楊佳 李黎明 龍嘉 許翠 楊雪源 蔣明軍

黑素瘤相關(guān)微小RNA的研究進展

楊佳 李黎明 龍嘉 許翠 楊雪源 蔣明軍

微小RNA參與細胞增殖、分化和凋亡是多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要調(diào)控因子。研究發(fā)現(xiàn)，多種微小RNA在黑素瘤中表達異常，其中Let-7家族、微小RNA 137、微小RNA 200c和微小RNA 196a等發(fā)揮抑癌基因樣作用，而微小RNA 221/222、微小RNA 30b/30d、微小RNA 146a、微小RNA 214和微小RNA 182發(fā)揮癌基因樣作用。黑素瘤相關(guān)微小RNA的研究將豐富黑素瘤的分子生物學發(fā)病機制，為黑素瘤的早期診斷和治療提供新的思路。

黑色素瘤；微RNAs；細胞增殖；細胞分化；細胞凋亡

黑素瘤是一種高度惡性、易遠處轉(zhuǎn)移的皮膚腫瘤，起源于黑素細胞，多發(fā)生于皮膚，亦可見于皮膚黏膜交界處、眼球脈絡(luò)膜等處，是皮膚癌中最具侵襲性的腫瘤。黑素瘤雖只占全部皮膚癌的4%，但因黑素瘤死亡的人數(shù)約占所有因皮膚癌死亡人數(shù)的75%［1］。研究顯示，多種微小 RNA（miRNA）在黑素瘤中表達異常，根據(jù)下游調(diào)控靶基因的不同，在黑素瘤中發(fā)揮癌基因或抑癌基因樣作用，參與黑素瘤發(fā)生、進展等生物學進程［2］。

1 黑素瘤相關(guān)miRNA的表觀遺傳學調(diào)控機制

研究顯示，miRNA編碼基因上游CpG島甲基化沉默相應(yīng) miRNA，如 miR-31、miR-18b、miR-375等。Asangani等［3］發(fā)現(xiàn)，miR-31 由位于染色質(zhì)9p21.3的長約105 kB的miR-31宿主基因所編碼，該基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域存在77個CpG島及豐富的H3K27Ac（組蛋白H3第27位賴氨酸乙?；鳦pG島甲基化及多梳蛋白EZH2介導的H3K27me3（組蛋白第27位賴氨酸3甲基化）可沉默miR-31。黑素瘤細胞系及組織標本中的miR-18b表達下降，基因序列分析顯示，miR-18b上游存在豐富的CpG島區(qū)域，經(jīng)甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑處理的黑素瘤細胞系中，miR-18b上調(diào)，提示DNA甲基化參與調(diào)控miR-18b 表達［4］。Mazar等［5］發(fā)現(xiàn)，miR-375 編碼基因上游CpG島甲基化通過沉默miR-375促進黑素瘤侵襲轉(zhuǎn)移進程。此外，miR-29c通過下調(diào)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A和3B影響基因組整體甲基化水平［6］。

2 黑素瘤相關(guān)抑癌基因樣miRNA

2.1 let-7 家族：Schultz等［7］分析良性色素痣和原發(fā)性黑素瘤標本中的157種miRNA表達譜，發(fā)現(xiàn)72種miRNA存在表達差異，其中5個let-7家族成員（let-7a、let-7b、let-7d、let-7e、let-7g）在原發(fā)性黑素瘤中表達下降，let-7b下降明顯。過表達let-7b可通過下調(diào)周期素D1、D3、A和細胞周期蛋白依賴性激酶4抑制細胞周期進程，減少處于S期、增加處于G1的黑素瘤細胞數(shù)目，并抑制黑素瘤細胞的非貼壁依賴性生長。Müller等［8］研究指出，let-7 家族成員let-7a通過靶向調(diào)控整合素β3抑制黑素瘤侵襲，發(fā)揮抑癌基因樣作用。

作者單位：210042 南京，中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 皮膚病研究所中心實驗室

2.2 miR-137：miR-137 位于染色質(zhì) 1p22 區(qū)域，該區(qū)域與黑素瘤發(fā)病風險相關(guān)。Bemis等［9］發(fā)現(xiàn)，miR-137與小眼球相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（MITF）3′UTR結(jié)合下調(diào)MITF，后者是黑素細胞發(fā)育、成熟、凋亡、黑素沉著的主要調(diào)節(jié)因子。上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化參與腫瘤局部浸潤和遠處轉(zhuǎn)移過程。E鈣黏蛋白能維持正常上皮細胞間連接的穩(wěn)定性，其黏附溶解是上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的起始步驟。Deng 等［10］研究指出，miR-137 通過靶向調(diào)控轉(zhuǎn)錄輔助抑制因子羧基末端結(jié)合蛋白上調(diào)E鈣黏蛋白，抑制上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化介導的黑素瘤轉(zhuǎn)移、侵襲。多梳蛋白EZH2通過介導H3K27me3，抑制相關(guān)抑癌基因轉(zhuǎn)錄參與黑素瘤進展，其表達水平與黑素瘤患者生存率相關(guān)。Luo等［11］研究認為，過表達miR-137可抑制黑素瘤細胞的增殖、侵襲、遷移，其機制可能為miR-137下調(diào)MITF和癌基因c-Met、YB1、EZH2影響黑素瘤進展過程中多種信號通路而發(fā)揮抑癌基因樣作用。

2.3 miR-200c：在轉(zhuǎn)移性黑素瘤較原發(fā)性黑素瘤中表達降低，且下降水平與瘤體厚度增加程度一致［12］，其過表達可抑制黑素瘤細胞非貼壁依賴性生長，通過靶向調(diào)控E鈣黏蛋白轉(zhuǎn)錄抑制因子EZB2抑制上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化介導的腫瘤浸潤侵襲［13］，提示miRNA-200c在黑素瘤進展、轉(zhuǎn)移中具有抑癌基因樣作用。

2.4 miR-196a：miR-196a靶向調(diào)控 HOX 轉(zhuǎn)錄因子超家族成員 HOX-C8［14］、HOX-B7［15］抑制黑素瘤侵襲進展。Mueller等［14］指出，黑素瘤中 miR-196a 與HOX-C8表達水平負相關(guān)，轉(zhuǎn)染miR-196a的黑素瘤細胞其侵襲能力較親代細胞下降約40%，并證實miR-196a可與HOX-C8 3′UTR起始區(qū)域結(jié)合下調(diào)HOX-C8引起下游相關(guān)基因表達紊亂發(fā)揮抑癌基因樣作用。Braig 等［15］發(fā)現(xiàn)，miRNA-196a 表達缺失可通過上調(diào)HOX-B7，誘導堿性成纖維因子表達，進而活化原癌基因Ets-1，最終引起骨形成蛋白4上調(diào)，促進黑素瘤轉(zhuǎn)移。

2.5 其他黑素瘤相關(guān)的抑癌基因樣miRNA：Felli等［16］指出，miR-126/126*通過下調(diào)金屬蛋白酶9和基質(zhì)金屬蛋白酶7抑制肝素結(jié)合性表面生長因子前體蛋白水解，抑制黑素瘤細胞增殖、侵襲。Nyholm等［17］發(fā)現(xiàn)，在黑素瘤細胞系中，轉(zhuǎn)染miR-125b可誘導細胞周期停滯于G0/G1期，并出現(xiàn)大量表達衰老標記物如p21、p27、p53的細胞，提示miR-125b在黑素瘤中發(fā)揮抑癌基因樣作用。miR-18b在黑素瘤標本及細胞系中表達降低，且miR-18b低水平表達的原發(fā)性黑素瘤患者總體生存率降低，過表達的miR-18b通過靶向調(diào)控抑癌基因鼠雙微基因2上調(diào)p53，抑制黑素瘤細胞增殖、侵襲及上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，誘導黑素瘤細胞凋亡［4］。

3 黑素瘤相關(guān)癌基因樣miRNA

3.1 miR-221/222：Felicetti等［18］研究顯示，miR-221/222通過下調(diào)p27kipl/CDKN1B和c-kit受體促進 MITF 表達，激活 Ref、C-myc，上調(diào)周期素 D1、D3和細胞周期蛋白依賴性激酶4，促進黑素瘤進展。Errico 等［19］發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子 HOX-B7/PBX2 通過活化miR-221/222，下調(diào)c-Fos抑制腫瘤細胞凋亡，HOX-B7/PBX2拮抗劑HXR9通過阻斷上述通路誘導黑素瘤細胞凋亡，為黑素瘤的靶向治療提供了思路。

3.2 miR-30b/30d：Gaziel-Sovran 等［20］研究發(fā)現(xiàn)，體外免疫抑制環(huán)境中過表達miR-30b/30d，可增強黑素瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力，其表達沉默具有相反的效應(yīng)，過表達的miR-30b/30d通過下調(diào)GalNAc轉(zhuǎn)移酶GALNT7導致免疫抑制因子IL-10合成和分泌增加，抑制免疫細胞活化、募集，促進黑素瘤轉(zhuǎn)移。

3.3 miR-146a：Forloni等［21］研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a 通過下調(diào)NUMB蛋白，激活Notch信號參與黑素瘤發(fā)生發(fā)展。黑素瘤中普遍存在BRAF、NRAS基因突變，其中BRAF V600E突變最為常見，miR-146a在BRAFV600E和NRASQ61K黑素瘤細胞系中表達水平較野生型中明顯增高，其機制可能為通過激活BRAF-MEK-細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）信號通路活化MYC，促進miR-146a轉(zhuǎn)錄表達。且前體miRNA-146a基因多態(tài)性（C＞G rs2910164）影響黑素瘤進展。因此，聯(lián)合應(yīng)用Notch抑制劑，即γ分泌酶抑制劑和BRAF抑制劑可能成為一種有效治療黑素瘤的方法。然而，有研究指出，由于γ分泌酶抑制劑存在較大的不良反應(yīng)，需進一步在黑素瘤細胞系和異種移植模型中進行廣泛深入研究［22］。

3.4 miR-214：Penna 等［23］發(fā)現(xiàn)，miR-214 在轉(zhuǎn)移性黑素瘤中表達上調(diào)，其通過下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子TFAP2C、TFAP2A、整合素α3及多種表面蛋白，如MET參與黑素瘤轉(zhuǎn)移過程。進一步研究發(fā)現(xiàn)了一條由miR-214、miR-148b、激活蛋白2轉(zhuǎn)錄因子、活化真核細胞黏附分子構(gòu)成的調(diào)控黑素瘤細胞遠處轉(zhuǎn)移的通路［24］。其中，miR-214具有核心作用，其通過在轉(zhuǎn)錄水平直接沉默TFAP2及轉(zhuǎn)錄后水平間接下調(diào)miR-148b兩條途徑上調(diào)活化真核細胞黏附分子，促進黑素瘤細胞運動、侵襲、遠處轉(zhuǎn)移。

3.5 miR-182：在黑素瘤中表達上調(diào)的miR-182是miR-183-96-182家族成員之一，位于染色質(zhì)7q31-34區(qū)域，兩側(cè)分別編碼癌基因c-MET和BRAF。Segura等［25］研究發(fā)現(xiàn)，過表達 miR-182通過直接下調(diào)MITF、FOXO3抑制凋亡、促進黑素瘤細胞運動、轉(zhuǎn)移。Huynh等［26］在免疫低下小鼠脾臟內(nèi)注射A375黑素瘤細胞制作黑素瘤肝轉(zhuǎn)移小鼠模型，發(fā)現(xiàn)腹膜腔注射miR-182抑制劑的小鼠其肝臟轉(zhuǎn)移負荷較對照組明顯下降，提示miR-182抑制劑有望成為轉(zhuǎn)移性黑素瘤的治療方法。

4 miRNA與黑素瘤的診斷、治療、預(yù)后

Leidinger等［27］對 35例黑素瘤患者和 20例健康人外周血進行高通量miRNA表達分析，發(fā)現(xiàn)21種表達下降，30種表達上升，其中16種表達明顯下降的miRNA，診斷黑素瘤準確率高達97%，提示血清miRNA是一種有效的黑素瘤生物標志物。Friedman等［28］基于統(tǒng)計學分析證實，血清miRNA在判斷黑素瘤患者預(yù)后中的價值，指出5種血清miRNA，即miR-150、miR-15b、miR-199A-5p、miR-33a、miR-424與黑素瘤復發(fā)風險相關(guān)。Kanemaru等［29］研究發(fā)現(xiàn)，黑素瘤患者血清miR-221水平較健康人明顯升高，Ⅰ～Ⅳ期黑素瘤患者血清miR-221水平較原位黑素瘤患者升高，且血清水平與瘤體厚度正相關(guān)，隨訪顯示手術(shù)切除瘤體后血清miR-221水平下降，復發(fā)時其水平再度升高，提出miR-221可作為黑素瘤診斷、分期、判斷治療效果及預(yù)后的血清學標志物。miR-21血清水平可反映腫瘤負荷，與已知黑素瘤預(yù)后指標Breslow厚度和潰瘍深度相關(guān)，且腫瘤組織內(nèi)miR-21表達水平與血清水平一致，提示血清miR-21可能是一種獨立的黑素瘤預(yù)后標志物［30］。

5 結(jié)語

miRNA在黑素瘤發(fā)生發(fā)展中具有強大的調(diào)控作用，且其種類及功能在不斷的發(fā)現(xiàn)之中。尋找與黑素瘤相關(guān)的miRNA，明確其靶基因及作用機制，并對其構(gòu)成的復雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進行分析，將有助于豐富黑素瘤的分子生物學發(fā)病機制，為將來基于miRNA的黑素瘤靶向治療開辟道路。

［1］Kudchadkar RR,Smalley KS,Glass LF,et al.Targeted therapy in melanoma ［J］.Clin Dermatol,2013,31 （2）:200-208.DOI:10.1016/j.clindermatol.2012.08.013.

［2］Winter J,Jung S,Keller S,et al.Many roads to maturity:microRNA biogenesis pathways and their regulation［J］.Nat Cell Biol,2009,11（3）:228-234.DOI:10.1038/ncb0309-228.

［3］Asangani IA,Harms PW,Dodson L,et al.Genetic and epigenetic loss of microRNA-31 leads to feed-forward expression of EZH2 in melanoma ［J］.Oncotarget,2012,3 （9）:1011-1025.DOI:10.18632/oncotarget.622.

［4］Dar AA,Majid S,Rittsteuer C,et al.The role of miR-18b in MDM2-p53 pathway signaling and melanoma progression ［J］.J Natl Cancer Inst,2013,105 （6）:433-442.DOI:10.1093/jnci/djt003.

［5］Mazar J,DeBlasio D,Govindarajan SS,et al.Epigenetic regulation ofmicroRNA-375 and its role in melanoma development in humans ［J］.FEBS Lett,2011,585 （15）:2467-2476.DOI:10.1016/j.febslet.2011.06.025.

［6］Nguyen T,Kuo C,Nicholl MB,et al.Downregulation of microRNA-29c is associated with hypermethylation of tumorrelated genes and disease outcome in cutaneous melanoma ［J］.Epigenetics,2011,6（3）:388-394.DOI:10.4161/epi.6.3.14056.

［7］Schultz J,Lorenz P,Gross G,et al.MicroRNA let-7b targets important cell cycle molecules in malignant melanoma cells and interferes with anchorage-independent growth［J］.Cell Res,2008,18（5）:549-557.DOI:10.1038/cr.2008.45.

［8］Müller DW,Bosserhoff AK.Integrin beta 3 expression is regulated by let-7a miRNA in malignantmelanoma ［J］.Oncogene,2008,27 （52）:6698-6706.DOI:10.1038/onc.2008.282.

［9］Bemis LT,Chen R,Amato CM,et al.MicroRNA-137 targets microphthalmia-associated transcription factor in melanoma cell lines ［J］.Cancer Res,2008,68 （5）:1362-1368.DOI:10.1158/0008-5472.CAN-07-2912.

［10］Deng Y,Deng H,Bi F,et al.MicroRNA-137 targets carboxylterminal binding protein 1 in melanoma cell lines ［J］.Int J Biol Sci,2011,7（1）:133-137.DOI:10.7150/ijbs.7.133.

［11］Luo C,Tetteh PW,Merz PR,et al.miR-137 inhibits the invasion of melanoma cells through downregulation of multiple oncogenic target genes［J］.J Invest Dermatol,2013,133（3）:768-775.DOI:10.1038/jid.2012.357.

［12］van Kempen L C,van den Hurk K,Lazar V,et al.Loss of microRNA-200a and c,and microRNA-203 expression at the invasive front of primary cutaneous melanoma is associated with increased thickness and disease progression ［J］.Virchows Arch,2012,461（4）:441-448.DOI:10.1007/s00428-012-1309-9.

［13］Xu Y,Brenn T,Brown ER,et al.Differential expression of microRNAs during melanoma progression:miR-200c,miR-205 and miR-211 are downregulated in melanoma and act as tumour suppressors ［J］.Br J Cancer,2012,106 （3）:553-561.DOI:10.1038/bjc.2011.568.

［14］Mueller DW,Bosserhoff AK.MicroRNA miR-196a controls melanoma-associated genes by regulating HOX-C8 expression［J］.Int J Cancer,2011,129 （5）:1064-1074.DOI:10.1002/ijc.25768.

［15］Braig S,Mueller DW,Rothhammer T,et al.MicroRNA miR-196a is a central regulator of HOX-B7 and BMP4 expression in malignant melanoma［J］.Cell Mol Life Sci,2010,67（20）:3535-3548.DOI:10.1007/s00018-010-0394-7.

［16］ Felli N,Felicetti F,Lustri AM,et al.miR-126&126*restored expressions play a tumor suppressor role by directly regulating ADAM9 and MMP7 in melanoma［J/OL］.PLoS One,2013,8（2）:e56824［2013-02-21］.DOI:10.1371/journal.pone.0056824.http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0056824.

［17］Nyholm AM,Lerche CM,Manfé V,et al.miR-125b induces cellular senescence in malignant melanoma ［J］.BMC Dermatol,2014,14（1）:8.DOI:10.1186/1471-5945-14-8.

［18］Felicetti F,Errico MC,Bottero L,et al.The promyelocytic leukemia zinc finger-microRNA-221/-222 pathway controls melanoma progression through multiple oncogenic mechanisms［J］.Cancer Res,2008,68 （8）:2745-2754.DOI:10.1158/0008-5472.CAN-07-2538.

［19］Errico MC,Felicetti F,Bottero L,et al.The abrogation of the HOXB7/PBX2 complex induces apoptosis in melanoma through the miR-221&222-c-FOS pathway ［J］.Int J Cancer,2013,133（4）:879-892.DOI:10.1002/ijc.28097.

［20］ Gaziel-Sovran A,Segura MF,Di Micco R,et al.miR-30b/30d regulation ofGalNAc transferases enhances invasion and immunosuppression during metastasis［J］.Cancer Cell,2011,20（1）:104-118.DOI:10.1016/j.ccr.2011.05.027.

［21］Forloni M,Dogra SK,Dong Y,et al.miR-146a promotes the initiation and progression of melanoma by activating Notch signaling［J］.Elife,2014,3:e01460.DOI:10.7554/eLife.01460.

［22］Garraway LA.A Notch for noncoding RNA in melanoma ［J］.N Engl J Med,2014,370（20）:1950-1951.DOI:10.1056/NEJMcibr1402173.

［23］Penna E,Orso F,Cimino D,et al.microRNA-214 contributes to melanoma tumour progression through suppression of TFAP2C［J］.EMBO J,2011,30 （10）:1990-2007.DOI:10.1038/emboj.2011.102.

［24］Penna E,Orso F,Cimino D,et al.miR-214 coordinates melanoma progression by upregulating ALCAM through TFAP2 and miR-148b downmodulation ［J］.Cancer Res,2013,73（13）:4098-4111.DOI:10.1158/0008-5472.CAN-12-3686.

［25］Segura MF,Hanniford D,Menendez S,et al.Aberrant miR-182 expression promotes melanoma metastasis by repressing FOXO3 and microphthalmia-associated transcription factor［J］.Proc Natl Acad Sci U S A,2009,106（6）:1814-1819.DOI:10.1073/pnas.0808263106.

［26］Huynh C,Segura MF,Gaziel-Sovran A,et al.Efficientin vivomicroRNA targeting of liver metastasis ［J］.Oncogene,2011,30（12）:1481-1488.DOI:10.1038/onc.2010.523.

［27］Leidinger P,Keller A,Borries A,et al.High-throughput miRNA profiling of human melanoma blood samples ［J］.BMC Cancer,2010,10:262.DOI:10.1186/1471-2407-10-262.

［28］Friedman EB,Shang S,de Miera EV,et al.Serum microRNAs as biomarkers for recurrence in melanoma ［J］.J Transl Med,2012,10:155.DOI:10.1186/1479-5876-10-155.

［29］Kanemaru H,Fukushima S,Yamashita J,et al.The circulating microRNA-221 level in patients with malignant melanoma as a new tumor marker ［J］.J Dermatol Sci,2011,61 （3）:187-193.DOI:10.1016/j.jdermsci.2010.12.010.

［30］Saldanha G,Potter L,Shendge P,et al.Plasma microRNA-21 is associated with tumor burden in cutaneous melanoma ［J］.J Invest Dermatol,2013,133 （5）:1381-1384.DOI:10.1038/jid.2012.477.

Melanoma-related microRNAs

Yang Jia,Li Liming,Long Jia,Xu Cui,Yang Xueyuan,Jiang Mingjun.Central Laboratory,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China

MicroRNAs （miRNAs）,as an important regulatory factor in development of multiple malignant tumors,take part in cell proliferation,differentiation and apoptosis.Studies have found aberrant expressions of various miRNAs in melanoma.Among these miRNAs,the Let-7 family,miRNA-137,miRNA-200c and miRNA-196a act as tumor suppressor genes,while miRNA-221/222,miRNA-30b/30d,miRNA-146a,miRNA-214 and miRNA-182 act as oncogenes.Studies on melanoma-related miRNAs will enrich knowledge about molecular pathogenesis of melanoma,and provide new ideas for early diagnosis and treatment of melanoma.

Melanoma;MicroRNAs;Cell proliferation;Cell differentiation;Apoptosis

s:YangXueyuan,Email:yangxueyuan@medmail.com.cn;JiangMingjun,Email:drmingjunjiang@163.com

2015-03-23）

國家自然科學基金（31470274）；江蘇省臨床醫(yī)學科技專項（BL2012003）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（31470274）;Jiangsu Provincial Special Programof Medical Science（BL2012003）

10.3760/cma.j.issn.1673-4173.2016.02.017

楊雪源，Email:yangxueyuan@medmail.com.cn；蔣明軍，Email:drmingjunjiang@163.com