向瓶中添加20%的FBS培養(yǎng)液,將其放置在37℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)；在4 h孵育后待組織塊貼附,將其培養(yǎng)瓶進行翻轉,平放,繼續(xù)培養(yǎng)；在3～4 d后可通過鏡下觀察組織塊旁邊的FLS是否成片生長,去除組織塊之后,再進行培養(yǎng)；當滑膜細胞覆蓋≥80%的培養(yǎng)瓶底面時,進行消化傳代。最后取3-6代的FLS進行鑒定備用［4］。

1.2.3 抽提滑膜細胞總蛋白 將100 μl細胞裂解液加入到每個1.5×106滑膜細胞中,對其進行吹打,使細胞和裂解液進行接觸,放置1 h后,離心4℃ 40000 g,從中吸取上清液,為細胞總蛋白質,在-80℃中進行保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 滑膜細胞總蛋白分離及染色 抽取蛋白樣品、上樣緩沖液,將兩者進行混合,將其加入水化盤中,用鑷子除去IPG膠條上的保護層,把膠面朝下放置在水化盤樣品的溶液之上,1 h后利用礦物油進行密封,在室溫的條件下密封16 h左右,隨后取出膠條,清除多余的液體,將膠條放置在聚焦槽中,加覆蓋礦物油,進行第一向等電聚焦電泳。在聚焦后,取出膠條使其平衡15min,再進行第二向SDS電泳,電泳結束后,取出凝膠利用銀染方法進行顯色［5］。

1.3 觀察指標 觀察對比兩組差異蛋白及SSBH含藥血清對RA-FLS增殖的影響。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件對數據進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數±標準差(±s)表示,采用t檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組差異蛋白比較 兩組滑膜成纖維細胞蛋白的雙向凝膠電泳圖譜都出現差異細胞蛋白質點,在差異蛋白表達量超過3倍的中蛋白質點中選擇26個差異細胞蛋白質點實施質譜分析,總共鑒定出24種上升的IL-1受體拮抗蛋白。研究組SSBH 含藥血清對 RA-FLS 分泌 IL-1、IL-2 影響優(yōu)于對照組(P＜0.05)。見表1。

2.2 SSBH含藥血清對RA-FLS增殖的影響 SSBH含藥血清可呈劑量與時間依賴性抑制RA-FLS的增殖見表2。

表1 SSBH 含藥血清對 RA-FLS 分泌 IL-1、IL-2 影響(±s,pg/ml)

表1 SSBH 含藥血清對 RA-FLS 分泌 IL-1、IL-2 影響(±s,pg/ml)

注：與對照組比較,aP＜0.05

組別 只數 IL-1 IL-2對照組 10 568.32±27.40 146.072±14.640研究組 10 502.21±12.43a 105.500±10.320a

表2 SSBH含藥血清對RA-FLS增殖的影響(±s)

表2 SSBH含藥血清對RA-FLS增殖的影響(±s)

項目 時間 10% 20% 30% RA-SSBH 24 h 0.1550±0.0700 0.1450±0.0140 0.1220±0.0070 48 h 0.1320±0.0300 0.1120±0.0030 0.1040±0.0200 72 h 0.1210±0.0040 0.1010±0.0012 0.1010±0.0013 RA-FLS 24 h 0.1440±0.0170 0.1260±0.0020 0.1230±0.0040 48 h 0.1310±0.0006 0.1150±0.0015 0.1150±0.0017 72 h 0.1300±0.0001 0.1550±0.0001 0.1040±0.0001

3 討論

蛋白質SSBH技術為RA的臨床研究提供了一個新的技術平臺。目前,國內外使用的2-DE技術與質譜技術對類風濕關節(jié)炎患者血漿、滑膜組織、滑膜細胞蛋白質等進行研究發(fā)現,RA中具有多種特異性的蛋白表達［6］。本研究將20%FBS培養(yǎng)液進行72 h的培養(yǎng)后,可最大化抑制細胞增殖、降低滑膜細胞,進行細胞總蛋白的抽提,通過2-DE技術與質譜技術分析SSBH含藥血清體外培養(yǎng)的類風濕關節(jié)炎患者FLS蛋白表達圖譜,利用生理鹽水對空白對照組的差異績效分析,尋找最佳作用的濃度與時間以及抑制滑膜細胞增殖的作用靶點。研究表明,兩組滑膜成纖維細胞蛋白的雙向凝膠電泳圖譜都出現差異細胞蛋白質點,在差異蛋白表達量超過3倍的中蛋白質點中選擇26個差異細胞蛋白質點實施質譜分析,總共鑒定出24種上升的IL-1受體拮抗蛋白。

綜上所述,SSBH可以通過類風濕關節(jié)炎患者FLS中的IL-1受體拮抗蛋白來抑制滑膜的增生,同時也是治療類風濕關節(jié)炎的一種藥理機制。

［1］高燕,肖長虹,潘超,等.三水白虎湯對類風濕關節(jié)炎滑膜成纖維細胞增殖的蛋白質組學影響.山東醫(yī)藥,2013,53(21):7-9.

［2］高燕,肖長虹,潘超,等.三水白虎湯對滑膜成纖維細胞增殖及IL-6、IL-17分泌的影響.中國中西醫(yī)結合雜志,2013,33(10): 1385-1388.

［3］陳德超,肖長虹,吳啟富,等.四甲基偶氮唑鹽法觀察三水白虎湯含藥血清對體外培養(yǎng)關節(jié)炎滑膜細胞增殖的影響.中國組織工程研究與臨床康復,2013， 11(19):3669-3672.

［4］潘超,肖長虹,高燕,等.噬菌體隨機十二肽庫淘選三水白虎湯作用于類風濕關節(jié)炎滑膜細胞的靶點研究.中國免疫學雜志,2014， 30(4):446-448.

［5］夏卿,馮小輝.中藥含藥血清對體外培養(yǎng)類風濕關節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞影響的實驗研究.河南中醫(yī),2014， 34(3):456-457.

［6］高華利,歐陽桂林,黃新星,等.補腎強骨方含藥血清對滑膜成纖維細胞增殖及PCNA和Bcl-2表達的影響.中國骨傷,2012,2(11):942-945.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2016.10.216

2016-02-25］

510150 廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院藥學部(何知廣伍敏生)；中山大學附屬第一醫(yī)院(胡海平)