呂建敏， 袁海娜

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心，浙江 杭州 310053；2.浙江科技學(xué)院生物與生化工程學(xué)院/輕工學(xué)院，浙江杭州310023）

谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶誘導(dǎo)交聯(lián)發(fā)酵乳蛋白的體內(nèi)抗氧化功效

呂建敏1， 袁海娜2

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心，浙江 杭州 310053；2.浙江科技學(xué)院生物與生化工程學(xué)院/輕工學(xué)院，浙江杭州310023）

為了研究微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶誘導(dǎo)交聯(lián)發(fā)酵乳蛋白（Microbial Transglutaminase Cross-Linked Fermentation Milk Protein，mTG-FPM）對D-半乳糖（D-gal）衰老模型小鼠的抗氧化活性的影響，試驗設(shè)正常組、D-gal模型組、D-gal+0UmTG-FPM組、D-gal+1UmTG-FPM組、D-gal+ 3UmTG-FPM組和D-gal+VE陽性對照組共6組，每組10只C57BL/J小鼠。采用皮下連續(xù)注射D-Gal方式建立衰老小鼠模型。造模同時，F(xiàn)PM各組每天灌服1.5 g/kg mTG-FPM/FPM，D-gal+ VE陽性對照組每天灌服100 mg/kg的VE，模型對照和正常組每天灌服蒸餾水0.2 mL/10 g。連續(xù)灌胃8 w后，測定各組小鼠肝腎組織和血清中的相關(guān)抗氧化指標(biāo)（CAT、SOD、GSH-Px MDA）。結(jié)果表明：D-Gal可顯著降低衰老模型小鼠肝臟和血清中CAT及GSH-Px活性 （P＜0.01，P＜0.05）；顯著降低腎臟和血清中的SOD活力 （P＜0.01，P＜0.05），顯著升高M(jìn)DA含量 （P＜0.01）。與模型組和0UmTG組相比，3UmTG組的肝臟CAT，1UmTG組血清CAT活性和3U mTG組肝臟GSH-Px活性顯著升高 （比0UmTG組分別升高11.14%、35.57%和22.36%，P＜0.01，P＜0.05）；而3UmTG組腎臟中的MDA含量顯著降低（比0UmTG組降低26.41%，P＜0.05）。因此，mTG誘導(dǎo)交聯(lián)處理可在一定程度上改善FPM的體內(nèi)抗氧化活性。

微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶；發(fā)酵乳蛋白；體內(nèi)；抗氧化

谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶（Transglutaminase，TG）是存在于動、植物和微生物中的一種酶，可催化分子間和分子內(nèi)?；D(zhuǎn)移反應(yīng)，并能通過交聯(lián)、氨基轉(zhuǎn)移及脫酰氨基作用改性蛋白質(zhì)[1-4]。微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶 （Microbial transglutaminase，mTG）由鏈霉菌屬（Streptoverticillum）的某些菌株發(fā)酵生產(chǎn)[2-5]，具有與谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶相同的改性蛋白質(zhì)作用[5]，且成本較低，廣泛應(yīng)用于乳制品加工、奶酪生產(chǎn)、肉類加工、焙烤制品及可食性膜的生產(chǎn)等食品加工領(lǐng)域[4-5]。目前，在酸奶等發(fā)酵乳制品中使用mTG的研究主要是集中在增加凝膠強(qiáng)度，保持其質(zhì)地平滑并提高穩(wěn)定性等方面[4-5]。但mTG通過交聯(lián)作用是否能改善發(fā)酵乳蛋白（Fermentation Milk Protein，F(xiàn)PM）的抗氧化功效還未見報道。

另一方面，自由基學(xué)說認(rèn)為，過量的自由基對機(jī)體產(chǎn)生氧化性損傷是衰老發(fā)生的主要原因。D-半乳糖小鼠衰老模型是目前常用的一種誘發(fā)性衰老模型，其主要機(jī)制與D-半乳糖的過度氧化損傷作用有關(guān)，可導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)生大量的自由基，加速衰老過程[6-7]。為充分驗證mTG誘導(dǎo)交聯(lián)發(fā)酵乳蛋白的體內(nèi)抗氧化功效，作者參考毛根祥等[8]的方法復(fù)制D-半乳糖衰老小鼠模型，研究mTG誘導(dǎo)交聯(lián)發(fā)酵乳蛋白對D-半乳糖衰老模型小鼠組織和血清中抗氧化指標(biāo)的影響，旨在明確mTG-PFM的體內(nèi)抗氧化功效，為拓展mTG在乳制品中的應(yīng)用方向，開發(fā)乳制品營養(yǎng)保健功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 D-半乳糖（D-gal）粉劑（原裝）：購自Sigma公司；藥用維生素E（水溶性制劑）：浙江新和成藥業(yè)有限公司；批號分別為 2010914、20150915、20150916、20150922的超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）、 過氧化氫酶（Catalase，CAT）和丙二醛（Malondialdehyde，MDA）測定試劑盒：購自南京建成生物工程研究所。

1.1.2 實驗動物 C57BL/6J小鼠60只，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，SPF級，雌性，年齡為10周齡，體質(zhì)量為18～22 g。試驗在浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心進(jìn)行。

1.2 儀器和設(shè)備

DK-450B型電熱恒溫水槽：上海森信實驗儀器有限公司；721型分光光度計：上海菁華科技有限公司；X-15R離心機(jī)：Beckman Coutler公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 mTG誘導(dǎo)交聯(lián)發(fā)酵乳蛋白（mTG-FPM）制備

將濃度為0、1、3 U/g蛋白質(zhì)的mTG分別與乳酸菌一起進(jìn)行酸乳發(fā)酵，經(jīng)均質(zhì)、高速離心和冷凍干燥，制備出含mTG含量分別為0、1、3 U的FMP，標(biāo)記為0U mTG-FPM，1U mTG-FPM和3U mTG-FPM。

1.3.2 動物分組及處理 試驗設(shè)正常組，D-gal模型對照組、D-gal+0UmTG-FPM組，D-gal+1UmTGFPM組、D-gal+3UmTG-FPM組和D-gal+VE陽性對照組6個組別，將購入60只10周齡雌性C57BL/ 6J小鼠適應(yīng)飼養(yǎng)2 w后，隨機(jī)分為6組，每組10只，參照文獻(xiàn)[8]的方法建立衰老小鼠模型，正常組采用等體積生理鹽水皮下注射。FPM各組在造模的同時每天分別經(jīng)口灌胃1.5 g/kg的FPM，D-gal+VE陽性對照組在造模同時每天經(jīng)口灌胃100 mg/kg的VE，模型組和正常對照組每天經(jīng)口灌胃蒸餾水0.2 mL/10 g。按以上方式處理8周后結(jié)束試驗，采集各組小鼠血清、肝臟、腎臟樣本，每組取8只動物樣本，測定各樣本血清以及肝臟和腎臟組織勻漿中CAT、MDA、SOD、和GSH-Px等指標(biāo)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SAS 8.1統(tǒng)計軟件的ANOVA分析進(jìn)行單因素方差分析，并進(jìn)行Duncan氏多重比較，結(jié)果以X±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 mTG-FMP對D-gal衰老小鼠肝、腎組織及血清中CAT活性影響

由表1可知，模型對照組小鼠肝臟和血清中的CAT活性均顯著低于正常組（P＜0.01，P＜0.05）。3U mTG-FPM組和VE陽性對照組小鼠肝臟CAT活性顯著高于模型對照組和0UmTG-FPM組 （P＜0.01，P＜0.05）。3UmTG處理組小鼠肝臟CAT活性比模型組和 0UmTG組分別提高 14.91%和11.14%。血清CAT活性以正常組和1UmTG-FPM處理組為高，均與模型對照組和0UmTG-FPM組差異顯著（P＜0.05），其中，1UmTG處理組小鼠肝臟CAT活性比模型組和 0UmTG處理組分別提高41.21%和35.57%。

表1 小鼠肝臟、腎臟組織和血清中CAT活性測定結(jié)果Table 1 Activity of CAT in liver，kidney tissues，and serum of mice（n=8，X±s）

2.2 mTG-FMP對D-gal衰老小鼠肝、腎組織及血清中MDA含量影響

由表2可見，D-gal衰老模型小鼠腎臟和血清中MDA含量均顯著高于正常小鼠（P＜0.01），說明D-gal衰老模型小鼠出現(xiàn)了衰老癥狀。mTG誘導(dǎo)交聯(lián)處理可顯著降低 D-gal衰老模型小鼠的腎臟MDA含量，3U mTG-FPM組的小鼠腎臟MDA含量顯著低于模型組、0UmTG-FPM組和1UmTG-FPM組（P＜0.01），比0UmTG-FPM組降低26.41%。各FPM處理組小鼠血清MDA含量較模型組均有降低趨勢，但無顯著性差異（P＞0.05）。VE陽性對照組小鼠腎臟MDA含量顯著減低模型對照組和0UmTG-FPM組（P＜0.01），但與3UmTG-FMP組無顯著性差異（P＞0.05）。

2.3 mTG-FMP對D-gal衰老小鼠肝、腎組織及血清中SOD活性影響

mTG-FMP對D-gal衰老小鼠肝、腎組織及血清中SOD活性影響的結(jié)果見表3。D-gal處理顯著降低衰老小鼠腎臟和血清中的SOD活性（P＜0.01，P＜0.05）。在腎臟中，3個FMP處理組和VE陽性對照組的SOD活性均極顯著高于模型組 （P＜0.01）。VE陽性對照組小鼠血清SOD活性則顯著高于模型組和0UmTG-FPM組，但與 1UmTG-FPM和3UmTG-FPM組差異不顯著（P＞0.05）。以上結(jié)果表明，無論與mTG是否交聯(lián)，F(xiàn)MP均可極顯著提高衰老小鼠腎臟SOD活性，說明FMP本身也具有一定的抗氧化功能。

2.4 mTG-FMP對D-gal衰老小鼠肝、腎組織及血清中GSH-Px活性影響

小鼠肝、腎組織及血清中GSH-Px活性檢測結(jié)果見表4。D-gal衰老模型小鼠的肝腎組織和血清中的GSH-Px活性均顯著低于正常小鼠（P＜0.01， P＜0.05），說明模型成立。3UmTG-FPM組和VE陽性對照組小鼠肝臟GSH-Px活性顯著高于模型對照組和0UmTG-FPM組（P＜0.01），二者分別比0UmTGFPM組升高22.36%和26.22%。在腎臟中，3U mTGFPM組和VE陽性對照組的GSH-Px活性顯著高于模型組（P＜0.05），說明經(jīng)3UmTG處理的FPM的抗氧化功效與VE接近。

表2 小鼠肝臟、腎臟組織和血清中MDA含量測定結(jié)果Table 2 Content of MDA in liver，kidney tissues，and serum of mice（n=8，X±s）

表3 小鼠肝臟、腎臟組織和血清中SOD活性測定結(jié)果Table 3 Activity of SOD in liver，kidney tissues，and serum of mice（n=8，X±s）

表4 小鼠肝臟、腎臟組織和血清中GSH-Px活性測定結(jié)果Table 4 Activity of GSH-Px in liver，kidney tissues，and serum（n=8，X±s）

3 討論

D-半乳糖致衰老動物模型是目前常用的一種模型，其致衰老的主要原因在于機(jī)體細(xì)胞受到D-半乳糖攻擊后，其自身抗氧化能力過度受損[9]。因此，該模型常用于體內(nèi)抗氧化和抗衰老功能的評價體系[8]。實驗結(jié)果表明，連續(xù)注射D-gal 8 w后，小鼠的肝臟和血清中CAT及GSH-Px活性及腎臟和血清中SOD活性顯著升高，而腎臟和血清中MDA含量顯著降低，表明本研究所建立的衰老小鼠模型成立。

已有研究顯示，乳蛋白中酪蛋白、乳鐵蛋白、乳清蛋白及其酶解產(chǎn)物（乳清多肽）均具有一定的抗氧化活性[10-12]，在本實驗中也發(fā)現(xiàn)FMP本身也具有一定抗氧化活性。乳蛋白抗氧化功能主要源于其內(nèi)部抗氧化肽的作用，且抗氧化肽的功效與氨基酸組成、序列/結(jié)構(gòu)及疏水性等物化特性密切相關(guān)[13-14]。目前，有關(guān)mTG交聯(lián)處理的抗氧化作用的研究報道較少，僅有一些研究也存在爭議，如O’Sullivan等[2，15]研究發(fā)現(xiàn)，mTG交聯(lián)作用未影響乳清蛋白分離物和總?cè)榈鞍椎目寡趸钚?，也未改變酪蛋白酸鈉水解物在Jurkat T細(xì)胞內(nèi)的抗氧化活性；而Song和Fan等[16-17]研究發(fā)現(xiàn)，mTG交聯(lián)作用提高了大豆蛋白及其水解物的體外DPPH自由基清除活性和還原力，交聯(lián)作用提高了1 000~5 000低相對分子質(zhì)量肽的含量。導(dǎo)致以上研究結(jié)果差異的原因可能在于不同研究的抗氧化肽來源、組成以及所選抗氧化體系的不同。選用D-半乳糖衰老小鼠模型，對mTG交聯(lián)發(fā)酵乳蛋白的體內(nèi)抗氧化功效進(jìn)行系統(tǒng)評價。結(jié)果表明，灌服經(jīng)mTG處理的FMP后，衰老小鼠肝腎組織和血清中的抗氧化酶和脂質(zhì)過氧化物均有改善，在肝臟和血清CAT、肝臟GSH-Px，腎臟MDA等指標(biāo)上與mTG未處理組具有差異顯著性，在其他抗氧化活性指標(biāo)上，mTG交聯(lián)發(fā)酵乳蛋白的抗氧化效果也基本與維生素E相近。表明mTG在提高發(fā)酵乳蛋白的抗氧化功效方面具有一定的作用，可能是由于mTG的交聯(lián)作用改變了FPM中抗氧化肽的物化特性。此結(jié)果不僅為開發(fā)乳制品的天然保鮮劑提供了新思路，也為有效利用發(fā)酵乳的潛在營養(yǎng)保健功能提供了參考。

4 結(jié)語

綜上所述，經(jīng)mTG誘導(dǎo)交聯(lián)處理的FPM與未經(jīng)處理的FPM相比，可使D-gal衰老模型小鼠的肝臟和血清中的CAT活性，肝臟GSH-Px活性和腎臟中的MDA含量得到顯著改善，因此mTG誘導(dǎo)交聯(lián)處理在一定程度上提高了FPM的體內(nèi)抗氧化活性，但其作用機(jī)制和劑量關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

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Anti-Oxidative Activity of Microbial Transglutaminase Cross-Linked Fermentation Milk Protein in vivo

LU Jianmin1， YUAN Haina2
（1.Laboratory Animal Research Center，Zhejiang Chinese Medicine University，Hangzhou 310053，China；2.School of Biological Chemical Engineering/School of Light Industry，Zhejiang University of Science and Technology，Hangzhou 310023，China）

The study was carried out to investigate the anti-oxidative effect of Microbial Transglutaminase Cross-Linked Fermentation Milk Protein（mTG-FPM）in aging mice induced by D-galactose（D-gal）.Sixty C57BL/6J female mice（12 w old）were divided into 6 groups including the control group，D-gal model group，D-gal-induced mice treated with FPM cross-linked mTG by 0U，1 U and 3 U/g protein（as D-gal+0 UmTG-FMP，D-gal+1UmTG-FMP and D-gal+3 UmTG-FMP groups），at 1.5 g/kg bw via ig，and D-gal-induced mouse treated with vitamin E as the positive group at 100 mg/kg via ig，respectively.After continuous administration for 8 weeks，the anti-oxidative parameters（CAT，SOD，MDA GSH-Px）in liver，kidney tissues，and serum of mice in each group were determined.The results showed that mice induced by D-gal had lower CAT and GSH-Px activity in liver and serum，lower SOD activity of kidney and serum，and higher MDA content of kidney and serum，when compared with the normal mice（P＜0.01，P＜0.05）.Compared to the model and untreated FPM groups，F(xiàn)PM treated with mTG had higher CAT activities in liver tissue（3 U mTG treatment，P＜0.01）and in serum（1 U mTG treatment，P＜0.05）up to 11.14%and 35.57% respectively，whereas the content of MDA in kidney tissue（P＜0.01）in FPM treated with mTG was reduced 26.41%.The activity of GSH-Px in liver tissue was also sharply higher（22.36%increase）in D-gal+3 U mTG-FPM group than that of in FPM group untreated with mTG （P＜0.01）.It was concluded that the mTG Cross-linked effect in FPM can improve the anti-oxidative ability of aging mice induced by D-gal.

microbial transglutaminase （mTG），fermentation milk protein （FPM），in vivo，anti-oxidative ability

TS 252.54

A

1673—1689（2016）12—1330—06

2015-04-05

浙江省自然科學(xué)基金項目（LY14C200007）。

呂建敏（1971—），女，浙江嵊州人，農(nóng)學(xué)博士，研究員，主要從事動物營養(yǎng)方面的研究。E-mail：ljm6666@163.com