黃海燕 饒偉文 鐘建理

·實(shí)驗(yàn)研究·

金銀花與山銀花指紋圖譜對(duì)比

黃海燕 饒偉文 鐘建理

本文通過指紋圖譜比較金銀花和山銀花的質(zhì)量。參照《中國藥典》2015年版收載的含量測定的方法建立兩個(gè)系統(tǒng)的指紋圖譜,對(duì)50批樣品進(jìn)行指紋圖譜分析。木犀草苷分析系統(tǒng)下的金銀花(忍冬)和山銀花指紋圖譜相似度高,皂苷分析系統(tǒng)下的指紋圖譜不同品種間相似度低。木犀草苷分析系統(tǒng)說明金銀花與山銀花有共同的有效成分物質(zhì)基礎(chǔ),本系統(tǒng)指紋圖譜不能區(qū)別具體品種。皂苷分析系統(tǒng)中不同品種的指紋圖譜有較明顯的區(qū)別,可用于金銀花與山銀花具體品種的鑒別參考。金銀花與山銀花所含主要成分有相似,也有差異,建議湯劑配方、口服或外用的中成藥,金銀花與山銀花均可通用,而中成藥注射劑應(yīng)使用金銀花,且使用前應(yīng)做皂苷限度檢查。

金銀花；山銀花；主要成分；指紋圖譜

金銀花和山銀花是清熱解毒的常用中藥?！吨袊幍洹?005年版開始,將金銀花和山銀花分列,金銀花以綠原酸、木犀草苷為定量指標(biāo),山銀花以綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙的總量為定量指標(biāo)。何兵、熊艷、張芳等［1-3］建立了金銀花或山銀花指紋圖譜并進(jìn)行質(zhì)量分析。但實(shí)驗(yàn)樣品批次較少,產(chǎn)地較單一,4種山銀花的品種僅收集到灰氈毛忍冬1種,品種代表性不夠,對(duì)金銀花和不同品種山銀花的質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果說服力不足。為了進(jìn)一步比較金銀花和山銀花的質(zhì)量,指導(dǎo)臨床和生產(chǎn)的合理應(yīng)用,本文采集或收集50批不同產(chǎn)地金銀花、山銀花,參照《中國藥典》2015版金銀花和山銀花項(xiàng)下收載的含測方法［4］,分別測定相關(guān)成分的含量,同時(shí)通過兩個(gè)液相色譜系統(tǒng),進(jìn)行指紋圖譜對(duì)比,現(xiàn)將指紋圖譜研究結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1儀器 waters 2695/2998/2487 液相色譜儀,Alltech 3300 ELSD檢測器,XS205DU梅特勒電子分析天平,KQ-600E型超聲儀,SIGMA 3-30K高速臺(tái)式冷凍離心機(jī),Lab Tech EV311旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

1.2材料

1.2.1木犀草苷照品(批號(hào)：111720-201307),綠原酸對(duì)照品(批號(hào)：110753-201314),異綠原酸 A(3,5-二咖啡酰奎寧酸)對(duì)照品(批號(hào)：111782-201405),異綠原酸 C(4,5-二咖啡?？鼘幩?對(duì)照品(批號(hào)：111894-201102),灰氈毛忍冬皂苷乙對(duì)照品(批號(hào)：111814-201303),川續(xù)斷皂苷乙對(duì)照品(批號(hào)：111813-201202),均購于中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲酸、冰醋酸為色譜純,其余試劑均為分析純,水為高純水。

1.2.2金銀花19批、灰氈毛忍冬12批、紅腺忍冬15批、黃褐毛忍冬3批和華南忍冬1批,均系本所采集或收集,并由饒偉文主任藥師對(duì)其植物品種進(jìn)行了鑒定,金銀花為忍冬Lonicera japonica Thunb.,灰氈毛忍冬為Lonicera macranthoides Hand.一Mazz.,紅腺忍冬為Lonicera hypoglauca Miq.,華南忍冬為Lonicera confusa DC.,黃褐毛忍冬為Lonicera fulvotomentosa Hsu et S.C.Cheng。

2方法與結(jié)果

2.1木犀草苷分析系統(tǒng)

2.1.1溶液的配制

2.1.1.1對(duì)照品溶液 精密稱取木犀草苷、綠原酸、異綠原酸A和異綠原酸C 對(duì)照品適量,分別置50 ml容量瓶中,用70%乙醇溶解并稀釋至刻度,制成每1 ml各含40 μg的對(duì)照品溶液。

2.1.1.2供試品溶液 取本品細(xì)粉(過4號(hào)篩)約2 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入70%乙醇50 ml,稱定重量,超聲處理(功率250 W,頻率35 kHz)1 h,放冷,再稱定重量,用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過,精密量取續(xù)濾液10 ml,回收溶劑至干,殘?jiān)?0%乙醇溶解并轉(zhuǎn)移至5 ml量瓶中,加70%乙醇至刻度,即得。

2.1.2色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-phenyl 4.6× 250 mm,5 μm；流動(dòng)相：乙腈為流動(dòng)相A,0.5%冰醋酸為流動(dòng)相B,梯度洗脫程序見表1；流速1.0 ml/min；檢測波長：350 nm；柱溫：30.0℃；進(jìn)樣10 μl。分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液,按上述色譜條件測定,記錄色譜圖。見圖1。

表1 木犀草苷分析系統(tǒng)梯度洗脫程序

圖1 木犀草苷分析系統(tǒng)的HPLC圖

2.1.3測定結(jié)果 木犀草苷分析系統(tǒng)中,金銀花和山銀花共50批樣品色譜圖均相似,峰3為木犀草苷,另外所有樣品均檢測到的3個(gè)較大的色譜峰經(jīng)對(duì)照品保留時(shí)間和紫外吸收?qǐng)D比對(duì),鑒定為綠原酸、異綠原酸A(3,5-二咖啡?？鼘幩?和異綠原酸C(4,5-二咖啡酰奎寧酸)。將色譜圖以AIA格式輸入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012.130723版本)”。以金銀花1號(hào)樣品為參照?qǐng)D譜,采用中位圖譜生成方式,時(shí)間寬度為0.5,分別對(duì)所有樣品的色譜信息進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)分析,結(jié)果相似度均＞0.99,表明金銀花和各品種山銀花在這個(gè)液相系統(tǒng)檢測到的化學(xué)成分相對(duì)一致,但本系統(tǒng)指紋圖譜不能區(qū)別具體品種。

2.2皂苷分析系統(tǒng)

2.2.1溶液的配制

2.2.1.1對(duì)照品溶液 精密稱取綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙對(duì)照品適量,分別置25 ml容量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,制成每1毫升各含200 μg的對(duì)照品溶液。

2.2.1.2供試品溶液 取樣品粉末(過4號(hào)篩),取約0.3 g,精密稱定,精密稱定,置50 ml 離心管中,加50%甲醇40 ml并混勻,超聲處理40 min(功率250 W,頻率35 kHz),離心10 min (5000轉(zhuǎn)/min),取上清液轉(zhuǎn)移至50 ml量瓶中,殘?jiān)?0%甲醇7 ml渦旋1 min,離心10 min(5000轉(zhuǎn)/min),合并上清液至同一量瓶中,加50%甲醇至刻度,混勻,以0.45 μm微孔濾膜濾過,即得。

2.2.2色譜條件 色譜柱：Phenomenex Gemini C18 4.6×250 mm,5 μm；流動(dòng)相：0.4%甲酸為流動(dòng)相A,乙腈為流動(dòng)相B,梯度洗脫程序見表2；流速1.0 ml/min；柱溫：30.0℃；進(jìn)樣10 μl；蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)漂移管溫度：60℃,氣體流量：2.0 L/min。分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液,按上述色譜條件測定,記錄色譜圖。見圖2。

表2 皂苷分析系統(tǒng)梯度洗脫程序

圖2 皂苷分析系統(tǒng)的HPLC圖

2.2.3測定結(jié)果 皂苷分析系統(tǒng)中,山銀花的相同品種的樣品之間色譜圖較相似,重復(fù)性好；19批金銀花(忍冬)大部分也較一致,未檢出川續(xù)斷皂苷乙和灰氈毛忍冬皂苷乙,但有7批檢出川續(xù)斷皂苷乙峰,其中3批同時(shí)檢出灰氈毛忍冬皂苷乙峰。

品種之間色譜圖有差異,灰氈毛忍冬和紅腺忍冬色譜圖相對(duì)其他品種較接近,只峰面積比不同,灰氈毛忍冬的灰氈毛忍冬皂苷乙峰明顯大于川續(xù)斷皂苷乙峰,而紅腺忍冬的灰氈毛忍冬皂苷乙峰小于川續(xù)斷皂苷乙。金銀花(忍冬)色譜圖在兩個(gè)皂苷峰保留時(shí)間附近幾乎沒有色譜峰。

將色譜圖以AIA格式輸入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012.130723版本)”,采用中位圖譜生成方式,時(shí)間寬度為0.5,分別對(duì)所有樣品的色譜信息進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)分析,結(jié)果灰氈毛忍冬、紅腺忍冬、黃褐毛忍冬相同品種之間相似度較高,不同品種之間的相似度則較低。表明金銀花和各品種山銀花在這個(gè)液相系統(tǒng)檢測到的化學(xué)成分有差異。特別是皂苷部分,品種之間的皂苷成分的種類和含量不同。用系統(tǒng)的指紋圖譜可用于金銀花與山銀花具體品種的鑒別。

3 討論

由于中藥化學(xué)成分的復(fù)雜性,普遍存在多組分共存、多種藥理作用綜合起效的情況。有文獻(xiàn)報(bào)道金銀花和山銀花的藥理作用相同,均有抗菌、抗病毒、退熱和抗炎等作用,不論是金銀花還是山銀花都可以有效地抑制鏈球菌、肺炎雙球菌、葡萄球菌、綠膿桿菌等病菌［5,6］；亦有研究報(bào)道,雖然灰氈毛忍冬和忍冬的幾種有效成分含量存在較大差異,但它們對(duì)6種常見致病菌均有明顯地抑菌和殺菌作用,而且在抗菌、抗炎、解熱、免疫調(diào)節(jié)等方面,灰氈毛忍冬與忍冬的作用相當(dāng)［7］。中國藥典的金銀花和山銀花兩個(gè)品種的性味歸經(jīng)、功能主治、用法用量亦完全相同,臨床應(yīng)用無法區(qū)分。鑒于山銀花含皂苷總體偏高的情況,本文為了充分利用中藥資源,湯劑配方、口服或外用的中成藥,金銀花與山銀花可通用,但中成藥注射劑應(yīng)使用金銀花,而且投料前應(yīng)先做皂苷限量檢查,以保證用藥安全。

［1］何兵,劉艷,李春紅,等.多指標(biāo)定量指紋圖譜在中藥金銀花質(zhì)量評(píng)價(jià)中的應(yīng)用.中國藥學(xué)雜志,2015,50(14):1237-1242.

［2］熊艷,高慧敏,王智民,等.金銀花不同干燥技術(shù)HPLC指紋圖譜研究.中國中藥雜志,2009,34(8):1015-1017.

［3］張芳,孫希芳,張永清,等.金銀花藥材的HPLC指紋圖譜及綠原酸、木犀草苷含量的同時(shí)測定.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,32(2):154-159.

［4］魏惠珍,羅小妹,劉文霞,等.2015版《中國藥典》一部增修訂概況.江西中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2016,28(4):221.

［5］胡克杰,孫考祥,王曙璐,等.氯原酸體外抗病毒作用研究.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2001,35(6):430-432.

［6］李光玉,吳如英,王玉英,等.灰氈毛忍冬的質(zhì)量研究(IV)—對(duì)普通感冒的臨床療效觀察.中藥材科技,1984(3):14.

［7］張小娜,唐清,侯敏,等.灰氈毛忍冬與忍冬的藥理作用比較研究.中國藥理學(xué)通報(bào),2012,28(11):1582-1587.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2016.16.203

2016-05-19］

541001 廣西桂林食品藥品檢驗(yàn)所