殷　莉，　黃姍姍，　何主強(qiáng)

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院1婦產(chǎn)科2神經(jīng)內(nèi)科，武漢　430030

3武漢市第一醫(yī)院神經(jīng)外科，武漢　430022

?

吲哚胺2，3-雙加氧酶及細(xì)胞因子在創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙患者中的表達(dá)變化及意義*

殷莉1，黃姍姍2，何主強(qiáng)3△

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院1婦產(chǎn)科2神經(jīng)內(nèi)科，武漢430030

3武漢市第一醫(yī)院神經(jīng)外科，武漢430022

摘要：目的探討干擾素-γ(interferon-γ，INF-γ)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)與吲哚胺2，3-雙加氧酶(indoleamine 2，3-dioxy-genase，IDO)在創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(PTSD)患者血清中表達(dá)變化及其臨床意義。方法采集80例PTSD患者血清，同時(shí)收集80例健康對照組血清，運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和Western blot的方法對PTSD患者血清中INF-γ、TNF-α、IL-6及IDO進(jìn)行檢測，與對照組進(jìn)行比較。結(jié)果實(shí)驗(yàn)表明PTSD組及正常對照組血清INF-γ、TNF-α、IL-6、IDO水平分別為[(28.43±11.23)vs.(3.01±1.12)pg/mL]、[(14.58±2.16)vs.(2.45±0.90)pg/mL]、[(16.34±5.31)vs.(2.01±1.08)pg/mL]、[(0.223 5±0.061 1)vs.(0.031 2±0.001 6)]，PTSD組明顯高于正常對照組(均P<0.01)。結(jié)論INF-γ、TNF-α、IL-6及IDO表達(dá)的異常升高可能在PTSD的發(fā)病機(jī)制中扮演重要角色。

關(guān)鍵詞：創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙；吲哚胺2，3-雙加氧酶；細(xì)胞因子

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(post traumatic stress disorder，PTSD)是指一種由重大自然災(zāi)害、恐怖事件、戰(zhàn)爭、意外交通事故、罹患癌癥、刑事犯罪、精神虐待等嚴(yán)重刺激因素引發(fā)的精神異常反應(yīng)[1-2]。隨著社會壓力的增加，PTSD患者發(fā)病率逐漸升高，且具有發(fā)病時(shí)間長、臨床療效差等特點(diǎn)，其病因目前尚不明確，現(xiàn)已從早期的神經(jīng)遞質(zhì)紊亂學(xué)說轉(zhuǎn)變?yōu)閷ι窠?jīng)心理-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)失衡的研究。其中細(xì)胞因子對機(jī)體免疫系統(tǒng)應(yīng)答發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，且作為一種神經(jīng)介質(zhì)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)，調(diào)控機(jī)體神經(jīng)生化、神經(jīng)內(nèi)分泌與行為的改變[3-4]。細(xì)胞因子(cytokine，CK)分為兩類，一類為前炎性因子(如INF-γ、TNF-α、IL-6)，其作用是刺激免疫細(xì)胞，對受損的細(xì)胞發(fā)揮局部及遠(yuǎn)程效應(yīng)[5]，另一類為抗炎性因子(如IL-4、IL-10、IL-13)。IDO作為色氨酸-犬尿氨酸代謝路徑上的首個(gè)限速酶，主要表達(dá)于外周巨噬細(xì)胞與中樞星形膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞，同時(shí)前炎性細(xì)胞因子可刺激IDO分泌增多。IDO的異常表達(dá)存在于多種急慢性神經(jīng)退行性疾病中[6]。本實(shí)驗(yàn)檢測PTSD患者血清中CK：INF-γ、TNF-α、IL-6水平及IDO含量變化，初步探索前炎性細(xì)胞因子中INF-γ、TNF-α、IL-6及IDO與PTSD發(fā)病的關(guān)聯(lián)，為進(jìn)一步研究PTSD發(fā)病機(jī)制提供新的思路。

1對象與方法

1.1研究對象

PTSD組：為2013年2月至2014年6月在同濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科就診的PTSD患者。入選標(biāo)準(zhǔn)：由神經(jīng)內(nèi)科的精神專業(yè)醫(yī)生參照第4版的美國PTSD診斷標(biāo)準(zhǔn)(DSM-Ⅳ)確診為PTSD，患者既往無神經(jīng)系統(tǒng)疾病和焦慮癥、抑郁癥等精神障礙與內(nèi)分泌系統(tǒng)和傳染病史。對照組：為2013年2月至2014年6月選取同期在同濟(jì)醫(yī)院行健康體檢人群。入組標(biāo)準(zhǔn)：①與PTSD組按照年齡、性別配對；②無心、肝、胰、肺、腎等臟器疾??；③無精神病及傳染病史；④近3月內(nèi)未服用甾體或非甾體類抗炎藥。本研究取得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，受檢者均簽署知情同意書。

最終共選取80例PTSD患者，病程0.5~1 7年，平均病程(8.96±5.92)年，其中男性46例，女性34例，年齡26~58歲，平均年齡為(41±11)歲。對照組按性別、年齡1：1配對選取80例，男性46例，女性34例；年齡25~60歲，平均年齡(41±14)歲。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樣本收集于7：00~8：00 Am空腹靜脈采血8 mL，離心后分離血清，保存在-80℃低溫冰箱。檢測血清中INF-γ、TNF-α、IL-6與IDO表達(dá)情況。

1.2.2檢測方法①采用Western blot檢測血清中IDO表達(dá)：標(biāo)本于冰上加入三去污裂解液200 μL，蛋白裂解30 min后進(jìn)行總蛋白的提取，采取Bradford法測定蛋白的濃度。將組織提取的蛋白濃縮液經(jīng)95℃變性后進(jìn)行SDS-PAGE電泳、染色、轉(zhuǎn)膜，加入羊抗人IDO多克隆抗體(1：500)、人抗鼠β-actin抗體(1：500)，然后在4℃條件下孵育過夜。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記鼠抗羊抗體/鼠抗人抗體(1：200)，在室溫條件下孵育1 h。采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光顯色液進(jìn)行顯色，最后進(jìn)行膠片的曝光、洗片。以GDS-8000型全自動凝膠成像分析系統(tǒng)(英國UVP公司)對蛋白條帶進(jìn)行掃描并最終定量分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)果為IDO /β-actin灰度值。②采用夾心酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測血清中INF-γ、TNF-α、IL-6含量：收集的標(biāo)本按試劑盒(武漢德邦生物科技有限公司)說明書程序進(jìn)行測定。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

PTSD組和對照組血清細(xì)胞因子及IDO水平檢測，結(jié)果顯示，PTSD組的血清INF-γ、TNF-α、IL-6及IDO含量變化均顯著高于對照組(均P<0.01)，結(jié)果見表1，圖1。

表1　兩組細(xì)胞因子及IDO含量比較

與對照組比較，*P<0.01

圖1　Western blot檢測IDO含量Fig.1 Western blot analysis of the level of IDO

3討論

機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)、情緒調(diào)控、覺醒的維持主要由下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA)軸、交感與副交感神經(jīng)及5-羥色胺(5-HT)調(diào)節(jié)系統(tǒng)控制[7]。強(qiáng)烈的機(jī)體應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞因子分泌異常增加，應(yīng)激源刺激機(jī)體下丘腦-垂體-腎上腺軸興奮性升高。一般狀態(tài)下，適度的皮質(zhì)醇分泌能減輕炎性細(xì)胞因子對機(jī)體過度損傷。而PTSD患者后期由于HPA軸功能紊亂，使皮質(zhì)醇功能低下導(dǎo)致缺乏足夠的應(yīng)激適應(yīng)，造成不可逆的細(xì)胞及功能損傷[8]。檢測結(jié)果表明PTSD患者血清中INF-γ、TNF-α、IL-6表達(dá)增加，而早期的研究表明細(xì)胞因子中的INF-γ、TNF-α、IL-6可由主動轉(zhuǎn)運(yùn)通過跨膜蛋白進(jìn)入腦組織，作為啟動顱內(nèi)炎癥反應(yīng)的重要致炎性細(xì)胞因子，INF-γ、TNF-α、IL-6可能在PTSD發(fā)病機(jī)制中扮演了重要角色。有研究表明[9-10]，抑郁癥患者血清中IL-6含量與臨床表現(xiàn)呈正相關(guān)，現(xiàn)已把IL-6檢測作為抑郁癥的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中PTSD患者的INF-γ、TNF-α、IL-6表達(dá)增高，推測PTSD發(fā)病與炎性應(yīng)答免疫系統(tǒng)的激活有關(guān)，是一種心理神經(jīng)免疫紊亂性疾病。外周的免疫系統(tǒng)通過激活并釋放前炎性細(xì)胞因子，導(dǎo)致腦部繼發(fā)性損傷及與PTSD相關(guān)的神經(jīng)內(nèi)分泌、神經(jīng)生化和行為改變[11-12]。

IDO在外周組織的炎性應(yīng)答中可被多種細(xì)胞因子激活。本實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果表明PTSD患者血清中INF-γ、TNF-α、IL-6升高的同時(shí)伴有IDO表達(dá)增加。研究發(fā)現(xiàn)IDO在抑郁患者的大腦前額葉、海馬及紋狀體等區(qū)域表達(dá)異常，PTSD的腦部病理改變也主要涉及這些腦區(qū)[13-14]，推測IDO可能與PTSD的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。研究表明[15-18]IDO在腦組織內(nèi)表達(dá)與炎性活動有關(guān)，與本研究結(jié)果相一致。提示IDO是許多急性和慢性神經(jīng)退行性病變的重要致病因素。IDO表達(dá)增加導(dǎo)致PTSD患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)中5-HT能神經(jīng)遞質(zhì)功能下降及炎性因子進(jìn)一步釋放。IDO和其后繼酶-犬尿酸單加氧酶在細(xì)胞因子作用下活性增強(qiáng)，從而使喹啉酸合成激動劑：喹啉酸-谷氨酸能N-甲基天冬氨酸受體表達(dá)增多，喹啉酸在多種急慢性神經(jīng)變性性疾病中為重要的神經(jīng)毒性物質(zhì)。應(yīng)激的組織及細(xì)胞中，由于細(xì)胞因子分泌增多，引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生后續(xù)的損傷。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，PTSD患者血清INF-γ、TNF-α、IL-6及IDO水平升高，提示細(xì)胞因子、IDO系統(tǒng)及炎癥反應(yīng)在PTSD的發(fā)病過程中可能扮演了重要的角色。另外，還有研究證明[17]，PTSD大鼠海馬內(nèi)INF-γ、TNF-α、IL-6及IDO增加，早期給予選擇性IDO抑制劑(新型惡二唑基-N-羥基苯甲脒)可改變海馬內(nèi)增加的前炎性因子水平及五羥色胺水平。因此IDO抑制劑可能是PTSD新的治療手段。

參考文獻(xiàn)

[1]North C S，Pfefferbaum B，Kawasaki A，et al.Psychosocial adjustment of directly exposed survivors 7 years after the Oklahoma City bombing[J].Compr Psychiatry， 2011，52(1)：1-8.

[2]Petersen T，Elklit A，Olesen J G.Victimization and PTSD in a Faroese youth total-population sample[J].Scand J Psychol，2010，51(1)：56-62.

[3]Smith A K，Conneely K N，Kilaru V，et al.Differential immune system DNA methylation and cytokine regulation in post-traumatic stress disorder[J].Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet，2011，156B(6)：700-708.

[4]Hayley S，Poulter M O，Merali Z，et al.The pathogenesis of clinical depression：stressor-and cytokine-induced alterations of neuroplasticity[J].Neuroscience，2005，135(3)：659-678.

[5]Gola H，Engler H，Sommershof A，et al.Posttraumatic stress disorder is associated with an enhanced spontaneous production of pro-inflammatory cytokines by peripheral blood mononuclear cells[J].BMC Psychiatry，2013，29(9)：13-40.

[6]胡群亮，劉曉智，劉振林，等.環(huán)氧化酶-2在創(chuàng)傷腦組織中的定位與定量表達(dá)規(guī)律研究[J].中華神經(jīng)外科疾病研究雜志，2009，8(2)：109-112.

[7]Babson K A，F(xiàn)eldner M T.Temporal relations between sleepproblems and both traumatic event exposure and PTSD：a critical review of the empirical literature[J].J Anxiety Disord，2010，1(24)：11-15.

[8]Boals A，Hathaway L M.The importance of the DSM-Ⅳ E and F criteria in self-report assessments of PTSD[J].J Anxiety Disord，2010，1(24)：161-166.

[9]Bailey J N，Goenjian A K，Noble E P，et al.PTSD and dopaminergic genes，DRD2 and DAT，in multigenerational families exposed to the spitak earthquake[J].Psych Res，2010，3(178)：507-510.

[10]Carpenter L L，Gawuga C E，Tyrka A R，et al.Association between plasma IL-6 response to acute stress and early-life adversity in healthy adults[J].Neuropsychopharmacology，2010，35(13)：2617-2623.

[11]Wilson C B，McLaughlin L D，Nair A，et al.Inflammation and oxidative stress are elevated in the brain，blood，and adrenal glands during the progression of post-traumatic stress disorder in a predator exposure animal model[J].PLoS One，2013，8(10)：e76146.

[12]Sublette M E，Postolache T T.Neuroinflammation and depression：The role of indoleamine 2，3-dioxygenase(IDO)as a molecular pathway[J].Psychosom Med，2012，74(7)：668-672.

[13]穆允鳳，印弘，齊順，等.急性創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙患者腦結(jié)構(gòu)的磁共振研究[J].中華神經(jīng)外科疾病研究雜志，2011，10(1)：20-24。

[14]Golub Y，Kaltwasser S F，Mauch C P，et al.Reduced hippocampus volume in the mouse model of posttraumatic stress disorder[J].J Psychiatr Res，2011，45(5)：650-659.

[15]陳清泉，房光萃，曾彧，等.自身免疫性心肌炎中Th17/Treg細(xì)胞及其相關(guān)因子的動態(tài)變化[J].中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2015，24(4)：322-326.

[16]Müller N，Schwarz M J.The immune-mediated alteration of serotonin and glutamate：towards an integrated view of depression[J].Mol Psychiatry，2007，12(11)：988-1000.

[17]O’Connor J C，Lawson M A，André C，et al.Lipopolysaccharide-induced depressive-like behavior is mediated by indoleamine 2，3-dioxygenase activation in mice[J].Mol Psychiatry，2009，14(5)：511-522.

[18]陳柏齡.選擇性COX-2抑制劑對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J].海峽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2011，17(5)：43-45.

(2015-07-26收稿)

Expression of Indoleamine 2，3-Dioxygenase and Cytokines in Patients with Post-traumatic Stress Disorder

Yin Li1，Huang Shanshan2，He Zhuqiang3△

1DepartmentofObstetricsandGynecology，2DepartmentofNeurology，TongjiHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China，3DepartmentofNeurosurgery，WuhanFirstHospital，Wuhan430022，China

AbstractObjectiveTo investigate the expression levels of interferon-γ(INF-γ)，tumor necrosis factor-α(TNF-α)，interleukin-6(IL-6)and indoleamine 2，3-dioxygenase(IDO)in the serum of patients with post-traumatic stress disorder(PTSD)and the clinical significance.MethodsSerum samples were collected from 80 PTSD patients and 80 healthy individuals.The serum concentrations of INF-γ，TNF-α，IL-6 and IDO were detected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)and Western blot in both groups.ResultsThe concentrations of INF-γ，TNF-α，IL-6 and IDO were(28.43±11.23)pg/mL，(14.58±2.16)pg/mL，(16.34±5.31)pg/mL and (0.223 5±0.061 1)，respectively，in PTSD group，significantly higher than those[(3.01±1.12)pg/mL，(2.45±0.90)pg/mL，(2.01±1.08)pg/mL and(0.031 2±0.001 6)]in control group(P<0.01).ConclusionOverexpression of INF-γ，TNF-α，IL-6 and IDO may play an important role in the pathogenesis of PTSD.

Key wordspost-traumatic stress disorder；indoleamine 2，3-dioxygenase；cytokine

中圖分類號：R329.2

DOI：10.3870/j.issn.1672-0741.2016.01.024

通訊作者△，Corresponding author，E-mail：colei@sina.com

*湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.2015CFB694)

殷莉，女，1978年生，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，E-mail：yinli@mails.tjmu.edu.cn