重組大腸桿菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化馬來(lái)酸高效合成富馬酸

房月芹， 周 麗， 劉文茂， 周哲敏*

（1.江南大學(xué) 環(huán)境與土木工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122）

重組大腸桿菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化馬來(lái)酸高效合成富馬酸

房月芹1， 周 麗2， 劉文茂2， 周哲敏*2

（1.江南大學(xué) 環(huán)境與土木工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122）

重組Escherichia coli細(xì)胞催化馬來(lái)酸合成富馬酸時(shí)，細(xì)胞中富馬酸酶將產(chǎn)物富馬酸轉(zhuǎn)化成蘋果酸，轉(zhuǎn)化率達(dá)15.5%，降低了富馬酸的轉(zhuǎn)化率和純度。將E.coli BL21（DE3）基因組中fumA-fumC基因敲除，并高效表達(dá)馬來(lái)酸順?lè)串悩?gòu)酶，重組菌BL21（DE3）△fumA-fumC/ pET24a-maiA經(jīng)發(fā)酵罐培養(yǎng)，可產(chǎn)生64 g/L菌體，馬來(lái)酸順?lè)串悩?gòu)酶表達(dá)量達(dá)306 U/mL。按照60 g/L的發(fā)酵液：2 mol/L富馬酸為1∶4的體積比配置反應(yīng)液，37℃反應(yīng)1 h，富馬酸轉(zhuǎn)化率高達(dá)98.4%，僅產(chǎn)生0.7%的蘋果酸副產(chǎn)物。該結(jié)果為全細(xì)胞催化法合成富馬酸的工業(yè)化奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：富馬酸；馬來(lái)酸順?lè)串悩?gòu)酶；全細(xì)胞催化；蘋果酸

富馬酸（Fumaric acid），又稱反丁烯二酸、延胡 索酸，是一種天然存在的有機(jī)酸。作為一種重要的四碳平臺(tái)化合物和精細(xì)化工產(chǎn)品，富馬酸廣泛用于食品、醫(yī)藥、化工、涂料、增塑劑等領(lǐng)域[1]。例如，在食品方面，可用作口味純正的酸味劑、風(fēng)味增強(qiáng)劑。在醫(yī)藥方面，富馬酸鐵則廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)上治療人體的小紅血球貧血病。

目前，工業(yè)上主要以順丁烯二酸酐為原料通過(guò)化學(xué)轉(zhuǎn)化的方法生產(chǎn)富馬酸[2-3]。然而，化學(xué)轉(zhuǎn)化過(guò)程需高溫條件，化學(xué)反應(yīng)平衡嚴(yán)格限制了轉(zhuǎn)化率，反應(yīng)過(guò)程中形成副產(chǎn)物影響富馬酸的產(chǎn)量和產(chǎn)物的質(zhì)量。以酶作為催化劑生產(chǎn)富馬酸，具有反應(yīng)條件溫和、副產(chǎn)物少、特異性強(qiáng)、專一性高和轉(zhuǎn)化率高等優(yōu)點(diǎn)。馬來(lái)酸順?lè)串悩?gòu)酶（EC 5.2.1.1，Maleate cistrans Isomerase，MaiA）屬于天冬氨酸、谷氨酸消旋酶超家族[4]，能夠催化馬來(lái)酸在碳碳雙鍵不斷裂的情況下異構(gòu)化生成富馬酸。其中，粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）來(lái)源的馬來(lái)酸順?lè)串悩?gòu)酶具有轉(zhuǎn)化率高、pH范圍寬泛、Km值較低等特點(diǎn)，是有望用于工業(yè)生產(chǎn)富馬酸的生物催化劑之一[5]。作者所在實(shí)驗(yàn)室前期用Serratia marcescens來(lái)源的馬來(lái)酸順?lè)串悩?gòu)酶的游離酶轉(zhuǎn)化馬來(lái)酸合成富馬酸，轉(zhuǎn)化率可達(dá)99%[6]。進(jìn)一步使用含有該酶的細(xì)胞進(jìn)行生物催化反應(yīng)，可避免游離酶提取和純化成本高、穩(wěn)定性低、回收利用困難等問(wèn)題[7]。同時(shí)，全細(xì)胞催化只需對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)就能獲得大量的全 細(xì)胞 生物催化劑，通過(guò)簡(jiǎn)單的過(guò)濾或者離心就能對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行分離純化[8]，簡(jiǎn)化了生物催化劑的制備步驟，在許多工業(yè)生物轉(zhuǎn)化過(guò)程都得到應(yīng)用。然而，細(xì)胞內(nèi)同時(shí)存在多種酶，全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化工程中最嚴(yán)重的問(wèn)題是會(huì)產(chǎn)生副產(chǎn)物[9]。例如用全細(xì)胞催化馬來(lái)酸合成富馬酸時(shí)，富馬酸酶（又名延胡索酸水合酶）的存在導(dǎo)致富馬酸被轉(zhuǎn)化成L-蘋果酸，降低富馬酸的轉(zhuǎn)化率和純度。Ichikawa等[10]通過(guò)加熱方法將產(chǎn)堿假單胞菌（Pseudomonas alcaligenes）XD-1中的富馬酸酶失活，從而將XD-1全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成富 馬 酸的轉(zhuǎn)化率由69.8%提高為95%。然而，加熱易導(dǎo)致細(xì)胞裂解，釋放復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)含物質(zhì)，影響產(chǎn)品質(zhì)量。

作者敲除大腸桿菌BL21（DE3）中的fumA-fumC和fumB基因，減少富馬酸到L-蘋果酸的代謝通路。以所獲得的重組菌株為宿主，表達(dá)來(lái)源于Serratia marcescens的馬來(lái)酸順?lè)串悩?gòu)酶。最終獲得的重組細(xì)胞可高效轉(zhuǎn)化馬來(lái)酸底物合成高純度富馬酸，幾乎不合成蘋果酸副產(chǎn)物，為全細(xì)胞法催化馬來(lái)酸生產(chǎn)富馬酸的工業(yè)化提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒與引物

菌株E.coli BL21（DE3）/pET-24a（+）-maiA、重組質(zhì)粒pET-24a（+）-maiA：由作者所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保藏[6]；質(zhì)粒pKD46（溫度敏感型，含有阿拉伯糖啟動(dòng)子調(diào)控的 gam，bet和 exo基因，Ampr）、pKD13（含有FRT-kan-FRT突變盒，Kanr）、pCP20（溫度敏感型，含有FLP重組酶，Ampr）：購(gòu)于耶魯大學(xué)基因保藏中心[11]。

本研究所用引物見(jiàn)表1。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2 主要試劑與培養(yǎng)基

ExTaq DNA聚合酶：寶生物工程（大連）公司；質(zhì)粒提取、純化試劑盒、抗生素：生工生物工程（上海）股份有限公司；馬來(lái)酸、富馬酸及其他試劑：國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

LB培養(yǎng)基成分為（g/L）：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：甘油10，胰蛋白胨12，酵母粉 12，MgSO4·7H2O 0.5，K2HPO4·3H2O 16.4，KH2PO4·12H2O 6.1。

發(fā)酵罐種子培養(yǎng)基（g/L）：LB培養(yǎng)基。

發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：甘油8，胰蛋白胨2，酵 母 粉 2，C6H8O7·H2O 1.7，MgSO4·7H2O 1.7，（NH4）2HPO44，KH2PO413.5；微量元素液10 mL。

補(bǔ)料培養(yǎng)基（g/L）：甘油500，胰蛋白胨4，酵母粉4，MgSO4·7H2O 7.4。

微量元素成分為（g/L）：FeSO4·7H2O 10，CuSO4· 5H2O 1，MnSO4· 4H2O 0.5，ZnSO4· 7H2O 2.3，（NH4）MO7O240.1，Na2B4O7·10H2O 0.2，CaCl22，溶于1 mol/L HCl溶液中。

1.3 重組菌株搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)方法

-80℃冰箱保存的重組菌株在LB固體平板上劃線活化，挑取LB平板上單菌落，接種至5 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)8 h。上述培養(yǎng)液以1%的接種體積分?jǐn)?shù)轉(zhuǎn)接入30 mL含50 μg/mL卡那霉素的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，于37℃恒溫?fù)u床中200 r/min培養(yǎng)至OD600約為2.2時(shí)，加入乳糖至終質(zhì)量濃度為4 g/L，同時(shí)移至20℃恒溫?fù)u床中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，200 r/min繼續(xù)培養(yǎng)20 h。

1.4 重組菌株發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)方法

1.4.1 種子培養(yǎng)方法 取-80℃冰箱的甘油管保藏物200 μL菌液接種于30 mL含有50 μg/mL卡那青霉素抗性的LB培養(yǎng)基中，置于37℃的恒溫?fù)u床中200 r/min培養(yǎng)7.5 h。

1.4.2 發(fā)酵罐培養(yǎng)方法 5 L發(fā)酵罐 （Winpact FS-02，Major Science，Saratoga，CA，USA）初始裝液量為2 L。培養(yǎng)溫度設(shè)定為37℃，初始轉(zhuǎn)速200 r/min，通氣量為5 L/min，設(shè)定此時(shí)罐內(nèi)初始溶解氧（DO）100%。將種子培養(yǎng)液以7%的接種體積分?jǐn)?shù)接入發(fā)酵罐中，同時(shí)加入終質(zhì)量濃度為50 μg/mL的卡那青霉素，將發(fā)酵罐的溶氧與轉(zhuǎn)速相偶聯(lián)，維持罐內(nèi)溶氧濃度在30%。接種約5~6 h后出現(xiàn)溶氧反彈現(xiàn)象，此時(shí)以指數(shù)流加補(bǔ)料策略補(bǔ)加補(bǔ)料培養(yǎng)基，控制菌體比生長(zhǎng)速率（μ）為0.25（h-1）。當(dāng)OD600達(dá)到60時(shí)，改變溫度為30℃，并以0.22 g/（L·h）的恒流速流加乳糖進(jìn)行誘導(dǎo)。整個(gè)發(fā)酵用體積分?jǐn)?shù)25%的氨水維持pH在7.2。

1.4.3 指數(shù)補(bǔ)料控制策略 發(fā)酵罐培養(yǎng)過(guò)程中，以甘油為限制性底物，根據(jù)以下公式[12]進(jìn)行指數(shù)補(bǔ)料，控制恒定的比生長(zhǎng)速率：

其中，F(xiàn)（t）是補(bǔ)料速率（L/h）；X0和V0分別是分批補(bǔ)料初始階段的細(xì)胞干重（g/L）和培養(yǎng)基體積（L）；μset是設(shè)定的比生長(zhǎng)速率（h-1）；t為流加時(shí)間（h）；Yx/s是細(xì)胞對(duì)底物的得率系數(shù)（g/g），其經(jīng)驗(yàn)值為0.46 g/g；Sf和S0分別是補(bǔ)料培養(yǎng)基和分批發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵罐中的甘油質(zhì)量濃度（g/L）。實(shí)驗(yàn)中補(bǔ)料速率（F）每2小時(shí)改變一次。

1.5 分析方法

1.5.1 菌體量測(cè)定方法 菌體密度采用濁度法間接測(cè)量，通過(guò)OD600來(lái)表示，并換算為菌體干重（DCW）。取不同濃度的菌液，8 000 r/min離心10 min去上清液，用去離子水洗滌3次，將菌體放于-80℃預(yù)冷凍24 h，用冷凍干燥機(jī)處理72 h，將干燥后菌體質(zhì)量與對(duì)應(yīng)的細(xì)胞密度繪制曲線，得到菌體干重（DCW）和OD600的關(guān)系：1 OD600=0.408 3 g/L DCW。

1.5.2 全細(xì)胞馬來(lái)酸順?lè)串悩?gòu)酶酶活測(cè)定方法

1）細(xì)胞預(yù)處理方法：離心收集發(fā)酵液中的菌體，用pH 8的66.7 mmol/L Na2HPO4-KH2PO4緩沖液洗滌1次。

2）粗酶液制備方法：菌體洗滌后，用超聲波破碎細(xì)胞，12 000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液。取100 μL適度稀釋的菌液或粗酶液，加入50 μL 1 mol/L的馬來(lái)酸溶液，用 50 mmol/L Na2HPO4-KH2PO4緩沖液將反應(yīng)體系補(bǔ)充到500μL，于指定溫度下保溫10 min。100℃煮沸10 min，離心，取上清液稀釋50倍，測(cè)定生成的富馬酸含量。

酶活力單位定義：在上述反應(yīng)條件下，每分鐘轉(zhuǎn)化生成1 μmol富馬酸產(chǎn)物所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位（U）。

相對(duì)酶活計(jì)算公式為：

其中，Yrel是相對(duì)酶活 （%）；Y是本樣品的酶活（U）；Ymax是本次實(shí)驗(yàn)所有樣品中最高的酶活（U）。

1.5.3 馬來(lái)酸、富馬酸和蘋果酸的測(cè)定方法 馬來(lái)酸、富馬酸和蘋果酸濃度用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定。HPLC檢測(cè)條件：色譜柱Prevail Organic Acid（250 mm×4.6 mm，5 μm；Grace Davison Discovery Sciences），流動(dòng)相為pH 2.5的25 mmol/L K2HPO4溶液，流速1 mL/min，柱溫40℃，紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)210 nm，進(jìn)樣量10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 BL21（DE3）/pET24a-maiA全細(xì)胞轉(zhuǎn)化馬來(lái)酸合成富馬酸

按照BL21（DE3）/pET24a-maiA發(fā)酵液：2 mol/L富馬酸為1∶4的體積比配置反應(yīng)液，在40℃下反應(yīng)3 h。由圖1可見(jiàn)，BL21（DE3）/pET24a-maiA全細(xì)胞反應(yīng)過(guò)程中，底物馬來(lái)酸主要轉(zhuǎn)化為富馬酸，并積累蘋果酸副產(chǎn)物，導(dǎo)致目的產(chǎn)物富馬酸的轉(zhuǎn)化率和純度降低，不利于產(chǎn)品的應(yīng)用。

圖1 BL21（DE3）/pET24a-maiA全細(xì)胞轉(zhuǎn)化馬來(lái)酸合成富馬酸過(guò)程Fig.1 Biosynthetic process of fumarate from malaete by BL21（DE3）/pET24a-maiA cell

2.2 BL21（DE3）△fumA-fumC/pET24a-maiA和BL21（DE3）△fumB/pET24a-maiA菌株的構(gòu)建

E.coli的TCA循環(huán)中具有富馬酸酶，能夠催化富馬酸水合生成L-蘋果酸。富馬酸酶有3個(gè)同工酶[13]，分別是FumA、FumB、FumC，其中FumA在有氧條件下參與TCA循環(huán)的運(yùn)行[14]；FumB在厭氧條件下有功能[15]；FumC是酶學(xué)性質(zhì)和FumA類似的備用酶，并且在脅迫環(huán)境中可以代替FumA行使功能[14]。因此，為了保證富馬酸產(chǎn)物的高效合成，降低副產(chǎn)物的積累，作者進(jìn)一步將富馬酸酶的編碼基因敲除。fumA和fumC基因在基因組中位于相鄰的位置，所以將這兩個(gè)基因同時(shí)敲除，保留fumB基因；或者保留fumA和fumC基因，敲除fumB基因，以維持菌體生長(zhǎng)。

用Datsenko等[11]報(bào)道的基因刪除方法，分別將BL21（DE3）染色體上的fumA-fumC和fumB基因刪除。其具體過(guò)程為：以pKD13質(zhì)粒為模板，分別用FumC-pKD13F/FumA-pKD13R引物和 FumB-pKD13F/FumB-pKD13R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到兩端為同源臂、中間為FRT-kan-FRT基因片段的線性同源重組片段（大小為1 303 bp）。將同源重組片段分別電轉(zhuǎn)入含有pKD46質(zhì)粒的BL21（DE3）菌株中，借助pKD46質(zhì)粒上的Red重組系統(tǒng)將同源重組片段整合于染色體上，在卡那霉素抗性平板上篩選轉(zhuǎn)化子。重組菌株P(guān)CR驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)圖2。出發(fā)菌株BL21（DE3）、轉(zhuǎn)化子BL21（DE3）fumA-fumC：：FRTKm分別用YfumCF/YfumAR引物PCR擴(kuò)增，其電泳條帶分別為3 526 bp和2 036 bp；BL21（DE3）和 BL21（DE3）fumB：：FRTKm分別用 YfumBF/ YfumBR引物PCR擴(kuò)增，其電泳條帶分別為1 660 bp和1 716 bp，表明fumA-fumC和fumB基因成功被FRT-kan-FRT片段替換。最后用pCP20質(zhì)粒去除重組菌中的卡那霉素抗性基因，轉(zhuǎn)化子BL21（DE3）fumA-fumC：：FRT和BL21（DE3）fumB：：FRT分別用YfumCF/YfumAR引物和YfumBF/YfumBR引物PCR擴(kuò)增，其電泳條帶為438 bp和494 bp，表明fumA-fumC和fumB基因已經(jīng)被成功敲除。所獲得的重組菌株分別命名為BL21（DE3）△fumA-fumC和BL21（DE3）△fumB。

進(jìn)一步將pET24a-maiA質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）△fumA-fumC和 BL21（DE3）△fumB菌株中，分別獲得BL21（DE3）△fumA-fumC/pET24amaiA和BL21（DE3）△fumB/pET24a-maiA菌株。

2.3 fumA-fumC和fumB基因刪除對(duì)全細(xì)胞催化過(guò)程中蘋果酸積累量的影響

收集BL21（DE3）/pET24a-maiA、BL21（DE3）△fumA-fumC/pET24a-maiA和BL21（DE3）△fumB/ pET24a-maiA菌體，并用 pH 8的 66.7 mmol/L Na2HPO4-KH2PO4緩沖液重懸至OD600=10。取菌液各1 mL，加入4 mL 500 mmol/L的馬來(lái)酸溶液中，在40℃、pH 8條件下反應(yīng)10 min。如表2所示，菌株BL21（DE3）△fumB/pET24a-maiA的反應(yīng)液中，蘋果酸副產(chǎn)物的積累量與出發(fā)菌株相似，而菌株BL21（DE3）△fumA-fumC/pET24a-maiA僅產(chǎn)生了少量的蘋果酸副產(chǎn)物。因此，fumA-fumC基因是全細(xì)胞催化反應(yīng)過(guò)程中蘋果酸合成的主要途徑，BL21（DE3）△fumA-fumC/pET24a-maiA菌株更適合應(yīng)用于全細(xì)胞催化馬來(lái)酸合成富馬酸。

圖2 基因敲除菌株P(guān)CR驗(yàn)證電泳圖Fig.2 PCR identification of the deletion strains

表2 蘋果酸副產(chǎn)物積累量的比較Table 2 Comparison of malate byproduct

2.4 菌株 BL21（DE3）△fumA-fumC/pET24amaiA發(fā)酵罐發(fā)酵性能

進(jìn)一步將BL21（DE3）△fumA-fumC/pET24amaiA菌株在5 L罐發(fā)酵中培養(yǎng)，考察其菌體生長(zhǎng)與馬來(lái)酸順?lè)串悩?gòu)酶合成性能。由圖3可知，發(fā)酵培養(yǎng)最高可獲得干重達(dá)64 g/L的菌體細(xì)胞，最高酶活可達(dá)306 U/mL。表明基因敲除后仍可實(shí)現(xiàn)菌體和馬來(lái)酸順?lè)串悩?gòu)酶的高效合成，顯示出大規(guī)模應(yīng)用的潛力。

2.5 BL21（DE3）△fumA-fumC/pET24a-maiA菌全細(xì)胞催化的最適溫度和pH優(yōu)化

BL21（DE3）△fumA-fumC/pET24a-maiA的菌體分別在pH 8、不同溫度下以100 mmol/L馬來(lái)酸為底物催化10 min，測(cè)定相對(duì)酶活。細(xì)胞催化馬來(lái)酸合成富馬酸的活性隨溫度升高而升高，當(dāng)溫度升高到50℃時(shí)達(dá)到最大催化能力，之后隨溫度升高酶活很快下降，見(jiàn)圖4（a）。

BL21（DE3）△fumA-fumC/pET24a-maiA菌體分別在50℃、不同pH下測(cè)定相對(duì)酶活。由圖4（b）可知，溶液pH對(duì)全細(xì)胞催化活性影響不大，在pH 8.3時(shí)獲得最高酶活。這可能是因?yàn)橥饨鏿H的改變對(duì)胞內(nèi)環(huán)境影響較小，導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)馬來(lái)酸催化活性不受顯著影響。

圖3 菌株BL21（DE3）△fumA-fumC/pET24a-maiA 5 L發(fā)酵罐發(fā)酵菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶曲線Fig.3 Growth and enzyme production status of BL21（DE3）△fumA-fumC/pET24a-maiA in5L bioreactor

圖4 BL21（DE3）△fumA-fumC/pET24a-maiA全細(xì)胞催化最適溫度和pHFig.4 Optimum temperature and pH of BL21（DE3）△fumA-fumC/pET24a-maiA

2.6 BL21（DE3）△fumA-fumC/pET24a-maiA全細(xì)胞催化的穩(wěn)定性

如果將全細(xì)胞應(yīng)用于工業(yè)化富馬酸的生產(chǎn)，為產(chǎn)品純度和提純工藝考慮，菌液添加量不宜過(guò)大，底物濃度應(yīng)盡量增大，這就需要延長(zhǎng)細(xì)胞催化時(shí)間。而大腸桿菌細(xì)胞在高溫條件下易裂解，因此對(duì)細(xì)胞的溫度穩(wěn)定性進(jìn)行考察。由圖5可以看出，在大腸桿菌最適生長(zhǎng)溫度37℃下保溫10 h后，細(xì)胞依然保留75%的初始酶活性；而在細(xì)胞最適催化溫度50℃下保溫3 h后，細(xì)胞僅具有25%的初始酶活性，所以37℃更適宜工業(yè)化的長(zhǎng)時(shí)間催化。此外，細(xì)胞在37℃時(shí)的催化活性可達(dá)50℃下的90%，并且比50℃高溫條件的能耗低，因此，37℃下進(jìn)行全細(xì)胞反應(yīng)更為適宜。

圖5 BL21（DE3）△fumA-fumC/pET24a-maiA細(xì)胞在37℃和50℃下穩(wěn)定性比較Fig.5 Stability of BL21（DE3）△fumA-fumC/pET24amaiA at 37℃and 50℃

2.7 BL21△fumA-fumC/pET24a-maiA全細(xì)胞催化馬來(lái)酸生產(chǎn)富馬酸的性能

重組菌株經(jīng)5 L罐發(fā)酵培養(yǎng)，按照發(fā)酵液（菌體細(xì)胞干重為60 g/L）∶2 mol/L富馬酸體積比為1∶4配置反應(yīng)液，在37℃下催化1 h。由表3可見(jiàn)，原始菌株蘋果酸副產(chǎn)物積累量達(dá)0.25 mol/L，僅產(chǎn)生1.34 mol/L的富馬酸，富馬酸摩爾轉(zhuǎn)化率僅為84%；BL21△fumA-fumC/pET24a-maiA則僅生成0.011 mol/L的蘋果酸，富馬酸的合成量提高為1.57 mol/L，富馬酸轉(zhuǎn)化率提高為98.4%，高于Ichikawa等[10]用產(chǎn)堿假單胞菌 （Pseudomonas alcaligenes）XD-1進(jìn)行全細(xì)胞催化的結(jié)果（富馬酸產(chǎn)量為0.49 mol/L，富馬酸對(duì)馬來(lái)酸的轉(zhuǎn)化率95%）。

表3 細(xì)胞催化馬來(lái)酸合成富馬酸性能比較Table 3 Comparison of whole-cell biocatalysis of fumarate from maleate

3 結(jié)語(yǔ)

作者用Red重組方法對(duì)E.coli BL21（DE3）進(jìn)行改造，分別敲除基因組中的fumA-fumC以及fumB基因，表明fumA-fumC基因編碼的代謝途徑是全細(xì)胞催化馬來(lái)酸合成富馬酸過(guò)程中副產(chǎn)物蘋果酸合成的主要途徑。重組菌株 BL21（DE3）△fumA-fumC/pET24a-maiA經(jīng)發(fā)酵罐培養(yǎng)可實(shí)現(xiàn)菌體（64 g/L）和馬來(lái)酸順?lè)串悩?gòu)酶的高效合成（306 U/mL）。該發(fā)酵液可將1.6 mol/L的馬來(lái)酸轉(zhuǎn)化為1.57 mol/L富馬酸，富馬酸轉(zhuǎn)化率提高到98.4%，而蘋果酸的轉(zhuǎn)化率僅為0.7%，顯示出較好的工業(yè)應(yīng)用潛力。

[1]ROA ENGEL C A，STRAATHOF A J J，Zijlmans T W，et al.Fumaric acid production by fermentation[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2008，78（3）：379-389.

[2]關(guān)共湊，黃耀威.由糠醛合成富馬酸[J].廣州化工，2001，29（2）：20-22. GUAN Gongcou，HUANG Yaowei.Synthesis of fumaric acid from furfural[J].Guang Zhou Chemical Industry and Technology，2001，29（2）：20-22.（in Chinese）

[3]蘇秋芳，陳少華.KBr-H2O2催化順酐異構(gòu)化合成富馬酸[J].化學(xué)試劑，2001，23（2）：120-121. SU Qiufang，CHEN Shaohua.Synthesis of fumaric acid by isomerization of maleic anhydride with KBr-H2O2as catalyst[J]. Chemical Reagents，2001，23（2）：120-121.（in Chinese）

[4]YASUO K，JINSAKU Y，YASUHISA A.Maleate cis-trans isomerase from Arthrobacter sp.TPU 5446[J].Journal of Fermentation and Bioengineering，1995，80（6）：610-612.

[5]KAZUHISA H，MAKOTIO G，ASUKAZI U，et al.Molecular analysis of maleate cis-trans isomerase from thermophilic bacteria [J].Bioscience Biotechnology and Biochemistry，2000，64（3）：569-576.

[6]王亞，崔文璟，周麗，等.粘質(zhì)沙雷氏菌馬來(lái)酸順?lè)串悩?gòu)酶表達(dá)純化及酶學(xué)性質(zhì)[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2014，33（11）：1204-1209. WANG Ya，CUI Wenjing，ZHOU Li，et al.Purification and characterization of maleate cis-trans isomerase from Serratia marcescens[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2014，33（11）：1204-1209.（in Chinese）

[7]ISHIGE T，HONDA K，SHIMIZU S.Whole organism biocatalysis[J].Current Opinion in Chemical Biology，2005，9（2）：174-180.

[8]RICHTER N，NEUMANN M，LIESE A，et al.Characterization of a whole-cell catalyst co-expressing glycerol dehydrogenase and glucose dehydrogenase and its application in the synthesis of L-glyceraldehyde[J].Biotechnolgy and Bioengineering，2010，106（4）：541-552.

[9]NIKOLOVA P，WARD O P.Whole-cell biocatalysis in nonconventional media[J].Journal of Industrial Microbiology，1993，12（2）：76-86.

[10]ICHIKAWA S，IINO T，SATO S，et al.Improvement of production rate and yield of fumaric acid from maleic acid by heat treatment of Pseudomonas alcaligenes strain XD-1[J].Biochemical Engineering Journal，2003，13（1）：7-13.

[11]DATSENKO K A，WANNER B L.One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2000，97（12）：6640-6645.

[12]LEE S Y.High cell-density culture of Escherichia coli[J].Trends in Biotechnology，1996，14（3）：98-105.

[13]WOODS S A，SCHWARTZBACH S D，GUEST J R.Two biochemically distinct classes of fumarase in Escherichia coli[J]. Biochimica et Biophysica Acta，1988，954（1）：14-26.

[14]PARK S J，GUNSALUS R P.Oxygen，iron，carbon，and superoxide control of the fumarase fumA and fumC genes of Escherichia coli-role of the arcA，fnr，and soxR gene-products[J].Journal of Bacteriology，1995，177（21）：6255-6262.

[15]TSENG C P.Regulation of fumarase（fumB）gene expression in Escherichia coli in response to oxygen，iron and heme availability：role of the arcA，fur，and hemA gene products[J].FEMS Microbiology Letters，1997，157（1）：67-72.

Efficient Production of Fumarate from Maleate Using Recombinant E.coli as Whole Cell Biocatalyst

FANG Yueqin1， ZHOU Li2， LIU Wenmao2， ZHOU Zhemin*2
（1.School of Environment and Civil Engineering，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Fumarate could be produced from maleate with whole cell of recombinant Escherichia coli.However，malate，with a yield of 15.5%，was generated as byproduct by the cellular fumarase，resulting in a decreased fumarate yield and purity.The chromosomal genes，fumA and fumC，in E. coli BL21（DE3）were inactivated，followed by over expression of the maleate cis-trans isomerate. After cultured in a bioreactor，the resulting strain BL21（DE3）△fumA-fumC/pET24a-maiA could generate 64 g/L dry cell weight and maleate cis-trans isomerate of 306 U/mL.With a volumetric ratio of fermentation broth（60 g/L dry cell weight）：fumarate（2 mol/L）=1∶4，fumarate yield of 98.4%and malate yield of 0.7%were produced after incubation at 37℃for 1 h.These results laid a foundation for industrial production of fumarate by whole-cell biocatalyst.

fumarate，maleate cis-trans isomerate，whole-cell biocatalysis，malate

Q 815

A

1673—1689（2016）12—1323—07

2015-07-08

江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（BK20130131，BK20130139）；江蘇省產(chǎn)學(xué)研聯(lián)合創(chuàng)新資金——前瞻性聯(lián)合研究項(xiàng)目（BY2014023-21）。

房月芹（1969—），女，安徽碭山人，理學(xué)碩士，講師，主要從事微生物方面的研究。E-mail：yqfang2003@hotmail.com

*通信作者：周哲敏（1969—），男，河北石家莊人，理學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事發(fā)酵工程方面的研究。

E-mail：zhmzhou@jiangnan.edu.cn