針對羅紅霉素合成工藝的改進(jìn)分析

成佳興

哈藥集團(tuán)制藥總廠科研開發(fā)中心 150000

針對羅紅霉素合成工藝的改進(jìn)分析

成佳興

哈藥集團(tuán)制藥總廠科研開發(fā)中心 150000

以無水碳酸鈉為催化劑制造羅紅霉素的工藝，是當(dāng)今推廣度最高的合成工藝。藥理反應(yīng)的適宜溫度為4攝氏度到6攝氏度之間，然后進(jìn)行攪拌的步驟，反應(yīng)的時間設(shè)置為40分鐘。其中活性炭的用量為百分之一。這樣的制取工藝的優(yōu)點在于方法較其他方法更加可靠，并且制取的步驟也很少，操作簡單，適于大批量的生產(chǎn)。

羅紅霉素；合成工藝；催化劑的選擇

羅紅霉素在抗生素中的類別是新一代大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，羅紅霉素對革蘭氏陽性菌、厭氧菌、衣原體與支原體等病菌具有明顯的抑制作用。對于外抗菌的抑制作用羅紅霉素與紅霉素相類似。但是羅紅霉素對于體內(nèi)抗菌的作用卻比紅霉素要強(qiáng)1到4倍。羅紅霉素的抗菌譜與紅霉素的也較相近，其中對于金黃色葡萄球菌、消化菌、等一些體內(nèi)感染菌具有良好的抗菌作用，羅紅霉素對于支原體肺炎與沙眼衣原體感染也有良好的治療性。

1.儀器與制藥

1.1 儀器

HTY-2000集菌儀、集菌培養(yǎng)器（孔徑為 0.45μm），HH.BII.420電熱恒溫培養(yǎng)箱、LRH-250A 生化培養(yǎng)箱、SartoriusBS2002S電子天平、SA-1480-Ⅱ凈化工作臺。

1.2 培養(yǎng)基

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、MUG培養(yǎng)基，均購于中檢所。

1.3 菌種

枯草芽孢桿菌CMCC（B）63501、金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003、大腸埃希菌CMCC（B）44102、白色念珠菌CMCC（F）98001、黑曲霉CMCC（F）98003（以上菌株均為第三代），均購于中檢所。

1.4 菌液制備

1.4.1 取經(jīng)30℃～35℃培養(yǎng)18～24小時的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液1ml，加0.9%無菌氯化鈉至每ml含菌50～100cfu。

1.4.2 取經(jīng)23℃～28℃培養(yǎng)24～48小時的白色念珠菌改良馬丁培養(yǎng)液1ml，加0.9%無菌氯化鈉至每ml含菌50～100cfu。

1.4.3 取經(jīng)23℃～28℃？培養(yǎng)5～7天的黑曲霉改良馬丁營養(yǎng)瓊脂斜面，用0.9%無菌氯化鈉3～5ml將孢子洗脫，加0.9%無菌氯化鈉至每ml含菌50～100cfu

2.實驗方法

2.1 細(xì)菌霉菌與酵母菌的驗證方法

方法的驗證過程為是將驗證分為3次獨立的驗證，并且設(shè)置為平行驗證的方式。第一個步驟是，先取試品10克，然后的進(jìn)行第二步，將PH值為7.0的氯化鈉-蛋白胨緩沖液加至刻度數(shù)為100g，這樣就調(diào)制出比例為1:10的供試液了。驗證的實驗完成后就將各試驗菌的回收率進(jìn)行計算。最后一步是將實驗組的1：10供試液取出1毫升，將50毫升含有5%的乙醇的無菌蛋白胨溶液中去，將調(diào)配好的溶液進(jìn)行搖勻處理，在立刻過濾，濾膜選用500毫升5%乙醇的1%無菌蛋白胨溶液進(jìn)行沖洗，再用注射器加入1毫升的菌液，在進(jìn)行濾干處理，將濾膜取出進(jìn)行培養(yǎng)。每株菌株都各做一份實驗。

2.2 培養(yǎng)實驗

帶實驗中的菌株培養(yǎng)的時間過去后，就可以進(jìn)行下一步的實驗了，就是在菌液組中取出1毫升的菌液，放入平皿中，這時再立刻加入相應(yīng)數(shù)量的瓊脂，再做菌株平行實驗各兩份。實驗完畢后，將對供試品的本地菌數(shù)進(jìn)行測定。在對稀釋液進(jìn)行對照時可以先將上述菌液取出各1毫升加入50毫升含有5%乙醇的無菌蛋白胨溶液中，進(jìn)行濾液處理，再將濾液分五次進(jìn)行清洗的處理，濾干。

3.計算公式

實驗組的菌回收率=（實驗組平均菌落數(shù)―供試品對照組平均菌落數(shù)）/菌液組的平均菌落數(shù)，稀釋劑對照組的菌回收率=稀釋劑對照組平均菌落數(shù)/菌液組的平均菌落數(shù)。

細(xì)菌、霉菌及酵母菌回收率試驗采用先制成1：10供試液，再用薄膜過濾法檢查，試驗組的回收在70%以上，表明可用上述方法檢查細(xì)菌、霉菌及酵母菌。

4.結(jié)果

通過對實驗數(shù)據(jù)的分析，我們可以看出，實驗組的各控制菌的回收率均達(dá)到或是高于 70%,這樣的結(jié)果表明用上述沖洗濾膜的方法可行。

5.常規(guī)發(fā)與濾膜法實驗的對比

對于常規(guī)法的實驗步驟基本與濾膜法相同，將實驗菌在供試液上進(jìn)行培養(yǎng)，再將實驗的培養(yǎng)皿放在適宜的溫度中進(jìn)行靜置培養(yǎng)處理，但是相關(guān)的步驟進(jìn)行完畢后，會在實驗中發(fā)現(xiàn)，由于羅紅霉素這種抗生制劑會對菌群的生長起到很強(qiáng)的抑制作用，用常規(guī)法在對控制菌回收率進(jìn)行測定時，會受到羅紅霉素的影響，故驗證時無法采用常規(guī)法，必須選擇濾膜法。

5.1 不使用常規(guī)法原因分析

羅紅霉素的化學(xué)性質(zhì)所致，把它放在乙醇或是丙酮的溶液中會很容易就自行溶解了，在其他的溶液中的溶解度是在乙腈中可溶，在甲醇中也可溶，但是羅紅霉素在水中的溶解度為零，在《中國藥典》2010版二部規(guī)定中的兩種沖劑，對于羅紅霉素的沖洗是無法將干擾沖洗下去的。甲醇與乙腈的成分中含有一定的毒性，所以也不考慮使用。最后選用的試劑是乙醇，用乙醇作為沖洗液不僅無毒對藥品不會產(chǎn)生污染，還在一定程度上增大了羅紅霉素在緩沖液下的溶解度，故選擇乙醇作為緩沖液是最為適宜的。

5.2 干混懸劑的過濾可行性分析

在羅紅霉素干混懸劑的薄膜過濾法中，用不含乙醇的無菌蛋白胨緩沖液來沖洗供試品是不可取的，本研究的目的是驗證用含5%乙醇的無菌蛋白胨緩沖液來沖洗濾膜來計算各個控制菌回收率的高低的方法是否可行，結(jié)果各控制菌的回收率均大于70%，符合規(guī)定。

5.3 對羅紅霉素化學(xué)性質(zhì)的分析

羅紅霉素對酸穩(wěn)定，是目前臨床上使用廣泛、療效優(yōu)良的新型紅霉素產(chǎn)品。合成它需要兩步，第一步：紅霉素或硫氰酸紅霉素與鹽酸羥胺在酸性條件下轉(zhuǎn)化為紅霉素肟；第二步：紅霉素肟與甲氧基乙氧基甲基氯在堿性條件下反應(yīng)生成羅紅霉素。其中紅霉素肟不僅是合成羅紅霉素的中間體，也是合成克拉霉素、阿奇霉素、地紅霉素等的通用中間體。

5.3 制取反應(yīng)時間上的選取

5.3.1 通過對三種合成紅霉素肟方法的研究(包括自己設(shè)計出的合成方法)的比較研究，得出預(yù)先從鹽酸羥胺、硫氰酸紅霉素中游離出羥胺和紅霉素，然后在已調(diào)節(jié)好酸性的條件下混合兩種游離物質(zhì)，進(jìn)而在一定反應(yīng)條件下合成紅霉素肟的工藝是可行且具有經(jīng)濟(jì)效益的。

5.3.2 優(yōu)化了合成紅霉素肟新方法的工藝條件，得到最佳條件為：反應(yīng)體系pH為6.7左右，反應(yīng)溫度58～60℃，反應(yīng)時間28h左右，鹽酸羥胺與硫氰酸紅霉素的物質(zhì)的量比為8.3：1，游離羥胺所需反應(yīng)時間為30～40min，所用氫氧化鈉溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為26%，用乙醇鈉游離硫氰酸紅霉素的反應(yīng)時間為30min。

5.3.3 用自制的紅霉素肟和甲氧乙氧甲基氯合成羅紅霉素得出優(yōu)化的反應(yīng)條件：分批加入甲醇鈉堿催化劑優(yōu)于一次性加入甲醇鈉；加入甲氧基乙氧基甲基氯、紅霉素肟、甲醇鈉三者的物質(zhì)的量比為1.24：1：1.32；反應(yīng)時間應(yīng)選取在7h左右最適宜。

6.結(jié)論

通過以上實驗的驗證，可以得出，為了增加驗證的說服性需要對實驗進(jìn)行多次反復(fù)試驗才行，這樣的做法可以將試驗中產(chǎn)生的誤差降到最小，以免誤差太大對實驗結(jié)果的客觀性產(chǎn)生影響。對于本次試驗的結(jié)果可知，用 5%乙醇的無菌蛋白胨緩沖液對濾膜進(jìn)行沖洗的方法來對各個控制菌的驗證是具有可行性的。

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