普伐他汀對新生大鼠成骨細胞的作用研究

曾玉蘭 曾援

·實驗研究·

普伐他汀對新生大鼠成骨細胞的作用研究

曾玉蘭 曾援

目的研究普伐他汀對新生大鼠成骨細胞的作用。方法用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽法(MTT)、4-硝基苯磷酸二鈉法(PNPP)、茜素紅染色法分別檢測普伐他汀對成骨細胞的活力,堿性磷酸酶(ALP)活力及骨礦化結節(jié)面積的作用。結果普伐他汀在10-8～10-4g/ml能促進成骨細胞增殖、提高成骨細胞堿性磷酸酶活性和促進新生大鼠成骨細胞骨結節(jié)形成。結論普伐他汀能促進成骨細胞增殖、分化及礦化。

普伐他汀；成骨細胞；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽法；4-硝基苯磷酸二鈉法；堿性磷酸酶；骨結節(jié)

世界衛(wèi)生組織定義骨密度低于骨密度峰值的2.5個標準差即為骨質疏松癥［1,2］。骨質疏松癥是以骨量低下,骨微結構破壞,導致骨脆性增加,易發(fā)生骨折為特征的全身性代謝性骨?。?,4］。骨質疏松癥的發(fā)病率隨年齡的增加而增加且與雌激素水平有關［5］。流行病學研究表明,大多數(shù)骨質疏松患者為絕經期婦女,在發(fā)達國家中50歲以上婦女中約有50%的人存在骨質疏松性骨折；隨著老齡人口的不斷增加,60歲以上骨質疏松癥患者日益增加,約有25%的60歲以上婦女發(fā)生骨質疏松癥,其中約44%有骨折危險［6］。骨質疏松性骨折帶來的慢性疼痛極大的影響了患者的生活質量,骨質疏松癥已經成為一個嚴重的社會問題［7］。

骨是一個不斷經歷著骨重建的動態(tài)器官,成骨細胞和破骨細胞在維持骨的動態(tài)平衡中扮演著至關重要的角色［8,9］。在骨重建的過程中,首先發(fā)生的是破骨細胞骨吸收動作,隨后成骨細胞在破骨凹陷處進行骨形成活性,一個完整的周期內骨形成的時間遠遠大于骨吸收時間,一旦被破骨細胞吸收骨質形成的凹陷不能被形成的新骨填滿時將會發(fā)生負平衡,如果這種狀態(tài)持續(xù)發(fā)展,骨量丟失到一定程度時,骨折的發(fā)生將不可避免［10,11］。骨質疏松癥發(fā)生的根本原因就是骨吸收作用與骨形成作用的平衡被打破,骨吸收大于骨形成。增強成骨細胞活性能促進骨基質形成,促進骨的礦化形成,增加骨密度［12,13］。因此,增強成骨細胞的活性是治療骨質疏松的基本原則。研究表明,高血脂也是絕經后婦女常見的并發(fā)癥,他汀類藥物具有抗骨質疏松作用已有報道［14］。本實驗旨在研究本醫(yī)院所購買的他汀類藥物普伐他汀是否對新生大鼠顱骨成骨細胞具有積極作用?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 新生SD大鼠選自廣西醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.2 實驗方法

1.2.1 成骨細胞的制備 取新生SD大鼠胎鼠(24 h內),在無菌操作臺中取出顱骨,剔除骨頭上黏附的結締組織和血管,雙抗浸泡數(shù)分鐘后剪碎,用0.25%胰蛋白酶(不含EDTA) 37℃水浴預消化后,棄上清保留骨片,骨片中加含0.1%Ⅰ型膠原酶37℃水浴消化15min后,取消化液離心10min,得到成骨細胞,重復上述膠原酶消化步驟,共消化6次,得到的細胞用10%的胎牛血清DMEM培養(yǎng)液置于37℃,5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),24 h換液,以后每隔2～3 d換液1次,傳代。

1.2.2 普伐他汀對新生大鼠成骨細胞增殖作用 細胞以3000個/孔細胞接種入96孔板,第1列為空白調零。細胞接種24 h后,加入不同濃度的普伐他汀,使終濃度分別是：10-4、10-5、10-6、10-7、10-8g/ml。加藥后分別作用24、48、72 h,實驗結束前4 h加20 μl的MTT(5mg/ml),繼續(xù)在37℃、5% CO2條件下孵育,隨后棄去培養(yǎng)液后加二甲基亞砜150 μl,振搖10min后于酶標儀檢測其吸光度,檢測波長570 nm,參考波長630 nm。

1.2.3 普伐他汀對新生大鼠成骨細胞ALP活性的作用 細胞以3000個/孔的密度接種入96孔板中。24 h后加入不同濃度的普伐他汀,使終濃度分別是：10-4、10-5、10-6、10-7、10-8g/ml。測定藥物作用后第5、7、9天細胞的ALP含量。步驟簡單描述如下,棄培養(yǎng)液,PBS沖洗,加入細胞裂解液50 μl,超聲裂解10min,加入含25 mmol/L二乙醇胺,1 mmol/L氯化鎂和6 mmol/L PNPP的反應液100 μl,37℃放置30min,然后用0.1 mol/L的NaOH 50 μl終止反應,在酶標儀于405 nm波長下測定OD值。樣品OD值在ALP標準曲線上讀取酶活性值(U/L)。

1.2.4 普伐他汀對新生大鼠成骨細胞骨結節(jié)形成的作用 采用維生素C和p-甘油磷酸鈉誘導新生大鼠成骨細胞成熟礦化,普伐他汀5個濃度處理18 d后,取盡12孔板各孔培養(yǎng)上清液后,用PBS沖洗培養(yǎng)板2次,95%乙醇固定10min,用PBS再沖洗3次,各孔均加入0.1%茜素紅1ml,于37℃下放置30min,蒸餾水沖洗、甩干。于光鏡下觀察,以紅染、邊界清晰、短徑＞100 μm的標準,于40倍光鏡下對各孔分別計數(shù),各孔均重復3次。

2 結果

2.1 普伐他汀對新生大鼠成骨細胞增殖作用 成骨細胞增殖在決定新骨形成中起重要作用,普伐他汀濃度為10-4、10-5、10-6、10-7、10-8g/ml均能促進成骨細胞增殖。見表1,圖1。

2.2 普伐他汀對新生大鼠成骨細胞ALP活性的作用 ALP是反映成骨細胞分化早期活性的特異指標,ALP在成骨細胞分化早期處于一個上升的過程,在此過程中其表達的多少能反映出成骨細胞的分化程度和功能狀態(tài)。新生大鼠成骨細胞在普伐他汀不同濃度的刺激下,ALP活性顯著升高。見表2,圖2。

圖1 普伐他汀對大鼠成骨細胞增殖的影響

表1 普伐他汀對大鼠成骨細胞增殖影響的OD值(±s,n=6)

表1 普伐他汀對大鼠成骨細胞增殖影響的OD值(±s,n=6)

濃度 24 h 48 h 72 h對照 0.278±0.0304 0.335±0.0313 0.339±0.0061 10-8g/ml 0.351±0.0318 0.407±0.0234 0.415±0.0282 10-7g/ml 0.357±0.0319 0.412±0.0294 0.423±0.0363 10-6g/ml 0.360±0.0462 0.425±0.0221 0.446±0.0332 10-5g/ml 0.366±0.0148 0.446±0.0222 0.447±0.0194 10-4g/ml 0.282±0.0019 0.345±0.0053 0.349±0.0039

表2 普伐他汀對新生大鼠成骨細胞ALP活性影響的OD值(±s,n=6)

表2 普伐他汀對新生大鼠成骨細胞ALP活性影響的OD值(±s,n=6)

濃度 第3天 第5天 第7天對照 1.104±0.0522 1.015±0.0463 1.036±0.1148 10-8g/ml 1.475±0.0965 1.488±0.0823 1.603±0.0774 10-7g/ml 1.583±0.2006 1.588±0.0415 1.629±0.0923 10-6g/ml 1.651±0.2007 1.689±0.0487 1.714±0.0895 10-5g/ml 1.757±0.0704 1.779±0.0706 1.848±0.0431 10-4g/ml 1.018±0.0105 1.016±0.0181 1.015±0.0024

圖2 普伐他汀對新生大鼠成骨細胞ALP活性的影響

2.3 普伐他汀對新生大鼠成骨細胞骨結節(jié)形成的作用 在細胞外基質礦化期,是以骨結節(jié)的形成及數(shù)量為特征。骨結節(jié)是分化成熟成骨細胞形成多層疊加的結節(jié)樣結構,同時骨結節(jié)是衡量成骨細胞分化晚期活性的指標?；衔镌跐舛葹?0-4、10-5、10-6、10-7、10-8g/ml作用20 d后,能夠影響新生大鼠成骨細胞骨結節(jié)形成。見圖3。

圖3 普伐他汀對成骨細胞骨礦化結節(jié)的影響

3 討論

骨質疏松癥是由多種原因引起的退行性骨骼疾病,以骨量減少、骨微結構破壞導致骨脆性增加易發(fā)生骨折為特征。促進成骨細胞增殖分化以及礦化是防治骨質疏松的策略之一,本實驗通過體外實驗細胞水平將普伐他汀作用于成骨細胞,研究其對成骨細胞的作用。

本實驗選擇酶消化法來分離原代成骨細胞。酶消化法是指新生大鼠顱骨剪碎后,經胰酶和Ⅰ型膠原酶在37℃水浴下反復消化5次,收集上清液在800 rpm離心10min后,取細胞沉淀接種于培養(yǎng)瓶中得到原代成骨細胞的方法。原代成骨細胞貼壁生長24 h后更換培養(yǎng)基,去除未貼壁的成纖維細胞、軟骨細胞等雜質細胞,待細胞長滿至培養(yǎng)瓶底80%時進行傳代培養(yǎng)。此后通過換液和傳代不斷去除雜質細胞,細胞傳至第3代時,可得到純化的成骨細胞用于實驗研究。本研究結果發(fā)現(xiàn)：成骨細胞增殖在決定新骨形成中起重要作用,普伐他汀濃度為10-4、10-5、10-6、10-7、10-8g/ml均能促進成骨細胞增殖。ALP是反映成骨細胞分化早期活性的特異指標,ALP在成骨細胞分化早期處于一個上升的過程,在此過程中其表達的多少能反映出成骨細胞的分化程度和功能狀態(tài)。新生大鼠成骨細胞在普伐他汀不同濃度的刺激下,ALP活性顯著升高。在細胞外基質礦化期是以骨結節(jié)的形成及數(shù)量為特征。骨結節(jié)是分化成熟成骨細胞形成多層疊加的結節(jié)樣結構,同時骨結節(jié)是衡量成骨細胞分化晚期活性的指標。化合物在濃度為10-4、10-5、10-6、10-7、10-8g/ml作用20 d后,能夠影響新生大鼠成骨細胞骨結節(jié)形成。

成骨細胞是骨形成過程中的重要功能細胞,它能夠表達很多種離子通道來促進骨形成,同時在骨重建過程中能夠間接的調節(jié)破骨細胞骨吸收過程,對骨重建、骨損傷修復起到了關鍵的作用［15］。成骨細胞增殖期細胞數(shù)量增加,在成骨分化早期成骨細胞表達ALP并釋放類骨質形成鈣化沉積,同時在骨形成過程中分泌的Ⅰ型膠原酶也能夠幫助礦化形成鈣化結節(jié)［16］。目前常將ALP和鈣化結節(jié)作為成骨細胞鑒定的評價指標。

綜上所述,普伐他汀在濃度為10-5、10-6、10-7、10-8g/ml提高成骨細胞的活力,促進成骨細胞的增殖,在相同作用濃度下,成骨細胞ALP增高。但是其作用機制尚未闡明,有待于進一步研究。

［1］Effendy NM,Shuid AN.Time and dose-dependent effects of Labisia pumila on bone oxidative status of postmenopausal osteoporosis rat model.Nutrients,2014,6(8):3288-3302.

［2］Makras P,Athanasakis K,Boubouchairopoulou N,et al.Cost-effective osteoporosis treatment thresholds in Greece.Osteoporos Int,2015,26(7):1949-1957.

［3］Alonso V,de Gortazar AR,Ardura JA,et al.Parathyroid hormone-related protein (107-139) increases human osteoblastic cell survival by activation of vascular endothelial growth factor receptor-2.J Cell Physiol,2008,217(3):717-727.

［4］Aras MH,Bozdag Z,Demir T,et al.Effects of low-level laser therapy on changes in inflammation and in the activity of osteoblasts in the expanded premaxillary suture in an ovariectomized rat model.Photomed Laser Surg,2015,33(3):136-144.

［6］Filip R,Possemiers S,Heyerick A,et al.Twelve-month consumption of a polyphenol extract from olive (Olea europaea) in a double blind,randomized trial increases serum total osteocalcin levels and improves serum lipid profiles in postmenopausal women with osteopenia.J Nutr Health Aging,2015,19(1):77-86.

［7］Cairoli E,Zhukouskaya VV,Eller-Vainicher C,et al.Perspectives on osteoporosis therapies.J Endocrinol Invest,2015,38(3):303-311.

［8］Adapala NS,Barbe MF,Langdon WY,et al.The loss of Cbl-phosphatidylinositol 3-kinase interaction perturbs RANKL-mediated signaling inhibiting bone resorption and promoting osteoclast survival.J Biol Chem,2010,285(47):36745-36758.

［9］Adapala NS,Barbe MF,Tsygankov AY,et al.Loss of Cbl-PI3K Interaction Enhances Osteoclast Survival due to p21-Ras Mediated PI3K Activation Independent of Cbl-b.J Cell Biochem,2014,115(7):1277-1289.

［10］Chen LL,Huang M,Tan JY,et al.PI3K/AKT pathway involvement in the osteogenic effects of osteoclast culture supernatants on preosteoblast cells.Tissue Eng Part A,2013,19(19-20):2226-2232.

［11］Amstrup AK,Sikjaer T,Mosekilde L,et al.Melatonin and the skeleton.Osteoporos Int,2013,24(12):2919-2927.

［12］Cao H,Yu S,Yao Z,et al.Activating transcription factor 4 regulates osteoclast differentiation in mice.J Clin Invest,2010,120(8):2755-2766.

［13］Chen Y,Gao H,Yin Q,et al.ER stress activating ATF4/CHOP-TNF-alpha signaling pathway contributes to alcohol-induced disruption of osteogenic lineage of multipotential mesenchymal stem cell.Cell Physiol Biochem,2013,32(3):743-754.

［14］Lin S,Huang J,Fu Z,et al.The effects of atorvastatin on the prevention of osteoporosis and dyslipidemia in the high-fat-fed ovariectomized rats.Calcified tissue international,2015,96(6):541-551.

［15］Chen J,Zhang H,Zhang X,et al.11 Mol Biol Epithelial sodium channel enhanced osteogenesis via cGMP/PKGII/ENaC signaling in rat osteoblast.Mol Biol Rep,2014,41(4):2161-2169.

［16］Chaturvedi R,Singha PK,Dey S.Water soluble bioactives of nacre mediate antioxidant activity and osteoblast differentiation.PLoS One,2013,8(12):1524-1528.

Research of effect by pravastatin for osteoblast in infant rats

ZENG Yu-lan,ZENG Yuan.Nanxiong City People’s Hospital,Nanxiong 512400,China

ObjectiveTo research effect by pravastatin for osteoblast in infant rats.Methods3-(4,5-dimethylthiahiazo-2)-2,5-phenytetrazoliumromide (MTT),4-nitrophenyl phosphate (PNPP) and alizarin red staining were applied respectively to detect activity of pravastatin for osteoblast,activity of alkaline phosphatase (ALP),and effect of bonemineralization nodule area.ResultsPravastatin in concentration of 10-8～10-4g/ml accelerated osteoblast multiplication,and improve activity of osteoblast ALP,and promote osteoblast bone nodule formation in infant rats.ConclusionPravastatin can accelerate multiplication,differentiation andmineralization in osteoblast.

Pravastatin; Osteoblast; 3-(4,5-dimethylthiahiazo-2)-2,5-phenytetrazoliumromide; 4-nitrophenyl phosphate; Alkaline phosphatase; Bone nodule

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2016.10.214

2016-02-02］

512400 南雄市人民醫(yī)院

曾援